水貂γ-干擾素單克隆抗體及其在檢測(cè)水貂γ-干擾素中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種水貂γ -干擾素單克隆抗體的制備，還涉及一種檢測(cè)水貂γ -干擾 素的ELISA檢測(cè)方法。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大多數(shù)細(xì)胞因子是免疫應(yīng)答的產(chǎn)物，在動(dòng)物和人體內(nèi)可發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)，最終通 過(guò)上調(diào)免疫細(xì)胞對(duì)抗原物質(zhì)的免疫應(yīng)答，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)而清除抗原物質(zhì)。抗原刺激和病原 微生物感染均可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞因子，因此細(xì)胞因子與疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān) 系，它們可參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此細(xì)胞因子在疾病的診斷、治療、預(yù)防等方面有著廣泛 的應(yīng)用。
[0003] 細(xì)胞因子可以導(dǎo)致和/或促進(jìn)某些疾病的發(fā)生，病原微生物感染可誘導(dǎo)某些細(xì)胞 因子過(guò)量產(chǎn)生，高濃度細(xì)胞因子可加劇感染癥狀，因此臨床上通過(guò)檢測(cè)一些細(xì)胞因子可以 對(duì)疾病進(jìn)行診斷。近年來(lái)，動(dòng)物細(xì)胞因子的研究也越來(lái)越受到重視，采用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā) 出一些重組細(xì)胞因子產(chǎn)品（如干擾素）。其主要應(yīng)用表現(xiàn)在:通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子水平來(lái)評(píng)價(jià) 動(dòng)物機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，其次也可以研究細(xì)胞因子在病原微生物感染，特別是一些持續(xù) 性感染疾病、免疫抑制性疾病中的作用和地位。
[0004] 干擾素（interferon，IFN)是1957年最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，因其能干擾病毒感染而 得名。干擾素（IFN)等細(xì)胞因子可誘導(dǎo)APC表達(dá)MHCII類(lèi)分子，從而促進(jìn)抗原遞呈作用。30年 前，IFN- γ最早被發(fā)現(xiàn)，于1982年被克隆。其僅由NK細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞和⑶4+T細(xì)胞Th 1亞群產(chǎn) 生，通過(guò)廣泛表達(dá)的特異性受體（除了紅細(xì)胞上不表達(dá))發(fā)揮作用，血小板上也表達(dá)IFN-γ 受體，為IFN- γ在血循環(huán)中的運(yùn)輸增加了可能性。
[0005] Thl細(xì)胞分泌IL-2, IFN-γ及淋巴毒素，Thl細(xì)胞功能與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(炎癥 反應(yīng)，遲發(fā)型超敏反應(yīng)及細(xì)胞毒作用)相關(guān)。與TDTH細(xì)胞、TC細(xì)胞增殖、分化、成熟有關(guān)，因此 Thl細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，其中IFN-γ是細(xì)胞免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。因此， 檢測(cè)IFN- γ轉(zhuǎn)錄因子水平，可以間接地反映出IFN- γ基因表達(dá)水平，從而為研究Thl細(xì)胞分 化及其在自身免疫性疾病，病毒感染中的作用有著重要的臨床和科研意義。
[0006] 對(duì)樣本中的IFN-γ進(jìn)行定量分析，在免疫機(jī)制研究、免疫功能分析、疫苗免疫效果 評(píng)估、器官移植、過(guò)敏反應(yīng)以及多種胞內(nèi)病原感染的診斷等方面都具有極其重要的理論價(jià) 值和應(yīng)用價(jià)值。評(píng)價(jià)IFN-γ在機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化水平指標(biāo)，對(duì)于了解傳染性疾病的發(fā)生、發(fā) 展、轉(zhuǎn)歸情況及其機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)動(dòng)態(tài)規(guī)律提供較大幫助。因此，建立評(píng)價(jià)IFN-γ在機(jī) 體中水平變化的檢測(cè)方法顯得十分重要。
[0007] 近年來(lái)，我國(guó)水貂、狐貍和貉對(duì)犬瘟熱，細(xì)小病毒和阿留申病毒混合感染趨勢(shì)上 升，而傳統(tǒng)疫苗免疫后保護(hù)率下降時(shí)有發(fā)生，這些是什么原因?qū)е碌?，除了病毒的不斷變?外，了解動(dòng)物機(jī)體的免疫狀態(tài)，也為免疫程序的優(yōu)化及免疫時(shí)間的選擇提供依據(jù)。因此，本 發(fā)明的提出為開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型檢測(cè)方法對(duì)于我國(guó)特種動(dòng)物疫病防控具有深 刻的現(xiàn)實(shí)意義與廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是應(yīng)用雜交瘤技術(shù)獲得穩(wěn)定分泌抗水貂γ -干擾素單 克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，同時(shí)建立水貂γ -干擾素的檢測(cè)方法，從而為水貂γ -干擾素的 檢測(cè)提供一種新的技術(shù)手段，也為研究機(jī)體的免疫狀態(tài)及免疫機(jī)制提供技術(shù)平臺(tái)。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0010] 基于抗原特異性的IFN- γ反應(yīng)可用于評(píng)價(jià)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)的原理，特異 性抗原刺激的外周血淋巴細(xì)胞IFN- γ體外釋放試驗(yàn)已被廣泛用于抗感染診斷和細(xì)胞免疫 狀態(tài)評(píng)價(jià)。這種診斷方法是以IFN- γ單克隆抗體為基礎(chǔ)建立的一種夾心ELISA。將外周血淋 巴細(xì)胞與特異性抗原共同孵育過(guò)夜，通過(guò)夾心ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IFN-γ濃度以診斷 特異性感染。為了進(jìn)一步將IFN-γ應(yīng)用于水貂病毒感染的診斷和細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)，本發(fā)明進(jìn) 行了單克隆抗體研制：以組氨酸標(biāo)記的重組IFN- γ為抗原免疫小鼠，通過(guò)經(jīng)典的雜交瘤技 術(shù)，獲得5株能穩(wěn)定分泌高效價(jià)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，利用這些細(xì)胞分別誘生了腹 水。通過(guò)ELISA、Western blot與免疫熒光證明，其中一株雜交瘤細(xì)胞所生產(chǎn)的單克隆抗體 可識(shí)別天然的IFN-γ，且與IFN-γ結(jié)合效價(jià)高，特異性好，在水貂性疾病診斷中具有重要的 應(yīng)用前景。
[0011]所述雜交瘤細(xì)胞株命名為Mi IFN-γ-H44,其分類(lèi)命名為分泌水貂γ-干擾素單克 隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北 京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為:CGMCC No. 10953,保 藏日期為2015年7月2日。
[0012] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了由所述的雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗水貂γ-干擾素的 單克隆抗體以及所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)水貂γ-干擾素試劑中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)證明所 述單克隆抗體能夠同時(shí)可識(shí)別天然水貂γ -干擾素。
[0013] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種用于檢測(cè)水貂γ-干擾素的ELISA檢測(cè)試劑盒， 其特征在于含有本發(fā)明所述的單克隆抗體、抗γ -干擾素的多克隆抗體以及HRP標(biāo)記的羊抗 兔IgG酶標(biāo)二抗。
[0014] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的單克隆抗體為包被抗體，所述的多克隆抗體為檢測(cè)抗 體，當(dāng)包被抗體的濃度為〇.〇118μg/ml，檢測(cè)抗體的濃度為0.126μg/ml時(shí)可檢測(cè)到0. lug的 水貂IFN-γ，100倍再稀釋時(shí)，0D值仍能達(dá)到0.8。
[0015]本發(fā)明以篩選的特異性單抗為包被抗體，多抗為夾心抗體，建立的夾心ELISA檢測(cè) 方法檢測(cè)了犬瘟熱感染水貂外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN- γ蛋白水平，通過(guò)三次符合實(shí)驗(yàn)，驗(yàn) 證該方法靈敏，準(zhǔn)確率高，同時(shí)所建立的夾心ELISA對(duì)幾種非相關(guān)性抗原的檢測(cè)均為陰性， 表明該方法的特異性良好。由于目前市場(chǎng)上很難買(mǎi)到天然水貂IFN-γ，所以本研究應(yīng)用的 標(biāo)準(zhǔn)品及生產(chǎn)抗體用的抗原均為重組蛋白。但初步研究證明，所研制的水貂IFN- γ單克隆 抗體與多克隆抗體及建立的夾心ELISA同樣適應(yīng)于免疫細(xì)胞天然分泌的IFN- γ。用該夾心 ELISA方法測(cè)定了分別感染犬瘟熱疫苗株和強(qiáng)毒株的水貂外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清，在6個(gè) 不同時(shí)間點(diǎn)，IFN- γ水平隨著感染時(shí)間的變化而變化，在感染初期，IFN- γ在24小時(shí)前表現(xiàn) 為表達(dá)抑制，48h表達(dá)水平達(dá)到最高峰，72h急劇下降。本發(fā)明的提出對(duì)特種動(dòng)物疫病防控具 有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為水貂IFN-γ的基因序列（劃線部分為信號(hào)肽區(qū)）；
[0017]圖2為水貂IFN- γ在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)；
[0018] ΜΚ:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);A、未誘導(dǎo)對(duì)照;Β、表達(dá)全菌;C、裂解物上清;D.裂解物沉淀；
[0019] 圖3為雜交瘤上清檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)；
[0020] 1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，3、編號(hào)為31G的雜交瘤上清檢測(cè)pET32a-IFN- γ和pCold-IFN-γ表達(dá);4、編號(hào)為31G的雜交瘤上清檢測(cè)pET32a-IFN-a;5,6、編號(hào)為31A的雜交瘤上清 檢測(cè)pET32a-IFN-γ和pCold-IFN-γ表達(dá);7、編號(hào)為31A的雜交瘤上清檢測(cè)pET32a-IFN-a; 8,9、編號(hào)為31B的雜交瘤上清檢測(cè)pET32a-IFN-y和pCold-IFN-γ表達(dá)；10、編號(hào)為31B的雜 交瘤上清檢測(cè)pET32a-IFN-a; 11，12、編號(hào)為H44的雜交瘤上清檢測(cè)pET32a-IFN- γ和pCold-IFN- γ表達(dá)；13、編號(hào)為H44的雜交瘤上清檢測(cè)pET32a-IFN-a; 14,15、編號(hào)為F46的雜交瘤上 清檢測(cè)pET32a-IFN-γ和pCold-IFN-γ表達(dá)；16、編號(hào)為F46的雜交瘤上清檢測(cè)pET32a-IFN-α；
[0021] 圖4為雜交瘤上清免疫熒光檢測(cè)pcDNA3.1/MiIFN-y在Vero細(xì)胞上的表達(dá)；
[0022] A、編號(hào)為H44的雜交瘤上清10倍稀釋后免疫熒光檢測(cè);B、編號(hào)為F46的雜交瘤上清 10倍稀釋后免疫熒光檢測(cè);C、報(bào)告基因?qū)φ?D、正常細(xì)胞對(duì)照；
[0023] 圖5為SDS-PAGE檢測(cè)純化的IFN- γ單克隆抗體；
[0024] 1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);2，3、編號(hào)為Η44純化抗體;4，5、編號(hào)為F46純化抗體；
[0025] 圖6為淋巴細(xì)胞在感染他、311、811、2411、4811、7211和9611后表達(dá)的丫-干擾素水平。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0027] 本發(fā)明具體實(shí)施例所涉及的主要材料和來(lái)源
[0028] pMD18-T載體，原核表達(dá)載體pColdll，各種限制性內(nèi)切酶和DH5a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自 TaKaRa (大連)有限公司。SPF級(jí)Balb/c小鼠購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;小鼠骨 髓瘤細(xì)胞SP2/0本實(shí)驗(yàn)室制備;RPMI-1640培養(yǎng)基、澳大利亞血緣胎牛血清購(gòu)自Gibco公司； HAT選擇培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基和PEG5000購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG，熒光二抗和TMB底物顯色液購(gòu)自Sigma公司;ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce公司;預(yù)染蛋白 M