專利名稱：具有抗腫瘤活性的疫苗組合物及其在惡性疾病治療方面的應(yīng)用的制作方法
本項(xiàng)發(fā)明涉及免疫學(xué)的領(lǐng)域，尤其是對(duì)自身表皮生長(zhǎng)因子(EGF)能夠產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的疫苗組合物。
本項(xiàng)發(fā)明的一個(gè)重要目標(biāo)是獲得一種疫苗組合物，它能夠?qū)GF依賴性的惡性腫瘤產(chǎn)生主動(dòng)的免疫治療，它能夠抑制這些腫瘤的增殖，因此，它被用作惡性腫瘤及其它EGF相關(guān)疾病的治療。因此，本項(xiàng)發(fā)明也與腫瘤治療相關(guān)。
表皮生長(zhǎng)因子，一種能夠刺激上皮細(xì)胞增殖的多肽，被認(rèn)為是一種在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中起作用的生長(zhǎng)因子，其作用的發(fā)揮主要是通過其細(xì)胞膜受體。
表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是一53個(gè)氨基酸組成的多肽，其分子量約為6045D(道爾頓)。它首先是從鼠的下頜下腺被分離和純化(Co-hen S.J.Biol Chem(1962)237，1.555)，其后從人尿液中獲得一個(gè)相似的分子(Cohen S.人表皮生長(zhǎng)因子分離及其化學(xué)和生物學(xué)特性PNAS USA 72，1975，1317)。
EGF能夠在體內(nèi)外刺激上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的增殖(CohenS.，Carpenten G.，PN AS USA 72，1317，1975)，對(duì)某些乳腺癌細(xì)胞系EGF能行使一個(gè)特異性的刺激作用(Osborne C.K.etals Can Res.40，2361(1980))。在乳腺分化過程中，EGF的作用，主要是對(duì)小葉乳泡系統(tǒng)的發(fā)展起作用已經(jīng)被證實(shí)(Tonelli C.J.Nature(1980)285，250-252)。
此種生物調(diào)節(jié)活性的發(fā)揮是通過一種細(xì)胞膜受體(EGF-R)來實(shí)現(xiàn)的，該受體為一個(gè)由1186個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，分子量約為170KD，其基因已被克隆并且進(jìn)行了序列分析。此受體的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域與酪氨酸特異性的蛋白激酶活性相關(guān)，此酶和與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程有關(guān)的癌基因產(chǎn)物v-erb-B具有結(jié)構(gòu)上的同源性(HeldinC.H.Cell 37，9-20(1984))。
EGF和其受體組成一個(gè)高度特異性的分子復(fù)合體，它們之間的相互作用形成了細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。
高水平的EGF-R已經(jīng)在上皮起源的惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，例如，乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、陰道癌、結(jié)腸癌、肺癌，腦癌和食管癌。EGF及其受體在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)過程中的作用目前尚不清楚，有觀點(diǎn)認(rèn)為，ECF-R在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)提供了一種自分泌式的生長(zhǎng)刺激機(jī)制，這種刺激導(dǎo)致了非控制性的增殖(Schlessinger J.，Schreiber A.B.，Levi A.，Liberman T.，Yarden Y.Cnt.Rev.Biochem 1983，14(2)93-111)。
EGF-R在腫瘤細(xì)胞中的存在已經(jīng)被證明是人類乳腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)。大約40％的乳腺腫瘤顯示有對(duì)EGF具有高度親和力的特異性的結(jié)合位點(diǎn)，也有在有與雌激素受體相反的關(guān)系，它指示EGF-R作為一種反分化的標(biāo)記或者惡性細(xì)胞增殖潛能的指示器(Perez R.，Pascual M.R.，Macias A.，Lage A.，乳腺癌研究與治療4，189-193，1984)。
也已經(jīng)有報(bào)道在局部的神經(jīng)節(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGF-R的表達(dá)要高于原發(fā)的乳腺腫瘤組織(Sainsbury J.R.，et al(1985)Lancet1(8，425)，364-366)，并且有報(bào)道說，在乳腺腫瘤細(xì)胞不同的組織嚴(yán)型之間該受體的表達(dá)也存在著不同，這也使得它們的存在是預(yù)后不良的一個(gè)信號(hào)(Macias A.，et al(1986)，AnticancerRes.6849-852)。
先前用Balb-C小鼠的艾化腹水瘤(EAT)模型的研究證明EGF在體內(nèi)的抑制作用(Lombardero J.，et als Neoplas-ma33，4(1987))，因此，認(rèn)為此分子作為一個(gè)生物反應(yīng)的調(diào)節(jié)物是可能的。
早先的研究已經(jīng)報(bào)道，在EGF依賴性的腫瘤細(xì)胞膜上存在著EGF的前體分子。該發(fā)明的作者報(bào)道，一個(gè)重要的事實(shí)是該分子也是自身抗體作用的靶分子(Patent Application Cuba No.113/93)。來自不同的研究結(jié)果顯示，EGF/EGF-R系統(tǒng)是治療作用可能的靶。
應(yīng)用抗EGF-R的單克隆抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫治療，許多研究表明，該受體的抗體的特異性識(shí)別抑制了EGF的結(jié)合，同時(shí)對(duì)惡性細(xì)胞的促有絲分裂刺激也產(chǎn)生了抑制效應(yīng)(SATO J.D.，et al.Metliods in Enzymology，Vol 146 pp63-81(1987))。然而，這些鼠源性的抗體通常將產(chǎn)生人抗鼠的抗體反應(yīng)(HAMA)。
直到本項(xiàng)發(fā)明為止，沒胡一項(xiàng)能夠抑制細(xì)胞增殖的主動(dòng)免疫治療來治療EGF依賴性的腫瘤的方案被提出，因?yàn)橄惹暗挠^念一致認(rèn)為“自身”的分子不將誘導(dǎo)任何免疫反應(yīng)，因?yàn)闄C(jī)體是自我耐受性的。
本項(xiàng)發(fā)明提供了一種包含有被連接在一個(gè)載體蛋白分子上的自體EGF的疫苗組合物，通過自身免疫效應(yīng)，該組合物能夠抑制EGF依賴性的腫瘤的生長(zhǎng)，而不產(chǎn)生那種異源蛋白進(jìn)入人體所產(chǎn)生的副效應(yīng)。
這種疫苗組合物可用于EGF依賴性腫瘤或EGF相關(guān)的惡性疾病的治療。
在此說明，在該設(shè)計(jì)中EGF應(yīng)該被理解為包含其任意片段或者其衍生物，它們與其原始物具有相似的免疫學(xué)特性或者效應(yīng)。衍生物包括但不僅僅限于常規(guī)的氨基酸的替代，氨基酸位點(diǎn)直接的置換以便增加穩(wěn)定性或者活性和化學(xué)的修飾等等。I.免疫原制劑的獲得要獲得兩種制劑。第一種是連接在蛋白載體上的鼠EGF(mu-EGF)，第二種是人重組EGF(hu-rec-EGF)(National Medica-ment Register Office from Cuba，HEBERMIN，No.1266)，它也被連接在一個(gè)載體蛋白分子上。
包含有連接在載體蛋白上的hu-rec-EGF的制劑只用在非人的靈長(zhǎng)動(dòng)物和人。同時(shí)輔以適應(yīng)的免疫佐劑。
被連接在蛋白載體上的mu-EGF在小鼠動(dòng)物模型上使用，以便確定包含自身EGF分子的制劑的免疫原性和抗瘤作用。
結(jié)合的hu-EGF載體蛋白的免疫原性研究用靈長(zhǎng)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因?yàn)閔u-EGF與靈長(zhǎng)類EGF非常相似，盡管它被認(rèn)作一個(gè)自體分子。允許證實(shí)自體分子免疫原反應(yīng)的結(jié)果能夠被得出。
制劑準(zhǔn)備如下，溶解于PBS/10mM MgCl2中的鼠EGF或者h(yuǎn)u-rec-EGF溶液與用同樣溶劑溶解的載體蛋白溶液，以1-5摩爾EGF/每摩爾蛋白的比率相混合。
然后再加入0.5％戊二醛，使終濃度為0.1％-0.05％之間。
混合物在室溫下溫育1-3小時(shí)，然后用PBS/MgCl210mM溶液進(jìn)行透析，至少更換透析液三次。結(jié)合物特性鑒定。
結(jié)合效率試驗(yàn)和免疫原性保持試驗(yàn)，通過ELISA測(cè)定進(jìn)行。
經(jīng)PVC(NUNC)活化的ELISA平板用50μl抗載體蛋白的抗血清進(jìn)行包被，濃度在1-10μg/ml。例如用霍亂毒素B(CTB)作為載體，平板用神經(jīng)節(jié)苷脂GM1進(jìn)行包被。
接著用PBS/Tween洗三次，然后再用0.5-1％的BSA溶液(溶于PBS/Tween中)封閉，37℃溫育30分鐘至一小時(shí)。然后把待測(cè)定的結(jié)合物用0.1-0.001的稀釋度加到平板上，每孔50μl，37℃溫育1-2小時(shí)。
接著用1∶500～1∶1000的稀釋度加鼠抗hu-rec-EGF抗血清，每孔50μl，37℃溫育30分鐘至1小時(shí)。
最后，用1∶500～1∶1000稀釋度加抗鼠堿性磷酸酶抗血清，每孔50μl，37℃溫育30分鐘至一小時(shí)。
用濃度為1mg/ml的對(duì)硝基苯磷酸酯(溶于二乙醇胺中)黑色，每孔加50μl，37℃溫充30分鐘。用ELISA平板讀數(shù)儀測(cè)定405nm波長(zhǎng)時(shí)的光密度(OD值)。
結(jié)果表示分子的活性和結(jié)合物的效率，因?yàn)榻Y(jié)合物保持有對(duì)包被平板的分子的識(shí)別位點(diǎn)，該分子特異性地識(shí)別載體蛋白，同時(shí)，結(jié)合物又為抗EGF的抗血清所識(shí)別。II.包含mu-EGF的制劑的效能特征前臨床研究IIa)內(nèi)源性的EGF的免疫原性小鼠自身免疫性的誘導(dǎo)。
為了證實(shí)上述包含mu-EGF的免疫原制劑誘導(dǎo)抗內(nèi)源性EGF的自身免疫的能力，在Balblc小鼠中進(jìn)行了分組實(shí)驗(yàn)。
各組動(dòng)物接種不同的劑量，范圍在每只小鼠每周注射50-100μg的mu-EGF/載體蛋白，持續(xù)4-6周。
第一周，免疫原制劑與弗氏完全佐劑按1∶1的比率配制，隨后的劑量都是與弗氏不完全佐劑來配制。
在對(duì)照組中也進(jìn)行同樣的程序，只是動(dòng)物僅用佐劑來處理。在最后一次免疫接種以后一周，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采血，分離血清，抗mu-EGF血清抗體效價(jià)用ELISA技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。IIb)hu-rec-EGF的免疫原性為了證實(shí)hu-rec-EGF對(duì)小鼠的免疫原性，同時(shí)為了顯示抗hu-rec-EGF抗體識(shí)別mu-EGF的能力，在Balblc小鼠中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
動(dòng)物分組以后，按每只小鼠每周注射50-100μg的hu-rec-EGF/載體蛋白，每組接種不同的劑量，持續(xù)4-6周。
第一周，免疫原制劑與弗氏完全佐劑按1∶1的比率配制。隨后的各劑量與弗氏不完全佐劑配制。
相同的程序也在對(duì)照組中進(jìn)行，只是動(dòng)物僅用佐劑來處理。
在最后一次免疫接種以后一周，從動(dòng)物采血，分離血清，抗mu-EGF抗體的效價(jià)用ELISA技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。IIc)抗腫瘤活性。
本實(shí)驗(yàn)的主要目的是為了確定抗自身EGF的免疫反應(yīng)是否能夠在EGF依賴性的腫瘤中引出抗腫瘤作用。
根據(jù)以上技術(shù)，在確定具有高滴度抗體的動(dòng)物體內(nèi)接種艾氏腹水瘤(EAT)，接種的細(xì)胞濃度為每只動(dòng)物20-200。萬對(duì)照組按同樣的方法進(jìn)行處理。
觀察動(dòng)物移植瘤生長(zhǎng)和動(dòng)物生存情況。II.免疫反應(yīng)的鑒定IIIa)抗體反應(yīng)的同型性為了證實(shí)用自身EGF免疫接種小鼠所獲得的自身免疫反應(yīng)是一種IgM或IgG同型抗體的反應(yīng)，進(jìn)行了ELISA測(cè)定，按條款I(lǐng)Ia)和b)描述的方法檢測(cè)了用EGF免疫動(dòng)物的血清。對(duì)于IgM，用抗IgM的抗血清與樣品一起溫育，檢測(cè)IgG的特征時(shí)用抗IgG抗血清與樣品一起溫育。IIIb)免疫反應(yīng)記憶的鑒定開發(fā)一種能夠用于主動(dòng)免疫治療的疫苗產(chǎn)品，必須確定該產(chǎn)品誘導(dǎo)免疫記憶的能力，如果免疫記憶被誘導(dǎo)出，要能夠確定該記憶的持久性。
這些信息使得該產(chǎn)品的免疫計(jì)劃能夠被正確地設(shè)計(jì)，并且能夠被很好地完成。
用hu-rec-EGF免疫各組小鼠，每只動(dòng)物用5-100μg的hu-rec-EGF，hu-rec-EGF與弗氏完全佐劑按1∶1比率配制。
在不同的動(dòng)物組，抗mu-EGF的抗本產(chǎn)生過程的動(dòng)力學(xué)被研究。動(dòng)力學(xué)研究在首次免疫接種后和當(dāng)抗體滴度下降時(shí)再加強(qiáng)免疫接種后進(jìn)行?？贵w水平用ELISA技術(shù)測(cè)定。IV.在非人靈長(zhǎng)動(dòng)物進(jìn)行免疫原性研究免疫原制劑的免疫原性的標(biāo)準(zhǔn)必須建立在從非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之上，因?yàn)樗鼈兣c人類的親緣關(guān)系最近。
用包含hu-rec-EGF免疫原制劑免疫一組靈長(zhǎng)動(dòng)物，劑量為500μg，hu-rec-EGF被結(jié)合在破傷風(fēng)類毒素上，并且與免疫佐劑一起使用。最后一次免疫接種后采血，測(cè)定抗hu-EGF抗全效價(jià)。
實(shí)施例1在EGF依賴性腫瘤細(xì)胞膜上有EGF前體分子存在的研究本研究所用技術(shù)為蛋白印跡技術(shù)。所用樣品為，5例不同階段的乳腺導(dǎo)管癌，1例頭頸部腫瘤，4例纖維發(fā)育不良癥，5例正常樣品作為對(duì)照。
從樣品分離細(xì)胞膜，按Grimaux M.的操作程序(GrimauxM.Rev Neurol，1988，144101-103)。
電泳條件為250V，10mA，3DW，15℃，150Vh。分子量標(biāo)準(zhǔn)范圍為14,300D(溶菌酶)～340,000D(a2巨球蛋白)。
用一Phast系統(tǒng)裝置在轉(zhuǎn)移緩沖液中把電泳分離開的蛋白帶轉(zhuǎn)移到0.45μm的硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移完成后，膜用10％脫脂乳封閉過夜，不斷振搖。
用緩沖液洗滌三次后，加入一鼠抗人EGF單克隆抗全，孵育4小時(shí)。
洗灑三次，加入生物素酰化的抗鼠抗全，孵育一小時(shí)。加入過氧化物酶鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合物溫育1小時(shí)后，加入二氨基聯(lián)苯胺和過氧化氫顯色。
結(jié)果顯示，來源于正常組織的樣品，在高分子量的區(qū)段沒有出現(xiàn)條帶。而來源于乳腺有病理學(xué)改變的樣品(發(fā)育不良癥和腫瘤)在高分子量的區(qū)段出現(xiàn)彌散型的條帶。這就是在腫瘤細(xì)胞膜上存在高分子量的EGF前體的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。實(shí)施例2制備mu-EGF/CTB結(jié)合物1毫升濃度為1mg/ml的mu-EGF(溶于PBS/MgCl210mM溶液中)與2毫升的CTB溶液(溶于PBS/10mM MgCl2中)相混合?；旌夏枖?shù)之比為1∶1。加入3毫升0.5％戊二醛，使終濃度為0.05％。
在室溫下溫育一小時(shí)，然后用PBS/10mM MgCl2溶液進(jìn)行透析，至少更換透析液三次。實(shí)施例3mu-EGF/CTB結(jié)合體鑒定結(jié)合試驗(yàn)的ELISA測(cè)定PVC活化的ELISA平板(NUNC)用50μl溶于甲醇之中的濃度為4μg/ml的神經(jīng)節(jié)苷酯GM1(能夠識(shí)別CTB分子)包被，放置通風(fēng)櫥中干燥一小時(shí)。
接著用PBS/Tween洗三次，然后用1％BSA(溶于PBS/Tween中)溶液封閉平板，37℃溫育30分鐘。
用0.1-0.001mg/ml的稀釋度把結(jié)合物加入平板，每孔50μl，37℃溫育一小時(shí)。
然后把1∶1000稀釋的鼠抗mu-EGF的抗血清加入平板.，每孔加50μl，37℃溫育一小時(shí)。
每孔加50μl抗鼠抗血清堿性磷酸酶結(jié)合物(稀釋度為1∶1000)，37℃溫育一小時(shí)。每孔再加50μl濃度為1mg/ml的對(duì)硝基苯磷酸酯(溶于二乙醇胺中)，37℃溫育30分鐘顯色，讀取405nm波長(zhǎng)的光密度(OD)。
結(jié)果證實(shí)結(jié)合物濃度與吸收值之間直接的相互關(guān)系。顯示了結(jié)合活性和結(jié)合的效率。因?yàn)椋肿颖３謱?duì)神經(jīng)節(jié)苷酯GM1的識(shí)別(由CTB識(shí)別)，同時(shí)也被抗mu-EGF抗血清所識(shí)別(

圖1)。實(shí)施例4自身EGF的免疫原性小鼠自身免疫的誘導(dǎo)。
為了證實(shí)包含自身EGF的免疫原制劑能夠誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，在Balb/C小鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
免疫接種幾組動(dòng)物，每只動(dòng)物每周皮下注射50μg結(jié)合的mu-EGF，持續(xù)4-6周。
第一周，免疫原制劑與弗氏完全佐劑按1∶1的比例配制，隨后的劑量與弗氏不完全佐劑配制。
對(duì)照組動(dòng)物僅用佐劑處理。最后一次免疫注射后一周，采血，分離血清，用ELISA測(cè)定抗mu-EGF抗體的效價(jià)。
在包被板之中加入濃度為10μg/ml mu-EGF(用碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)pH9.6)，溫育過夜。平板被洗滌以后，加入不同稀釋度的樣品，孵育1小時(shí)。加入堿性磷酸酶抗鼠抗體結(jié)合物，孵育1小時(shí)后出現(xiàn)顏色，用ELISA讀數(shù)儀讀取405nm波長(zhǎng)的光密度。
所有被mu-EGF-CTB免疫的動(dòng)物均產(chǎn)生抗mu-EGF抗體，其最高效價(jià)達(dá)1∶1000稀釋度，而對(duì)照組未出現(xiàn)抗體(圖2)。實(shí)施例5hu-rec-EGF的免疫原性小鼠自身免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)為了證實(shí)包含hu-rec-EGF的免疫原制劑能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗mu-EGF抗體，在Balb/C小鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
動(dòng)物進(jìn)行分組。每只動(dòng)物每周皮下注射50μg的hu-rec-EGF，持續(xù)4-6周。
第一周，免疫原制劑與弗氏完全佐劑按1∶1的比率配制，隨后的劑量與弗氏不完體佐劑配制。
設(shè)置對(duì)照組。其動(dòng)物僅用佐劑處理。
最后一次接種后一周，采血分離血清，用ELISA方法測(cè)定抗mu-EGF抗體效價(jià)。
實(shí)驗(yàn)所用包被板用10μg/ml的mu-EGF(溶于碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液pH9.6)包被。溫育過夜。洗灑后加入各種稀釋度的樣品，孵育1小時(shí)。加入堿性磷酸酶抗鼠抗體結(jié)合物孵育1小時(shí)后出現(xiàn)顏色，用ELISA讀數(shù)儀讀取波長(zhǎng)為405nm時(shí)的光密度。
所有被hu-rec-EGF免疫的動(dòng)物均出現(xiàn)抗mu-EGF抗全，其最高效價(jià)達(dá)1∶20000稀釋度，而對(duì)照組無抗體出現(xiàn)(圖3)。實(shí)施例6hu-rec-EGF在氫氧化鋁制劑中的免疫原性為了證實(shí)包含hu-rec-EGF免疫原制劑在以氫氧化鋁為佐劑時(shí)能夠產(chǎn)生抗mu-EGF抗體，在Balb/C小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
動(dòng)物進(jìn)行分組。每只動(dòng)物每周皮下注射一劑50μg的hu-rec-EGF(氫氧化鋁為佐劑)，持續(xù)4-6周。
設(shè)置對(duì)照組，其動(dòng)物只用佐劑處理。是后一次接種后一周，采血分離血清，用ELISA方法測(cè)定抗mu-EGF抗體效價(jià)。
用在碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中濃度為10μg/ml的mu-EGF包被平板過夜。洗滌后加入各種稀釋度的樣品孵育1小時(shí)。加入堿性磷酸酶抗鼠抗體結(jié)合物后1小時(shí)出現(xiàn)顏色反應(yīng)，用ELISA讀數(shù)儀讀取405nm波長(zhǎng)時(shí)的光密度。
所有被hu-rec-EGF/Al(OH)3免疫的動(dòng)物均出現(xiàn)血清抗mu-EGF抗體，其最高效價(jià)達(dá)1∶4000稀釋度。對(duì)照組無血清抗體產(chǎn)生(圖4)。實(shí)施例7抗腫瘤活性。
本實(shí)驗(yàn)的主要目的是確定獲得的抗自身EGF的免疫反應(yīng)是否能夠在EGF依賴性的腫瘤引出抗腫瘤作用。
按實(shí)施例5中描述技術(shù)確定的具有高效價(jià)抗體的動(dòng)物，接種艾氏腹水瘤(EAT)，每只動(dòng)物按二百萬EAT細(xì)胞濃度接種。對(duì)照組(非免疫鼠)按同樣方法處理。
觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物移植瘤生長(zhǎng)和動(dòng)物生存情況。處理組和對(duì)照組動(dòng)物生存曲線如圖5所示。
生命期指數(shù)增加22.5％，并且處理組比對(duì)照組生存數(shù)的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性(按照Mantel Haenszel和Wilcoxon試驗(yàn))。實(shí)施例8按mu-EGF抗體效價(jià)與125I EGF生物學(xué)分布之間的相關(guān)性進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的目的是為了證實(shí)在有抗mu-EGF抗體的動(dòng)物與體內(nèi)無抗mu-EGF抗體的動(dòng)物體內(nèi)，125I標(biāo)記的EGF存在著不同的生物學(xué)分布。
為了實(shí)現(xiàn)此目的，用4組動(dòng)物(鼠)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)第1組30只帶有抗mu-EGF抗體的小鼠。
第2組30只無抗mu-EGF抗體的小鼠。
第3組30只有抗mu-EGF抗體并且?guī)AT移植瘤的小鼠。
第4組30只無抗mu-EGF抗體但有EAT移植瘤的小鼠。
在第1組和第2組在注射125I標(biāo)記的EGF后2，5，8，11，15，20，30，60，120和150分鐘分別殺死3只動(dòng)物，分別從血液、肺、腎，肝和皮膚取樣，然后計(jì)數(shù)被取器官的放射活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同時(shí)間125I標(biāo)記EGF蓄積情況的不同，主要分布腎和肝(圖6-a，b)，結(jié)果證實(shí)抗mu-EGF抗體的存在改變了該分子的生物學(xué)分布。
第3、4組動(dòng)物，樣品取自于血液，肺，腎，肝，皮膚和腹水。分別在2，5，8，11，15，20，30，60，120和150分鐘10個(gè)時(shí)間點(diǎn)上殺死3只動(dòng)物，計(jì)數(shù)被取器官的放射活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，帶有抗體的動(dòng)物腹水中標(biāo)記EGF蓄積比不帶抗體的動(dòng)物腹水中標(biāo)記EGF蓄積少(圖7)。結(jié)果顯示，在有抗體的動(dòng)物能夠比較快地清除存在于腹水中的EGF，或者能夠限制EGF進(jìn)入腹水。實(shí)施例9免疫反應(yīng)的鑒定抗自身EGF的同型性為了確知被自身EGF免疫的小鼠所獲得的自身免疫反應(yīng)是否是產(chǎn)生同型IgM或者IgG抗體的反應(yīng)，進(jìn)行了ELISA測(cè)試，平板用10μg/ml的mu-EGF包被，每孔50μl，37℃孵育一小時(shí)。
接著加入稀釋度為1∶10～1∶1000被mu-EGF-CTB免疫的動(dòng)物的血清，每孔加50μl，37℃溫育一小時(shí)。
用對(duì)應(yīng)的抗血清(分別用抗IgG、抗IgM)來檢測(cè)IgG和IgM反應(yīng)。
用溶于二乙醇胺之中濃度為1mg/ml的對(duì)硝基苯磷酸酯進(jìn)行顯色反應(yīng)。37℃溫育30分鐘后讀取405nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值。
在所有被處理的動(dòng)物獲得了IgG反應(yīng)(圖8)。實(shí)施例10抗自身EGF免疫記憶的鑒定研究用二組動(dòng)物，每組10只小鼠，用50μg hu-rec-EGF(用弗氏完全佐劑)一次免疫接種。
在第一組，研究動(dòng)物抗mu-EGF抗體產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)。每4天采血一次，用ELISA技術(shù)測(cè)定抗體水平。
在第二組，參照第一組當(dāng)抗體效價(jià)下降時(shí)，再免疫接種一次，每2天采血一次，用ELISA技術(shù)測(cè)定抗體水平。
結(jié)果顯示，當(dāng)用同一制劑再次免疫動(dòng)物時(shí)，能夠產(chǎn)生免疫記憶反應(yīng)(圖9)。實(shí)施例11免疫原制劑的制備hu-rec-EGF/破傷風(fēng)類毒素(TT)溶于PBS/10mM MgCl2中的hu-rec-EGF濃度為4mg/ml，溶于PBS/10mM MgCl2中的破傷風(fēng)類毒素(TT)溶液濃度為4mg/ml，把1ml hu-rec-EGF溶液與2ml TT溶液相混合，加入3ml 0.5％戊二醛，使終濃度為0.05％。
室溫下溫育1小時(shí)，然后用PBS/10mM MgCl2溶液透析，更換透析液至少三次。實(shí)施例12結(jié)合特性hu-rec-EGF/TT用ELISA測(cè)定進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)用50μl抗TT抗血清包被平板，溫育過夜?？筎T抗血清來源于羊，濃度為10μg/ml。
用PBS/Tween法滌三次，平板再用1％BSA溶液(在PBS/Tween中)封閉，37℃溫育30分鐘。
每孔加50μl結(jié)合物，稀釋度為0.1-0.001mg/ml，37℃溫育1小時(shí)。
每孔加50μl鼠抗hu-rec-EGF抗血清，稀釋度為1∶1000，37℃溫育1小時(shí)。
然后，每孔加50μl抗鼠抗血清堿性磷酸酶結(jié)合物(稀釋度為1∶1000)，37℃溫育1小時(shí)。每孔加50μl/mg/ml的對(duì)硝基苯磷酸酯，37℃溫育30分鐘顯色，讀取波長(zhǎng)405nm時(shí)的光密度。
結(jié)果顯示結(jié)合物濃度與吸收值之間直接的相互關(guān)系。
結(jié)果顯示結(jié)合物的活性和結(jié)合效率。因?yàn)樵摲肿颖３謱?duì)抗TT抗血清的識(shí)別，同時(shí)其又被抗mu-EGF抗血清所識(shí)別(圖10)。實(shí)施列13在非人靈長(zhǎng)動(dòng)物研究連接至載體蛋白(TT)的hu-rec-EGF/TT的免疫原性研究工作用4只獼猴來開展。先提供一項(xiàng)臨床獸醫(yī)學(xué)檢查包括一般身體檢查胸部X光檢查血液化驗(yàn)這些動(dòng)物用hu-rec-EGF/TT進(jìn)行免疫，按實(shí)施例10提供的方法進(jìn)行。
分別在1，2，3，4，6和12周進(jìn)行皮下接種。第1次免疫接種輔以弗氏完全佐劑，其余各次輔以弗氏不完全佐劑。
取血，用ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。
實(shí)驗(yàn)所有包被板用10μg/ml的hu-EGF包被過夜，hu-EGF溶于碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)之中。洗滌后加不同稀釋度的樣品，溫育1小時(shí)。加堿性磷酸酶抗人抗體復(fù)合物，溫育1小時(shí)后再顯色，用ELISA讀數(shù)儀讀取OD405值。
所有用hu-EGF/TT制劑免疫的動(dòng)物均產(chǎn)生抗hu-EGF抗體，其最高效價(jià)達(dá)1∶20000稀釋度(圖11)。
圖1確定CTB與hu-rec-EGF之間結(jié)合效率的ELISA測(cè)定。
X軸結(jié)合物的連續(xù)稀釋度(1～0.001mg/ml)y軸波長(zhǎng)為405nm時(shí)的光密度(OD405)(用ELISA讀數(shù)儀測(cè)定)圖25只用mu-EGF-CTB免疫的小鼠抗mu-EGF抗體效價(jià)的ELISA測(cè)定X軸抗血清稀釋度(1∶10，1∶100，1∶1000)Y軸波長(zhǎng)為405nm時(shí)的光密度(由ELISA技術(shù)測(cè)定)曲線表示5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體效價(jià)(與同一動(dòng)物免疫之前的比較)圖35只用hu-rec-EGF免疫小鼠抗mu-EGF抗體效價(jià)的ELISA測(cè)定X軸血清稀釋度1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶20000Y軸405nm波長(zhǎng)光密度圖45只用hu-rec-EGF(氫氧化鋁為佐劑)免疫的小鼠抗mu-EGF抗體效價(jià)的ELISA測(cè)定X軸血清稀釋度1∶100，1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000
Y軸405nm波長(zhǎng)光密度圖5用mu-EGF-CTB免疫后又接種了艾氏腹水瘤的動(dòng)物的生存率與非免疫但接種了艾氏腹水瘤的對(duì)照動(dòng)物生存率的比較。
圖6ahu-rec-EGF免疫小鼠與非免疫對(duì)照動(dòng)物肝組織中125I標(biāo)記EGF蓄積時(shí)間圖。
圖6bhu-rec-EGF免疫小鼠與非免疫對(duì)照小鼠腎組織中125I標(biāo)記EGF蓄積時(shí)間圖。
圖7hu-rec-EGF免疫并且?guī)в蠩AT移植瘤動(dòng)物腹水中125I標(biāo)記mu-EGF蓄積時(shí)間圖。
圖8mu-EGF-CTB免疫動(dòng)物的免疫反應(yīng)的IgG和IgMELISA測(cè)定。
圖9hu-rec-EGF免疫動(dòng)物抗mu-EGF抗體(IgG)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(免疫記憶)。
X軸時(shí)間(無數(shù))Y軸抗體效價(jià)的反對(duì)數(shù)(平均值)圖10破傷風(fēng)類毒系與hu-rec-EGF結(jié)合效率的ELISA測(cè)定X軸結(jié)合物的稀釋度Y軸405nm波長(zhǎng)的光密度(OD405)圖11hu-rec-EGF/TT免疫非人靈長(zhǎng)動(dòng)物抗hu-rec-EGF抗體效價(jià)。
權(quán)利要求
1.結(jié)合在任何一種載體蛋白上的自身EGF疫苗組合物，它包括佐劑，能夠產(chǎn)生抗自身EGF的自身免疫反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有hu-rec-EGF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有載體蛋白CTB(霍亂毒素B)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有載體蛋白破傷風(fēng)類毒素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有作為載體蛋白的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有作為載體蛋白的腦膜炎球菌外膜蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有作為佐劑的氫氧化鋁。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)的疫苗組合物在惡性疾病治療方面的應(yīng)用。
9.哺乳動(dòng)物自身EGF在制備用于治療EGF相關(guān)疾病的疫苗方面的應(yīng)用。
全文摘要
該項(xiàng)發(fā)明提供了EGF和由EGF組成的疫苗組合物的新的應(yīng)用。尤其是，自身EGF或者其結(jié)段或者其衍生物被用作，抗EGF依賴性的腫瘤或者EGF依賴性疾病的免疫接種法。自身EGF能夠被很好地結(jié)合在載體蛋白，例如，破傷風(fēng)類毒素或者霍亂毒素B上。根據(jù)該項(xiàng)發(fā)明，該疫苗組合物通常包含一個(gè)免疫佐劑，如氫氧化鋁。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1142973SQ95115090
公開日1997年2月19日 申請(qǐng)日期1995年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月9日
發(fā)明者A·B·L·達(dá)維拉, G·G·馬諾羅, B·S·拉米里, I·B·德咖道, G·N·嗄多夫, E·S·比塔納 申請(qǐng)人:分子免疫中心