專利名稱：分枝桿菌抗原組合物的制作方法
分枝桿菌抗原組合物本發(fā)明涉及分枝桿菌多核苷酸和多肽，涉及其片段或變體，涉及其抑制劑，涉及與其結合的抗體，涉及載體和微生物載體，涉及治療性組合物如針對分枝桿菌感染的疫苗，并且涉及用于檢測分枝桿菌感染的存在的組合物和方法。微生物如沙門氏菌屬(Salmonella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、志賀氏菌屬(Shigella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、衣原體屬(Chlamydia)和分枝桿菌屬(Mycobacteria)的物種能 夠形成胞內(nèi)感染。這些感染可能是絕對胞內(nèi)的，或可能包含胞內(nèi)成分和胞外成分二者。通常，這些微生物不能在體內(nèi)例如在血流中自由循環(huán)，并且因此通常對藥物治療方案沒有響應。多藥耐藥性微生物的發(fā)展加劇了與治療胞內(nèi)感染相關的困難。由于突變隨時間積累以及后續(xù)的突變基因向其他生物體的水平和垂直的轉(zhuǎn)移，整個種類的抗生素已經(jīng)失去活性。由于類似的原因，已不能證明疫苗治療是對胞內(nèi)微生物有效的。結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) (MTB)和緊密相關的物種組成一小組已知為結核分枝桿菌復合體(Mycobacterium tuberculosiscomplex, MTC)的分枝桿菌。該組包括五種不同的物種結核分枝桿菌(M. tuberculosis),田鼠分枝桿菌(M. microti),牛分枝桿菌(M. bovis), M. caneti和非洲分枝桿菌(M. africanum)。其他分枝桿菌在人類和動物中也是致病性的，例如，鳥分枝桿菌副結核亞種(M. avium subsp. paratuberculosis),其在反會動物中引起約尼病(Johne' s disease),牛分枝桿菌，其在牛中引起結核病(tuberculosis),鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)，其在免疫受損的患者(例如，AIDS患者、和骨髓移植患者)中引起結核病，以及麻風分枝桿菌(M. leprae),其在人類中引起麻風病(leprosy)。另一種重要的分枝桿菌物種是母牛分枝桿菌(M. vaccae)。作為結核病感染(TB)的發(fā)病原因，結核分枝桿菌(M. tuberculosis)在世界范圍內(nèi)是細菌感染疾病引起的死亡的主要原因一一潛在的感染影響多至世界人口的三分之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計每年全世界發(fā)生近九百萬例TB新病例，近兩百萬例死亡。2005年，最大數(shù)量的TB新病例發(fā)生在東南亞(占全球發(fā)病病例的34% )，估計在撒哈拉以南非洲地區(qū)(sub-Saharan Africa)的發(fā)病率為每100，000人口近350例。然而，TB感染不限于發(fā)展中國家自二十世紀八十年代末期以來，英國觀察到結核病的復現(xiàn)，并且目前每年有超過8000例新病例——比率為每100，000人口 14. O例。這些新病例中有大約40%發(fā)生在倫敦地區(qū)，在倫敦地區(qū)感染率為每100，000人口 44. 8例。最佳的患者管理需要盡可能早地開始藥物治療并且分離感染的個體。不進行治療的話，每名患有活動期TB病的個體平均每年傳染10-15人。TB感染通?？梢酝ㄟ^6個月療程的抗生素進行治療；然而，患者對長期藥物治療的依從性是變化的，有的患者經(jīng)常在他們的癥狀停止時就停止治療。不能完成治療可能促進多藥耐藥性分枝桿菌的發(fā)展。術語“潛伏期”與“持久性”同義，并且描述一種低代謝活性的可逆狀態(tài)，在這種狀態(tài)中，分枝桿菌細胞可以以有限的細胞分裂或沒有細胞分裂存活延長的時間期間。在潛伏期(即，潛伏的感染)期間，與分枝桿菌感染相關的臨床癥狀沒有變得明顯。
然而，環(huán)境刺激一例如，營養(yǎng)可用性和/或局部溶解的氧濃度的增加，可以誘導潛伏分枝桿菌的再激活。在活動性感染過程中，分枝桿菌(例如，結核分枝桿菌)表現(xiàn)出高代謝活性并且快速復制，導致帶有相關臨床癥狀的活動性分枝桿菌感染的發(fā)展。體外研究已經(jīng)表明分枝桿菌如結核分枝桿菌能夠適應并且在營養(yǎng)貧瘠和氧氣貧瘠的條件下存活，并且可以在一定范圍的營養(yǎng)可用性和氧張力下生長。在體外適應碳饑餓和/或低溶解氧張力促進向可能與體內(nèi)潛伏類似的非復制持續(xù)狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。懷疑分枝桿菌的胞內(nèi)存活和繁殖是分枝桿菌疾病進展的主要支持因素。存在大量潛伏感染分枝桿菌的無癥狀的個體是控制分枝桿菌感染的主要問題，尤其是控制結核分枝桿菌感染的主要問題。另外，通過皮膚檢測來檢測潛伏分枝桿菌感染的常規(guī)方法可能受到BCG疫苗接種和暴露于環(huán)境分枝桿菌的損害。針對結核分枝桿菌的疫苗預防的有效性已經(jīng)廣泛變化。目前的結核分枝桿菌疫苗，BCG，是牛分枝桿菌的減毒毒株。其針對兒童中嚴重的TB并發(fā)癥是有效的，但是其效力在成年人中、特別是在種族之間有很大不同。BCG疫苗接種已經(jīng)用來預防結核性腦膜炎·(tuberculous meningitis),并且?guī)椭乐菇Y核分枝桿菌向肺外部位的擴散,但是不能預防感染。BCG的有限功效和TB的全球流行性已經(jīng)引起產(chǎn)生新的更有效的疫苗的國際性的嘗試。WO 03/004520(以本申請人的名義，通過引用結合于此)描述了不同亞組的分枝桿菌基因的鑒定，這些基因的表達在分枝桿菌潛伏期過程中被誘導或上調(diào)。具體地，與不是營養(yǎng)-不足(nutrient-starving)并且支持所述分枝桿菌的指數(shù)生長的培養(yǎng)條件相比較，在營養(yǎng)-不足培養(yǎng)條件下，在分枝桿菌培養(yǎng)過程中，這一確定的亞組的分枝桿菌基因的表達被誘導或上調(diào)。WO 03/035681(以本申請人的名義，通過引用結合于此)描述了不同亞組的分枝桿菌基因的鑒定，這些基因的表達在分枝桿菌潛伏期過程中被下調(diào)。具體地，與不是營養(yǎng)-不足并且支持所述分枝桿菌的指數(shù)生長的培養(yǎng)條件相比較，在營養(yǎng)-不足培養(yǎng)條件下，這一確定的亞組的分枝桿菌基因的表達被下調(diào)。WO 03/000721(以本申請人的名義，通過引用結合于此)描述了不同亞組的分枝桿菌基因的鑒定，與在37°C測量至少40%空氣飽和的溶解氧張力相比較，這些基因的表達在由低溶解氧張力(在37°C測量至多10%空氣飽和)限定的生長條件下連續(xù)培養(yǎng)分枝桿菌的過程中被誘導或上調(diào)?？紤]到分枝桿菌感染的日益增加的威脅和全球流行性，需要新的策略來更有效的預防、治療和診斷分枝桿菌感染。本發(fā)明提供一種抗原組合物，所述抗原組合物包含第一分枝桿菌抗原和第二分枝桿菌抗原；其中所述第一分枝桿菌抗原包含⑴與選自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潛伏期-調(diào)節(jié)多肽的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；或(ii)編碼(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或與選自SEQ ID NOs :2,4,6,8和57的潛伏期-調(diào)節(jié)多核苷酸的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列，或具有其至少21個連續(xù)的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝桿菌抗原不同于所述第一分枝桿菌抗原。當用于本文時，術語“分枝桿菌的”或“分枝桿菌”包括下述物種草分枝桿菌(M. phlei),恥垢分枝桿菌(M. smegmatis),非洲分枝桿菌(M. africanum), M. caneti,偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuitum),瘰疬分枝桿菌(M. marinum),潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans),結核分枝桿菌(M. tuberculosis),牛分枝桿菌(M. bovis),田鼠分枝桿菌(M. microti),鳥分枝桿菌(M. avium)，副結核分枝桿菌(M. paratuberculosis)，麻風分枝桿菌(M. leprae)，鼠麻風分枝桿菌(M. Iepraemurium),胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare),瘰疬分枝桿菌(M. scrofulaceum),膽分枝桿菌(M. xenopi),日內(nèi)瓦分枝桿菌(M. genavense),堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)，猿分枝桿菌(M. simiae),斯氏分枝桿菌(M. szulgai),嗜血分枝桿菌(M. haemophilum),亞洲分枝桿菌(M. asiaticum),瑪爾摩分枝桿菌(M. malmoense),母牛分枝桿菌(M. vaccae), M. caneti和石氏分枝桿菌(M. shimoidei)。其中特別感興趣的是MTC的成員，如結核分枝桿菌。術語抗原意指可以被免疫系統(tǒng)識別和/或刺激免疫應答的任意物質(zhì)。例如，抗原可以刺激細胞介導的免疫應答和/或可以刺激抗體的產(chǎn)生。 在一個實施方案中，本發(fā)明的分枝桿菌抗原提供涉及免疫細胞如T細胞(CD4+和/或CD8+T細胞)的針對感染的細胞介導的應答和/或用Thl-型細胞因子如IFN- Y應答的能力。在一個實施方案中，分枝桿菌抗原誘導IFN-Y-分泌細胞(例如，主要是CD4+T細胞)。在這一點上，最近的研究表明免疫細胞應答(例如，特別是在肺黏膜中的T細胞免疫應答)對于針對肺分枝桿菌疾病的保護可能是關鍵的。在一個實施方案中，本發(fā)明的分枝桿菌抗原提供針對分枝桿菌(如結核分枝桿菌)攻擊的保護(如長期的保護)。例如，本發(fā)明的分枝桿菌抗原可以誘導“記憶T細胞”，其可以長期(例如，數(shù)十年)持續(xù)刺激保護性免疫。記憶免疫應答已經(jīng)歸因于長期存在的(long-lived)抗原特異性T淋巴細胞的再激活，所述T淋巴細胞直接由分化的效應T細胞產(chǎn)生并且以靜息狀態(tài)繼續(xù)存在。記憶T細胞是異質(zhì)的；已經(jīng)鑒定了至少兩個亞組，它們具有不同的遷移能力和效應子功能。第一亞組的記憶T細胞稱為‘效應子記憶T細胞’(TEM)，因為它們與在初次應答中產(chǎn)生的效應T細胞相似，在初次應答中，它們?nèi)鄙儆糜谶w移到發(fā)炎組織中的淋巴結歸巢受體(lymph node-homing receptors)。當再遇到抗原時，TEM迅速產(chǎn)生IFN-Y或IL-4,或釋放預先存儲的穿孔蛋白。第二亞組的記憶T細胞(稱為‘中心記憶細胞(central memorycells) ’ (TCM))表達L-選擇蛋白和CCR7，并且缺少即時效應子功能。TCM具有低激活閾值并且當在次級淋巴器官中被再次刺激時增殖并且分化成效應子。在一個實施方案中，分枝桿菌抗原提供針對分枝桿菌(例如結核分枝桿菌)感染的中和抗體應答。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗原組合物中的每種抗原獨立的誘導有效的免疫應答(例如，細胞介導的免疫應答或抗體應答)。因此，按照這一實施方案，在向受試者施用所述抗原組合物后，在所述受試者中誘導針對所述抗原組合物中的每種抗原的免疫應答。在這一點上，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了(在一個實施方案中)與關于已知的多價疫苗組合物可能預見到的競爭效應相比較，本發(fā)明的抗原組合物有利地避免“抗原競爭”，或與低水平的“抗原競爭”相關。
“抗原競爭”是這樣的一種現(xiàn)象，即，通過這種現(xiàn)象，針對一種抗原的免疫應答抑制針對第二種不相關的抗原的免疫應答(參見，Eidinger，D.等，J Exp Med, 1968. 128(5):第1183-1200頁)。例如，響應一種抗原的免疫細胞(例如，T細胞)可能積極地干擾響應另一種抗原的其他免疫細胞(例如，T細胞)(參見，Kerbel, R. S.和Eidinger, D. , Nat NewBiol, 1971. 232 (27):第 26-28 頁)。WO 00/47227描述了(在實施例2中)用編碼單獨的分枝桿菌抗原85A的DNA免疫豚鼠(組A);或用編碼分枝桿菌抗原85A和分枝桿菌抗原MPT32 二者的DNA免疫豚鼠(組B)。在用結核分枝桿菌攻擊后，通過確定肺和脾中的分枝桿菌負荷評估疫苗功效。圖IlA和IlB舉例說明抗原85A和MPT32的組合(組B)沒有單獨的抗原85A(組A)對結核分枝桿菌有效。因此，已知將有效的疫苗候選物匯集成多價疫苗抑制或甚至競爭性消除疫苗的功效。由于抗原競爭的普遍性，所以認為獲得高于其最有效成分的提高的功效的多價疫苗是有益的。
因此，令人驚訝的是，本發(fā)明的抗原組合物組合單獨能夠引發(fā)免疫應答的抗原并且與針對每種單獨的抗原的免疫應答相比較產(chǎn)生提高的/增強的免疫應答。在一個實施方案中，分枝桿菌抗原包含多肽序列。分枝桿菌抗原可以是多肽。備選地，或另外，分枝桿菌抗原包含多核苷酸序列。例如，分枝桿菌抗原可以是多核苷酸，如DNA或 RNA。第一分枝桿菌抗原包含(i)與選自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潛伏期-調(diào)節(jié)多肽的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；或(ii)編碼(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或與選自SEQ ID NOs :2,4,6,8和57的潛伏期-調(diào)節(jié)多核苷酸的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列，或具有其至少21個連續(xù)的核苷酸的其片段。在一個實施方案中，第一分枝桿菌抗原包含(i)與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；或(ii)編碼⑴所述的多肽序列的多核苷酸序列；或與SEQ ID NO 2的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列，或具有其至少21個連續(xù)的核苷酸的其片段。由SEQ ID NOs :1，3，5，7和56所示的特定亞組的分枝桿菌多肽是‘潛伏期_調(diào)節(jié)多肽’。由SEQ ID NOs :2,4,6,8和57所示的特定亞組的分枝桿菌多核苷酸是‘潛伏期_調(diào)節(jié)多核苷酸’。在一個實施方案中，‘潛伏期-調(diào)節(jié)多肽’由‘潛伏期-調(diào)節(jié)多核苷酸’編碼。例如，潛伏期-調(diào)節(jié)多肽SEQ ID NO: I由潛伏期-調(diào)節(jié)多核苷酸SEQID NO :2編碼；SEQ ID NO:3 由 SEQ ID NO 4 編碼；SEQ ID NO 5 由 SEQ ID NO 6 編碼；SEQ ID NO 7 由 SEQ ID NO 8編碼；并且 SEQ ID NO :56 由 SEQ ID NO 57 編碼。潛伏期-調(diào)節(jié)多肽或多核苷酸的表達或活性響應分枝桿菌的潛伏期進行調(diào)節(jié)一一例如，響應在誘導或維持分枝桿菌潛伏期的培養(yǎng)條件下的分枝桿菌(例如，結核分枝桿菌)的培養(yǎng)物進行調(diào)節(jié)。在一個實施方案中，響應分枝桿菌潛伏期的條件“調(diào)節(jié)”潛伏期-調(diào)節(jié)多肽或多核苷酸的表達或活性意指響應潛伏期誘導或上調(diào)所述表達或活性。因此，潛伏期-調(diào)節(jié)多肽或多核苷酸可以是‘潛伏期-誘導的’或‘潛伏期-上調(diào)的’多肽或多核苷酸。例如，與非潛伏期條件相比較，在潛伏期條件下，潛伏期-上調(diào)的多肽或多核苷酸的表達或活性可以上調(diào)至少I. 5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、20-倍或50-倍。
在分枝桿菌的天然環(huán)境中，在潛伏期過程中，在體內(nèi)可以誘導或上調(diào)潛伏期-誘導和潛伏期-上調(diào)的多肽和多核苷酸的表達或活性。因此，潛伏期-誘導的或潛伏期-上調(diào)的分枝桿菌多肽和多核苷酸代表用于預防疾病的建立、擴散和再激活的良好的疫苗候選物和良好的治療靶標和/或產(chǎn)生用于潛伏性感染的良好的診斷工具。在一個實施方案中，響應分枝桿菌潛伏期的條件“調(diào)節(jié)”潛伏期-調(diào)節(jié)多肽的表達或活性意指響應潛伏期抑制或下調(diào)所述表達或活性。因此，在一個實施方案中，潛伏期-調(diào)節(jié)多肽或多核苷酸是‘潛伏期-抑制的’或‘潛伏期-下調(diào)的’多肽或多核苷酸。與非潛伏期條件相比較，潛伏期-下調(diào)的多肽或多核苷酸的表達或活性可以下調(diào)至少I. 5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、20-倍或50-倍。引用“下調(diào)”包括“阻斷”，意指基本上沒有可檢測到的多肽或多核苷酸的活性和/或表達。在活動性分枝桿菌感染過程中，或在分枝桿菌由潛伏狀態(tài)再激活的過程中/之后，在體內(nèi)可以誘導或下調(diào)潛伏期-抑制的或潛伏期-下調(diào)的多肽和多核苷酸的表達或活性。潛伏期-抑制的和潛伏期-下調(diào)的分枝桿菌多肽和多核苷酸可能在疾病的活動期過程中發(fā)展針對復制的桿菌的有效免疫應答中起早期作用，并且因此代表用于預防疾病的建立、擴散和再激活的良好的疫苗候選物和良好的治療靶標。與不是營養(yǎng)不足的培養(yǎng)條件相比較，在營養(yǎng)-不足的培養(yǎng)條件下可以調(diào)節(jié)(如誘導、上調(diào)、抑制或下調(diào))潛伏期-調(diào)節(jié)多肽或多核苷酸的表達或活性。在營養(yǎng)不足的培養(yǎng)條件下，初始能源(primary energy source)(例如碳)的濃度不足以支持分枝桿菌的指數(shù)生長，結果分枝桿菌在代謝上受到脅迫并且進入潛伏狀態(tài)。與不是限氧的培養(yǎng)條件相比較，在限氧(低溶解氧張力)條件下，可以備選地(或另外地)調(diào)節(jié)(如誘導、上調(diào)、抑制或下調(diào))潛伏期-調(diào)節(jié)多肽或多核苷酸的表達或活性。在一個實施方案中，第一分枝桿菌抗原包含與選自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潛伏期-調(diào)節(jié)多肽的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84,86,88,90,92,94,96,98,99或100%的氨基酸序列同一性)的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段。在一個實施方案中，第一分枝桿菌抗原由與選自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潛伏期-調(diào)節(jié)多肽的氨基酸序列具有至少70 %的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100%的氨基酸序列同一性)的多肽序列組成，或由具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段組成。因此,在一個實施方案中，第一分枝桿菌抗原是如上文定義的‘第一分枝桿菌多肽’(或片段)。在一個實施方案中，所述第一分枝桿菌抗原多肽包含(或由下述組成)與SEQ IDNO 1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段。SEQ ID NOs :1，3，5，7 和 56 在下表 I 中定義表I
因此，在本申請的上下文中，“RvOlll多肽抗原”包含SEQ ID N0:1(或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)或由SEQ ID N01(或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)組成；“Rvl806多肽抗原”包含SEQ ID NO :3 (或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)或由SEQ IDNO :3(或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)組成；“Rv0198多肽抗原”包含SEQ ID NO :5(或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)或由SEQ ID NO :5(或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)組成；“Rv3812多肽抗原”包含SEQ ID NO :7(或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)或由SEQ ID NO :7(或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)組成；并且，“RV1807多肽抗原”包含SEQ ID NO :56 (或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)或由SEQ ID NO :56(或如本文定義的其序列‘變體’或‘片段’)組成。在一個實施方案中，氨基酸序列同一性存在于長度為至少7個連續(xù)的氨基酸殘基(例如，長度為至少 10，15，25，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600 或650個連續(xù)的氨基酸殘基)的多肽序列的區(qū)域。 用于確定氨基酸序列同一性的常規(guī)方法在本說明書下文中更詳細地討論。在第一分枝桿菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述組成)所述多肽的至少7個連續(xù)的氨基酸殘基(例如，所述多肽的至少10，15，25，50，75，100，125，150，175，200，225,250,275,300,325,350,375,400,425,450,475,500,525,550,575,600,625,650 或 675
個連續(xù)的氨基酸殘基)。在一個實施方案中，多肽的片段具有的序列長度是全長多肽的序列長度的至少5%，10%，25%，50%，60%，70%，80%，或 90%。多肽的片段可以包含所述多肽的至少一個表位。在一個實施方案中，在第一分枝桿菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述組成)所述多肽的截短形式。例如，多肽的片段可以具有N-端截短(與所述多肽比較)，或多肽的片段可以具有C-端截短(與所述多肽比較)。在一個實施方案中，在第一分枝桿菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述組成)所述多肽的成熟形式。例如，多肽可以包含信號序列(即，分泌/靶向序列)(例如，在N-端)，并且多肽的片段可以缺少這一信號序列。在一個實施方案中，片段可以通過從所述多肽切割信號序列而形成。在一個實施方案中，多肽SEQ ID NO : I的片段是SEQ ID NO : I的N-端截短形式。在一個實施方案中，與SEQ ID NO: I的氨基酸序列相比較，多肽SEQ ID NO: I的片段具有至少50，100，150，200，250，300，或350個氨基酸殘基的N-端截短。在一個實施方案中，SEQID NO : I的片段至少包含SEQ ID NO :1的C-端50，100，150，200，250或300個氨基酸的序列。在一個實施方案中，多肽SEQ ID NO :7的片段是SEQ ID NO :7的N-端截短形式。在一個實施方案中，SEQ ID NO :7的片段是成熟的多肽序列，其與SEQ ID NO :7的序列的不同在于去除了 N-端信號序列。在一個實施方案中，與SEQ ID NO :7的氨基酸序列相比較，多肽SEQ ID N0:7的片段具有至少5，10，15，20，25，30，35或40個氨基酸殘基的N-端截短。在一個實施方案中，SEQ ID NO :7的片段至少包含SEQ ID NO :7的C-端50，100，150，200，250，300，350，400或450個氨基酸的序列。·
在一個實施方案中，第一分枝桿菌抗原包含與選自SEQ ID NOs :1，3, 5, 7和56的潛伏期-調(diào)節(jié)多肽具有共同的抗原交叉反應性和/或基本上相同的體內(nèi)生物活性的多肽或其片段。當用于此處時，‘共同的抗原交叉反應性’意指第一分枝桿菌多肽或片段與選自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潛伏期-調(diào)節(jié)多肽共有共同的誘導先前暴露于分枝桿菌感染的抗原成分的免疫細胞如T-淋巴細胞(例如，⑶4+，⑶8+，效應T細胞或記憶T細胞如TEM或TCM)的“回憶應答”的能力。在最近的10年間已經(jīng)建立了用于測量和定量免疫細胞應答(例如，T細胞應答)的新的免疫學測定法。例如，干擾素-Y (IFN-Y)ELISPOT測定法可用作免疫學讀取，原因在于抗原-特異性免疫細胞如T細胞的IFN- Y分泌與針對結核分枝桿菌的保護良好相關。此外，ELISP0T測定法是一種定量分泌IFN- Y的抗原-特異性免疫細胞如T細胞的數(shù)目的非常可重現(xiàn)和靈敏的方法。備選地，或另外，‘共同的抗原交叉反應性’意指能夠結合第一分枝桿菌多肽或片段的抗體也能夠結合潛伏期-調(diào)節(jié)多肽。在一個實施方案中，第一分枝桿菌抗原包含編碼如上述定義的第一分枝桿菌多肽的多核苷酸序列，或由編碼如上述定義的第一分枝桿菌多肽的多核苷酸序列組成。因此,在一個實施方案中,第一分枝桿菌抗原包含(或由下述組成)編碼這樣的多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含(或由下述組成)與選自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潛伏期-調(diào)節(jié)多肽的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100%的氨基酸序列同一性)的氨基酸序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段(例如，如上述定義)。在一個實施方案中，第一分枝桿菌抗原包含與選自SEQ ID NOs :2，4，6，8和57的潛伏期-調(diào)節(jié)多核苷酸的核酸序列具有至少70 %的核苷酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100 %的核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或具有其至少21個連續(xù)的核苷酸的其片段。在一個實施方案中，第一分枝桿菌抗原由下述組成與選自SEQ IDNOs :2,4,6,8和57的潛伏期-調(diào)節(jié)多核苷酸的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100 %的核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或具有其至少21個連續(xù)的核苷酸的其片段。因此,在一個實施方案中,第一分枝桿菌抗原是如上述定義的‘第一分枝桿菌多核苷酸’(或片段)。在一個實施方案中，所述第一分枝桿菌多核苷酸包含(或由下述組成)如上述定義的編碼本發(fā)明的第一分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列。在一個實施方案中，所述第一分枝桿菌多核苷酸包含(或由下述組成)與SEQID NO 2的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21個連續(xù)的核苷酸的其片段。SEQ ID NOs :2，4，6，8 和 57 在下表 2 中定義表 權利要求
1.抗原組合物，所述抗原組合物包含 (i)第一分枝桿菌抗原多肽，其中所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；或 (ii)第一分枝桿菌多核苷酸，其中所述第一分枝桿菌多核苷酸包含編碼所述第一分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列； 并且還包含 (iii)第二分枝桿菌抗原多肽，其中所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID NO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；或 (iv)第二分枝桿菌多核苷酸，其中所述第二分枝桿菌多核苷酸包含編碼所述第二分枝桿菌多肽的多核苷酸序列。
2.根據(jù)權利要求I所述的抗原組合物，其中所述第一分枝桿菌多核苷酸包含與SEQIDNO 2的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21個連續(xù)的核苷酸的其片段。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的抗原組合物，其中所述第二分枝桿菌多核苷酸包含與SEQID NO 6的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列,或具有其至少21個連續(xù)的核苷酸的其片段。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的抗原組合物，所述抗原組合物還包含至少一種另外的分枝桿菌抗原多肽，所述另外的分枝桿菌抗原多肽不同于所述第一分枝桿菌抗原多肽和/或所述第二分枝桿菌抗原多肽；或還包含至少一種另外的分枝桿菌多核苷酸，所述另外的分枝桿菌多核苷酸不同于所述第一分枝桿菌多核苷酸和/或所述第二分枝桿菌多核苷酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的抗原組合物，其中所述至少一種另外的分枝桿菌抗原多肽包含與選自SEQ ID NOs :3，7，9-20，34-44或56的任一種的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段。
6.根據(jù)權利要求4所述的抗原組合物，其中所述至少一種另外的分枝桿菌多核苷酸包含編碼如權利要求5定義的多肽序列的多核苷酸序列；諸如與選自SEQ ID NOs 4,8,21-32,45-55或57的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列,或具有其至少21個連續(xù)的核苷酸的其片段。
7.根據(jù)前述權利要求任一項所述的抗原組合物，其中所述抗原組合物包含至少一種載體；其中所述載體包含至少一種所述分枝桿菌多核苷酸。
8.根據(jù)權利要求7所述的抗原組合物,其中所述載體包含所述第一分枝桿菌多核苷酸和所述第二分枝桿菌多核苷酸。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的抗原組合物，其中所述載體是表達載體，或病毒載體，如減毒的痘苗病毒(vaccinia virus)載體或腺病毒載體。
10.根據(jù)前述權利要求任一項所述的抗原組合物，其中所述抗原組合物包含至少一種細胞，并且其中所述細胞包含所述分枝桿菌抗原多肽和/或分枝桿菌多核苷酸中的至少一種；如其中所述細胞是減毒的微生物載體，如減毒的沙門氏菌(salmonella)、減毒的牛分枝桿菌(M. bovis)(例如，BCG菌株)或減毒的結核分枝桿菌(M. tuberculosis)。
11.免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含第一抗體和第二抗體，其中所述第一抗體結合第一分枝桿菌抗原多肽，并且所述第二抗體結合第二分枝桿菌抗原多肽； 其中所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段； 并且其中所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段。
12.用于制備治療性或預防性制劑(例如，疫苗)的方法，所述方法包括組合藥用載體與 (i)第一分枝桿菌抗原多肽，其中所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；或 (ii)第一分枝桿菌多核苷酸，其中所述第一分枝桿菌多核苷酸包含編碼所述第一分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列； 并且與(iii)或(iv)組合 (iii)第二分枝桿菌抗原多肽，其中所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID NO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；或 (iv)第二分枝桿菌多核苷酸，其中所述第二分枝桿菌多核苷酸包含編碼所述第二分枝桿菌多肽的多核苷酸序列。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，所述方法包括將所述藥用載體與權利要求1-10中任一項所述的抗原組合物組合。
14.用于制備治療性或預防性制劑(例如，疫苗)的方法，所述方法包括將藥用載體與第一抗體和第二抗體組合； 其中所述第一抗體結合第一分枝桿菌抗原多肽，其中所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO :I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；并且 其中所述第二抗體結合第二分枝桿菌抗原多肽，其中所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，所述方法包括將所述藥用載體與根據(jù)權利要求11所述的免疫原性組合物組合。
16.治療性或預防性制劑(例如，疫苗)，所述制劑包含藥用載體和 (i)第一分枝桿菌抗原多肽，其中所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；或 (ii)第一分枝桿菌多核苷酸，其中所述第一分枝桿菌多核苷酸包含編碼所述第一分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列； 以及(iii)第二分枝桿菌抗原多肽，其中所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID NO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；或 (iv)第二分枝桿菌多核苷酸，其中所述第二分枝桿菌多核苷酸包含編碼所述第二分枝桿菌多肽的多核苷酸序列； 其中所述制劑用于所述第一分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸和所述第二分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸的同時施用或順次施用。
17.根據(jù)權利要求16所述的制劑，所述制劑包含根據(jù)權利要求1-10中任一項所述的抗原組合物。
18.治療性或預防性制劑(例如，疫苗)，所述制劑包含藥用載體和 (a)第一抗體，其中所述第一抗體結合第一分枝桿菌抗原多肽；其中所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；和 (b)第二抗體，其中所述第二抗體結合第二分枝桿菌抗原多肽；其中所述第二分枝桿菌抗原包含與SEQ ID NO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段； 其中所述制劑用于所述第一和第二抗體的同時施用或順次施用。
19.根據(jù)權利要求18所述的制劑，所述制劑包含權利要求11所述的免疫原性組合物。
20.第一分枝桿菌抗原多肽或第一分枝桿菌多核苷酸，與第二分枝桿菌抗原多肽或第二分枝桿菌多核苷酸，其用于在受試者中刺激免疫應答；其中 (i)所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段； (ii)所述第一分枝桿菌多核苷酸序列包含編碼所述第一分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列； (iii)所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；并且 (iv)所述第二分枝桿菌多核苷酸序列包含編碼所述第二分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列。
21.根據(jù)權利要求20所述應用的第一分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸與第二分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸，其中所述第一分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸與所述第二第一分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸用于基本上同時或順次施用給受試者。
22.根據(jù)權利要求20或21所述應用的第一分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸與第二分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸，其中所述第一和第二分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸以權利要求16或17所述的制劑的形式存在。
23.第一抗體和第二抗體，所述第一抗體和第二抗體用于在受試者中刺激免疫應答； 其中所述第一抗體結合第一分枝桿菌抗原多肽，其中所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；并且 其中所述第二抗體結合第二分枝桿菌抗原多肽，其中所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段。
24.根據(jù)權利要求23所述應用的第一抗體和第二抗體，其中所述第一和第二抗體用于基本上同時或順次施用給受試者。
25.根據(jù)權利要求23或24所述應用的第一抗體和第二抗體，其中所述第一和第二抗體以權利要求18或19所述的制劑的形式存在。
26.根據(jù)權利要求20-22中任一項所述應用的第一分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸和第二分枝桿菌抗原多肽或多核苷酸，或根據(jù)權利要求23-25中任一項所述應用的第一抗體和第二抗體，其中所述應用是用于治療或預防所述受試者中的分枝桿菌感染(例如，TB);如其中所述分枝桿菌感染是早期感染。
27.診斷分枝桿菌感染如早期分枝桿菌感染的體外方法，所述方法包括將來自受試者的包含免疫細胞如T-淋巴細胞的測試樣品與下述一起溫育 (a)權利要求1-10中任一項所述的抗原組合物；或 (b)第一分枝桿菌抗原多肽或第一分枝桿菌多核苷酸，和第二分枝桿菌抗原多肽或第二分枝桿菌多核苷酸；其中 (i)所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段； (ii)所述第一分枝桿菌多核苷酸序列包含編碼所述第一分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列； (iii)所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；并且 (iv)所述第二分枝桿菌多核苷酸序列包含編碼所述第二分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列； 并且檢測所述免疫細胞的激活，其中所述免疫細胞的激活指示所述受試者中的分枝桿菌感染。
28.診斷分枝桿菌感染如早期分枝桿菌感染的體外方法，所述方法包括將來自受試者的測試樣品與下述一起溫育 (a)權利要求1-10中任一項所述的抗原組合物；或 (b)第一分枝桿菌抗原多肽或第一分枝桿菌多核苷酸，和第二分枝桿菌抗原多肽或第二分枝桿菌多核苷酸；其中 (i)所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段； (ii)所述第一分枝桿菌多核苷酸序列包含編碼所述第一分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列； (iii)所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；并且 (iv)所述第二分枝桿菌多核苷酸序列包含編碼所述第二分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列； 其中所述溫育在允許所述第一和第二分枝桿菌抗原與所述樣品中的抗體結合從而形成抗原-抗體復合物的條件下進行；然后檢測所述復合物的形成，其中抗原-抗體復合物的存在指示所述受試者中的分枝桿菌感染。
29.診斷分枝桿菌感染如早期分枝桿菌感染的體外方法，所述方法包括將來自受試者的測試樣品與下述一起溫育 (a)權利要求11中所述的免疫原性組合物；或 (b)第一抗體和第二抗體，其中所述第一抗體結合第一分枝桿菌抗原多肽，并且所述第二抗體結合第二分枝桿菌抗原多肽； 其中所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；并且其中所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ IDNO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段； 其中所述溫育在允許所述第一和第二抗體與所述樣品中的抗原結合從而形成抗原-抗體復合物的條件下進行；然后檢測所述復合物的形成，其中抗原-抗體復合物的存在指示所述受試者中的分枝桿菌感染。
30.如前述和/或如附圖
和/或?qū)嵤├兴镜目乖M合物、免疫原性組合物、細胞、方法或應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗原組合物，所述抗原組合物包含(a)第一分枝桿菌抗原多肽或第一分枝桿菌多核苷酸；和(b)第二分枝桿菌抗原多肽或第二分枝桿菌多核苷酸；其中(i)所述第一分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；(ii)所述第一分枝桿菌多核苷酸包含編碼所述第一分枝桿菌抗原多肽的多核苷酸序列；(iii)所述第二分枝桿菌抗原多肽包含與SEQ ID NO5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7個連續(xù)氨基酸的其片段；和(iv)所述第二分枝桿菌多核苷酸包含編碼所述第二分枝桿菌多肽的多核苷酸序列。
文檔編號G01N33/569GK102905724SQ201180025286
公開日2013年1月30日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權日2010年5月21日
發(fā)明者邁爾斯·卡羅爾, 伊珀·霍爾, 安·威廉斯 申請人:健康保護局