專利名稱：生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑的提取方法。
背景技術(shù)：
鼠李糖脂是由微生物產(chǎn)生的具有表面活性的兩親化合物，它與化學(xué)合成的表面活性劑相比，除具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液和發(fā)泡等相同特性外，其表面活性和乳化能力更強(qiáng)，還具有一般化學(xué)合成表面活性劑所不具備的無毒、易生物降解等特性，是一種有利于環(huán)境保護(hù)的綠色產(chǎn)品。鼠李糖脂的分子結(jié)構(gòu)類型多樣，具有許多特殊的官能團(tuán)，專一性強(qiáng)，可用于一些特殊領(lǐng)域。它在石油采收、環(huán)境修復(fù)、醫(yī)藥、化妝品、洗滌劑和食品等工業(yè)方面極具潛在的應(yīng)用價(jià)值。
然而，鼠李糖脂在微生物發(fā)酵液中的產(chǎn)量很低且發(fā)酵液成分復(fù)雜，其分離、提取和濃縮工藝不僅難度較大，還成為鼠李糖脂生產(chǎn)成本的主要部分，其費(fèi)用約占生產(chǎn)總成本的60％～70％。因而選擇合適的產(chǎn)物提取方法是保證生產(chǎn)工藝成功的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)的提取工藝一般包括了離心沉淀、氯仿-甲醇萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及硅膠柱層析等過程。對(duì)于大規(guī)模的生產(chǎn)來說，需要大量的氯仿做溶劑，在經(jīng)濟(jì)上是不合理的，而且氯仿是一種高毒性的有機(jī)氯化物，對(duì)人體和環(huán)境極具危害。生產(chǎn)的高成本和高毒性決定了鼠李糖脂大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用受到限制。
目前國內(nèi)對(duì)生物表面活性劑鼠李糖脂的研究，專利技術(shù)涉及較多的是如何提高鼠李糖脂的產(chǎn)率及具體應(yīng)用等。如微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑可以增強(qiáng)油類提取，某單位研制了一種鼠李糖脂生物表面活性劑，和其它表面活性劑復(fù)配，用于三次采油，平均采收率比水提高20％(專利申請(qǐng)?zhí)?9107581.1)。對(duì)于被油污染的海面或土壤，可加快油類的降解；還有用于對(duì)重金屬污染的土壤和地下水的修復(fù)等。有人研究了鼠李糖脂對(duì)土壤中多環(huán)芳烴的增溶及脫附作用，還有人研究了鼠李糖脂的發(fā)酵生產(chǎn)，旨在提高鼠李糖脂的含量，更好地應(yīng)用于生活垃圾堆肥處理中(專利申請(qǐng)?zhí)?3118042.6)。然而，由于鼠李糖脂存在于微生物的發(fā)酵液中，而且含量很低，如CN1275429A公開的鼠李糖脂的最大產(chǎn)量僅為25g/L；另一研究者公開的發(fā)酵液中鼠李糖脂的含量為30g/L～40g/L，但發(fā)酵液中成分復(fù)雜，分離提取較純的鼠李糖脂的工藝較為復(fù)雜，它的生產(chǎn)成本中有約為70-90％都要用在中下游提取及分離工藝上，因而，鼠李糖脂大規(guī)模的應(yīng)用就受到限制。研究提取鼠李糖脂簡單而有效的環(huán)保方法已引起不少學(xué)者的興趣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出一種生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝，它能有效降低鼠李糖脂的生產(chǎn)成本、顯著減少生產(chǎn)過程中對(duì)環(huán)境的危害，使其更好地投入實(shí)際應(yīng)用中。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，所述生物表面活性劑鼠李糖脂提取的工藝步驟為(1)取鼠李糖脂含量不低于28g/L的發(fā)酵液，將該發(fā)酵液在溫度為3.5℃-4.5℃條件下，以轉(zhuǎn)速為7800rpm-8200rpm離心18-22min除去菌體后，得上清液A；(2)在上清液A中按60mg/L-120mg/L的量加入硫酸銨后，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中靜置11h-13h，然后離心去除蛋白類沉淀物，得上清液B；
(3)將上清液B用0℃-4℃的冰食鹽水適當(dāng)稀釋去除蛋白類沉淀物后，放入3.5℃-4.5℃冰箱靜置，至殘存的油脂破乳凝聚于上清液表面后，將其輕輕刮去，得上清液C；(4)將上清液C的pH值調(diào)至2.0以下，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中靜置11h-13h，然后(5)將所得液體在3.5℃-4.5℃和7800rpm-8200rpm條件下離心25min-35min后，得淡黃色沉淀物，收集該沉淀物；(6)將收集到的淡黃色沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，即得到鼠李糖脂產(chǎn)品。
以下對(duì)本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。
上述步驟(1)至(3)為對(duì)原料鼠李糖脂發(fā)酵液的預(yù)處理，經(jīng)過這三個(gè)步驟的預(yù)處理后，發(fā)酵液中的細(xì)菌、殘油及蛋白類雜質(zhì)都得到了去除。
上述步驟(6)中的冷凍干燥可采用如下操作過程①將產(chǎn)品(淡黃色沉淀物)放入寬口燒杯中，于低溫冰箱(-30℃)中冷凍30分鐘；②將冷凍干燥機(jī)冷凍井的溫度調(diào)至-45℃；③將凍好的產(chǎn)品放在冷凍干燥機(jī)的托盤上，蓋上有機(jī)玻璃罩并檢查其氣密性；④開動(dòng)真空泵抽真空，干燥的時(shí)間為24～36小時(shí)。
做為本發(fā)明提取工藝所用原料的鼠李糖脂發(fā)酵液，可采用現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品，或采用已有技術(shù)制備。例如，所述鼠李糖脂發(fā)酵液可由以下途徑獲得1、菌種的活化及保藏從中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)購得銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCCAB93066，菌種經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接保藏在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基的成分見表1所示。斜面培養(yǎng)至菌體生長旺盛后(24～36h)，將試管口用牛皮紙塞包上，將斜面放入4℃的冰箱中保藏，保藏期為1～3個(gè)月，一般2個(gè)月傳代一次。傳代時(shí)先通過平板劃線分離獲得純培養(yǎng)菌，再將其接種在傳代斜面培養(yǎng)基上保存。
表1.傳代斜面培養(yǎng)基的成分

2.鼠李糖脂發(fā)酵液的生產(chǎn)按下列表2所示培養(yǎng)基配方配制種子培養(yǎng)液，取80mL于500mL三角燒瓶中滅菌，從保存的斜面接種P.A-AB93066(銅綠假單胞菌)于三角燒瓶中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)條件溫度37℃，pH值6.5，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘。
表2種子培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為粗制豆油100～120g/L，NaNO37.5～8.5g/L，KH2PO40.5～1.5g/L，Na2HPO4.12H2O 0.5～1.5g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.1g/L，MgSO4.7H2O0.1g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，pH7.0。按以上配方配置發(fā)酵培養(yǎng)液(不包括豆油)共1.8L，分別裝入8個(gè)1000mL的三角瓶中，因油類須單獨(dú)滅菌，所以豆油(須加15～20％的水)另分裝在8根大試管中，三角瓶和試管先用紗布封口，再包一層牛皮紙，并用棉線扎緊；用報(bào)紙包10mL移液管2根；將上述的三角瓶、大試管和移液管在滅菌鍋中滅菌，溫度控制在120-125℃之間，滅菌時(shí)間為30分鐘；用移液管從上述裝有種子培養(yǎng)液的500mL三角瓶中分別吸取7mL種子培養(yǎng)基(培養(yǎng)24h)，接入8個(gè)滅完菌的發(fā)酵培養(yǎng)液中。接種在超凈工作臺(tái)上完成，培養(yǎng)條件37℃，pH值7.0，并以250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為96小時(shí)，即得到所述鼠李糖脂發(fā)酵液，其中鼠李糖脂含量不低于28g/L。
按上述工藝生產(chǎn)的鼠李糖脂產(chǎn)品，通過液-質(zhì)聯(lián)用對(duì)樣品的分析表明，含有兩種結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂，分子量分別為650和504，分別為二鼠李糖脂和單鼠李糖脂。
鼠李糖脂產(chǎn)品的測定將經(jīng)過冷凍干燥的鼠李糖脂產(chǎn)品進(jìn)行高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用鑒定。高效液相色譜起到分離樣品的作用，為質(zhì)譜分析做準(zhǔn)備。樣品的鑒定在湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。具體的儀器及操作條件如下儀器名稱美國Thermo Finngan公司生產(chǎn)的型號(hào)為LCO Advantage的LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀色譜條件色譜柱Inertsil ODS-3柱(150mm×2.1mm×5μm)。進(jìn)樣量20μL，流動(dòng)相為乙腈1％醋酸水溶液。在不同的洗脫時(shí)段，流動(dòng)相的體積比不同。在0～15min內(nèi)乙腈1％醋酸的體積比為50∶50，在16～23min內(nèi)流動(dòng)相的體積比為100∶0，在24～30min內(nèi)流動(dòng)相的體積比又為50∶50。流速均為0.3mL/min。柱溫25℃，毛細(xì)管溫度為300℃。
質(zhì)譜條件電噴霧(ESI)源，負(fù)離子(NEG)檢測。質(zhì)譜掃描質(zhì)量數(shù)范圍300～1000m/z。
掃描結(jié)果見圖1-圖3。
對(duì)總質(zhì)譜圖的每個(gè)峰進(jìn)行逐個(gè)分析，得到time＝13.54min和16.32min的兩個(gè)峰的m/z符合鼠李糖脂的分子量規(guī)律，如圖2、圖3所示。在圖2和圖3中，被測物質(zhì)的m/z分別為650和503.9，對(duì)應(yīng)的分子量分別為650和504，分別為二鼠李糖脂和單鼠李糖脂的分子量。二鼠李糖脂和單鼠李糖脂的分子結(jié)構(gòu)式如圖4和圖5所示。
由圖1總質(zhì)譜圖的豐度可見，樣品的主要成分為二鼠李糖脂和單鼠李糖脂，且純度已很高，其中二鼠李糖脂約占60％。將提取后的鼠李糖脂進(jìn)行稱量，產(chǎn)量為28.3g/L，溶于水后其表面張力為29.48mN/m，臨界膠束濃度CMC為25mg/L。
本發(fā)明的技術(shù)原理是，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginose)經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后，產(chǎn)生了大量的鼠李糖脂，但發(fā)酵液中成分非常復(fù)雜，除鼠李糖脂外，還含有菌體、殘余的培養(yǎng)基成分以及蛋白化合物和蛋白質(zhì)乳化劑、中性脂、多糖等。由于鼠李糖脂在水溶液中呈酸性，只有當(dāng)溶液的pH值大于5時(shí)才能完全溶解，因此可以用酸沉淀法提取鼠李糖脂。但發(fā)酵液中的蛋白類物質(zhì)和殘余的豆油對(duì)鼠李糖脂的沉淀會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾作用。原因有兩個(gè)，第一，用酸沉淀法提取鼠李糖脂時(shí)，需將溶液的pH調(diào)至2.0以下，此時(shí)發(fā)酵液中的蛋白類物質(zhì)達(dá)到等電點(diǎn)從而產(chǎn)生沉淀，而鼠李糖脂卻不能有效的分離出來；第二，鼠李糖脂的表面活性使發(fā)酵液中的殘余豆油穩(wěn)定地分散于溶液中，與鼠李糖脂形成了穩(wěn)定的乳狀體系，從而妨礙鼠李糖脂的沉淀。本實(shí)驗(yàn)先通過離心除去菌體；利用硫酸銨能與蛋白類物質(zhì)產(chǎn)生沉淀的原理，在上清液中加入適量的硫酸銨再離心從而除去蛋白類物質(zhì)；加入冰鹽水(NaCl溶液)使殘存的豆油破乳凝聚于上清液表面，輕輕刮去殘油。經(jīng)過這三步預(yù)處理過程后，發(fā)酵液中的細(xì)菌、殘油及蛋白類雜質(zhì)都得到了去除。再將上清液的pH值調(diào)至2以下靜置12小時(shí)，然后以8000r/min離心，收集沉淀；將收集到的淡黃色沉淀物進(jìn)行冷凍干燥去除水份后就能得到鼠李糖脂產(chǎn)品。
由以上可知，本發(fā)明為一種生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝，即酸沉淀-冷凍提取法。同現(xiàn)有技術(shù)相比，它所具有的積極效果是，所得鼠李糖脂的最終產(chǎn)量高達(dá)28g/L以上，生產(chǎn)成本較用離心沉淀、氯仿-甲醇萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及硅膠柱層析等方法低一倍以上，而且本發(fā)明的生產(chǎn)過程沒有采用任何有害物質(zhì)，對(duì)人體和環(huán)境無危害，是一項(xiàng)低成本的綠色提取工藝，且操作工藝簡單，值得大力推廣。


圖1是鼠李糖脂樣品的總質(zhì)譜圖；圖2是二鼠李糖脂的質(zhì)譜圖；圖3是單鼠李糖脂的質(zhì)譜圖；圖4是單鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)式；圖5是二鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式
1.鼠李糖脂發(fā)酵液的制備1)將銅綠假單胞菌從斜面培養(yǎng)基接種至種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，500mL的三角燒瓶中裝種子培養(yǎng)液80mL。培養(yǎng)條件溫度37℃，時(shí)間24小時(shí)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘。
2)在每個(gè)1L發(fā)酵罐中裝入250mL以豆油為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種銅綠假單胞菌種子培養(yǎng)液7mL，培養(yǎng)條件37℃，用HCl或NaOH控制pH值為7.0，并以250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為96小時(shí)。得到每個(gè)發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)液約230mL，將所有的發(fā)酵罐中的發(fā)酵液收集在一起。
注傳代斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基的配方見表1和表2所示，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為粗制豆油120g/L，NaNO38.0g/L，KH2PO41.0g/L，Na2HPO4.12H2O 1.0g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.1g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，pH7.0。
2.鼠李糖脂發(fā)酵液的預(yù)處理取出培養(yǎng)96小時(shí)后的發(fā)酵液，將發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘、溫度為4℃時(shí)離心20分鐘除去菌體，離心后取上清液。上清液加入80mg/L的硫酸銨后放入4℃的冰箱中靜置12小時(shí)，再離心去除蛋白類沉淀物。用適量的冰鹽水(NaCl溶液)稀釋已去除蛋白類沉淀物的上清液(濃度為10％的冰鹽水的體積取發(fā)酵液體積的0.2倍)，放入4℃冰箱靜置8小時(shí)，待殘存的豆油破乳凝聚于上清液表面，輕輕刮去殘油。經(jīng)過這三步預(yù)處理過程后，發(fā)酵液中的細(xì)菌、殘油及蛋白類雜質(zhì)都得到了去除。
3.鼠李糖脂的提取將經(jīng)過預(yù)處理后的上清液的pH值調(diào)至2.0以下，放入4℃的冰箱中靜置12小時(shí)；再將發(fā)酵液在4℃和8000r/min的條件下離心30分鐘并收集沉淀；將收集到的淡黃色沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，得到鼠李糖脂產(chǎn)品。
冷凍干燥的具體操作過程如下①將產(chǎn)品放入寬口燒杯中，于低溫冰箱(-30℃)中冷凍30分鐘；②將冷凍干燥機(jī)冷凍井的溫度調(diào)至-45℃；③將凍好的產(chǎn)品放在冷凍干燥機(jī)的托盤上，蓋上有機(jī)玻璃罩并檢查其氣密性；④開動(dòng)真空泵抽真空，干燥的時(shí)間為24～36小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝，其特征在于，其工藝步驟為(1)取鼠李糖脂含量不低于28g/L的發(fā)酵液，將該發(fā)酵液在溫度為3.5℃-4.5℃條件下，以轉(zhuǎn)速為7800rpm-8200rpm離心18-22min除去菌體后，得上清液A；(2)在上清液A中按60mg/L-120mg/L的量加入硫酸銨后，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中靜置11h-13h，然后離心去除蛋白類沉淀物，得上清液B；(3)將上清液B用0℃-4℃的冰食鹽水適當(dāng)稀釋去除蛋白類沉淀物后，放入3.5℃-4.5℃冰箱靜置，至殘存的油脂乳凝聚于上清液表面后，將其輕輕刮去，得上清液C；(4)將上清液C的pH值調(diào)至2.0以下，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中靜置11h-13h，然后(5)將所得液體在3.5℃-4.5℃和7800rpm-8200rpm條件下離心25min-35min后，得淡黃色沉淀物，收集該沉淀物；(6)將收集到的淡黃色沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，即得到鼠李糖脂產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明為生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝。其步驟為將鼠李糖脂發(fā)酵液在約4℃時(shí)以轉(zhuǎn)速約8000rpm離心除去菌體后，按60mg/L－120mg/L的量加入硫酸銨，放入約4℃的冰箱中靜置約10h，離心去除蛋白類沉淀物；用冰食鹽水適當(dāng)稀釋去除蛋白類沉淀物后的上清液，放入約4℃冰箱靜置，至殘存的油脂破乳凝聚于上清液表面后，將其輕輕刮去；將溶液pH值調(diào)至2以下，放入約4℃的冰箱中靜置約10h；在約4℃和8000rpm條件下離心約30min后，將收集到的淡黃色沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，即得到鼠李糖脂產(chǎn)品。本提取工藝具有生產(chǎn)成本低、對(duì)環(huán)境無危害的特點(diǎn)，且提取率高。
文檔編號(hào)E21B43/16GK1974589SQ200610136880
公開日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者施周, 馬滿英, 吳星杰 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)