專利名稱:對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制備方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制備方 法,屬于新材料領域。
背景技術:
四環(huán)素類藥物是由鏈霉菌產生或經(jīng)半合成制取的一類堿性廣譜抗生素,可用于防 止禽畜病害,促進幼年禽畜生長,因此作為獸藥被廣泛的應用。但是,不合理地使用該類藥 物,如用藥劑量過大、用藥時間過長、濫用藥物及不遵守休藥期提前屠宰等,導致該類藥物 及其代謝產物殘留于動物的肌肉、蛋、奶、臟器組織中。人類長期攝入含四環(huán)素類抗生素殘 留的食品后,藥物不斷在體內蓄積,當濃度達到一定量后,就會對人體產生毒性作用,主要 表現(xiàn)為對胃、腸、肝臟的損害及牙齒的染色等,還會造成過敏反應,二重感染,致畸胎作用, 對人類的健康構成潛在的危害。因此,世界食品法典委員會對禽肉中四環(huán)素類抗生素殘留 有嚴格的限量要求,國際貿易中對其限量也有嚴格規(guī)定。因此,開展食品中四環(huán)素類抗生素 的殘留檢測具有十分重要的現(xiàn)實意義。然而,傳統(tǒng)的檢測方法主要依靠固相萃取技術,但是傳統(tǒng)固相萃取吸附劑與目標 物之間的作用力是非特異性的,通常需對萃取和洗脫條件進行仔細選擇,因而對不同基質 的分離與分析需要選擇不同的柱填料,從而限制了固相萃取技術的進一步發(fā)展。為了提高 柱效與重現(xiàn)性、擴大其應用領域,亟待開發(fā)研制出新型高選擇性識別能力填料基質。分子印 跡聚合物以其對模板分子特異性的吸附,已成為當前樣品前處理中濃縮和凈化的首選。吳 平谷等以鹽酸四環(huán)素為模板分子制備了一種四環(huán)素分子印跡聚合物并制備了一種特異性 吸附四環(huán)素固相萃取柱(專利申請?zhí)?200710070753)。張大兵等同樣以鹽酸四環(huán)素為模 板分子制備了一種四環(huán)素分子印跡聚合物用于水樣品中四環(huán)素的直接進化處理(專利申 請?zhí)?00810202645)。然而這些分子印跡聚合物只具有一種模板分子,且只對四環(huán)素這種 單一物質具有特異性的吸附能力。在實際檢測工作中,食品中含有多種四環(huán)素類抗生素的 殘留,涉及土霉素、四環(huán)素、去甲金霉素、金霉素、強力霉素、4-差向土霉素、4-差向四環(huán)素、 4-差向金霉素、二甲胺四環(huán)素和甲烯土霉素等10種獸藥的殘留檢測。僅特異性識別四環(huán)素 的分子印跡聚合物難以滿足實際工作的需要,亟待開發(fā)研制出一種對四環(huán)素一族均有特異 性識別能力的的分子印跡聚合物,實現(xiàn)對10種四環(huán)素類抗生素的特異性識別。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于彌補上述現(xiàn)有技術的不足,提供一種對四環(huán)素一族具有特異性 識別能力的分子印跡聚合物的制備方法,該方法采用雙模板分子,操作簡單,制備出的分子 印跡聚合物對10種四環(huán)素類抗生素具有特異性的吸附,能夠快速、靈敏、準確、高效地將樣 品中的四環(huán)素類抗生素殘留物進行富集凈化。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的
一種對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制備方法,包括以下 步驟(1)以摩爾比為5 5 9 1的金霉素和土霉素為模板分子,以四乙烯吡啶或甲 基丙烯酸為功能單體,N, N’ _亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑,偶氮二異丁腈為引發(fā)劑,將模板 分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶于乙腈中,使模板分子在乙腈中的濃度為0. 1 lmol/ L,模板分子與功能單體的摩爾比為1 1 1 10,功能單體交聯(lián)劑引發(fā)劑的摩爾比 為1 1 10 0. 01 0. 1,得到混合液;(2)將混合液密封后,于45 60°C攪拌條件下充分反應,生成印跡聚合物;(3)以乙酸的甲醇溶液為提取液,對印跡聚合物進行提取以去除模板分子,再用甲 醇或乙腈提取去除乙酸分子,最后將印跡聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重,得到對四 環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物。步驟(1)中所述功能單體為甲基丙烯酸。步驟(2)中是將混合液超聲脫氣5 lOmin,再通氮氣5 lOmin除去氧分子后密封。步驟(3)中所述乙酸的甲醇溶液中,乙酸的體積百分比濃度為10 30%,最佳為 10% ;所述提取方法為索氏提取。上述方法的最佳制備條件為將金霉素、土霉素、甲基丙烯酸、N, N’ -亞甲基雙丙 烯酰胺和偶氮二異丁腈溶于乙腈中,使金霉素和土霉素在乙腈中的總濃度為lmol/L,金霉 素、土霉素、甲基丙烯酸、N,N’_亞甲基雙丙烯酰胺和偶氮二異丁腈的摩爾比為lmmol 1mm ol 8mmol 40mmol 0. 08mmol,得到混合液;將混合液密封后,于50°C攪拌條件下反應18 小時。模板分子的結構通常是影響分子印跡聚合物制備的最關鍵因素。土霉素、四環(huán)素、 去甲金霉素、金霉素、強力霉素、4-差向土霉素、4-差向四環(huán)素、4-差向金霉素、二甲胺四環(huán) 素和甲烯土霉素這10種四環(huán)素類抗生素的結構差異主要體現(xiàn)在C-5位、C-6位和C-7位上。 土霉素C-5位是羥基、C-6位羥基;四環(huán)素僅C-6位是羥基;金霉素C-6位是羥基、C-7位是 氯離子;強力霉素僅C-5位是羥基。由于羥基可以和功能單體上的羧基形成較強的氫鍵,而 氯離子可以形成較弱的氫鍵,因此,土霉素和金霉素分子印跡聚合物的選擇性因子較好,特 異性識別能力較高。然而,土霉素本身容易降解(降解率為38% ),導致C-5位上羥基消失, 因此,以單一土霉素為模板的分子印跡聚合物對土霉素及其同分異構體的特異性識別能力 較弱。本發(fā)明的結果表明土霉素和金霉素共同作為模板時,一方面充分利用了分子結構上 的活性基團(C5-0H,C6-0H, C7-C1),提高分子印跡聚合物的特異性吸附能力;另一方面可 以有效地抑制土霉素的降解(降解率僅為12% ),提高分子印跡聚合物對土霉素及其同分 異構體的特異性吸附,最終實現(xiàn)對四環(huán)素一族的特異性識別。此外,商品化的固相萃取柱(如HLB柱和C18柱)對目標物的吸附是非特異性的, 在去除雜質的同時容易洗掉目標物,因而難以兼顧凈化效果和回收率。本發(fā)明的分子印跡 聚合物對目標物的吸附是特異性的,能夠獲得較好的凈化效果和回收率。綜上所述,與現(xiàn)有技術相比,本發(fā)明具有以下優(yōu)點本發(fā)明方法是以金霉素和土霉素作為模板分子,操作簡單,且制備出的分子印跡 聚合物對四環(huán)素一族如土霉素、四環(huán)素、去甲金霉素、金霉素、強力霉素、4-差向土霉素、
44_差向四環(huán)素、4-差向金霉素、二甲胺四環(huán)素和甲烯土霉素等均具有特異性識別能力,實 現(xiàn)對食品中上述10種四環(huán)素類抗生素特異性的吸附,能夠快速、靈敏、準確、高效地將樣品 中的四環(huán)素類抗生素殘留物進行富集凈化、且具有回收率高、重現(xiàn)性好和靈敏度高的優(yōu)點, 與常見的C18、HLB吸附劑相比,對待測組分具有極好的吸附和回收效果。
圖1是實施例1所得分子印跡聚合物放大2000倍的掃描電鏡(SEM)圖。圖2是以不同模板分子制備的分子印跡聚合物對四環(huán)素一族的選擇性評價結 果圖;a. 土霉素;b.四環(huán)素;c.去甲金霉素;d.金霉素;e.強力霉素;f. 4-差向土霉素; g. 4-差向四環(huán)素;h. 4-差向金霉素;i. 二甲胺四環(huán)素;j.甲烯土霉素。圖3是以本發(fā)明的分子印跡聚合物制備的分子印跡柱(MIP)測定蜂蜜中四環(huán)素類 抗生素殘留(濃度均為IP g/kg)的液相色譜圖。圖4是以商品化HLB柱測定蜂蜜中四環(huán)素類抗生素殘留(濃度均為IP g/kg)的 液相色譜圖。圖5是以商品化C18柱測定蜂蜜中四環(huán)素類抗生素殘留(濃度均為1 P g/kg)的 液相色譜圖。圖3、4和5中,1. 土霉素;2.四環(huán)素;3.金霉素;4.強力霉素。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明,但本發(fā)明的保護范圍不局限于以 下實施例。實施例1 將lmmol金霉素和lmmol 土霉素作為模板分子,與8mmol功能單體甲基丙烯酸溶 解于2mL含有40mmol交聯(lián)劑N,N’ -亞甲基雙丙烯酰胺和0. OSmmol引發(fā)劑偶氮二異丁腈 的乙腈中,制備成混合液;將混合液超聲脫氣6min,通氮氣5min除去氧分子,然后將混合液 密封,在50°C攪拌條件下聚合反應18h,生成白色粉末狀印跡聚合物。聚合完成后,用乙酸 和甲醇的混合溶液100mL(其中乙酸的體積百分比濃度為10% ),采用索式提取的方式,對 上述白色粉末狀印跡聚合物進行提取以去除模板分子,接著再用甲醇采用索氏提取方式提 取去除乙酸分子。提取結束后,將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重,最后得到對四環(huán)素 一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物,其SEM圖見圖1。實施例2 將lmmol金霉素和lmmol 土霉素作為模板分子,與2mmol功能單體甲基丙烯酸,溶 解到2mL含有2mmol N,N’_亞甲基雙丙烯酰胺和0. 02mmol引發(fā)劑偶氮二異丁腈的乙腈中, 制備成混合液;將混合液超聲脫氣5min,通氮氣lOmin除去氧分子,然后將混合液密封,在 45°C攪拌條件下聚合反應12h,生成白色粉末狀印跡聚合物。聚合完成后,用乙酸和甲醇的 混合溶液100mL(其中乙酸的體積百分比濃度為10% ),采用索式提取的方式,對上述白色 粉末狀印跡聚合物進行提取以去除模板分子,然后再用甲醇提取去除乙酸分子。提取結束 后,將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重,最后得到對四環(huán)素一族具有特異性識別能力 的分子印跡聚合物。
實施例3 將lmmol金霉素和lmmol 土霉素作為模板分子,與20mmol功能單體甲基丙烯酸, 溶解到20mL含有200mmol N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺和2mmol引發(fā)劑偶氮二異丁腈的乙 腈中,制備成混合液;將混合液超聲脫氣lOmin,通氮氣lOmin除去氧分子,然后將混合液密 封,在60°C攪拌條件下聚合反應24h,生成白色粉末狀印跡聚合物。聚合完成后,用乙酸和 甲醇的混合溶液lOOmL(其中乙酸的體積百分比濃度為20% ),采用索式提取的方式,對上 述白色粉末狀印跡聚合物進行提取以去除模板分子,然后再用甲醇提取去除乙酸分子。提 取結束后,將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重,最后得到對四環(huán)素一族具有特異性識 別能力的分子印跡聚合物。實施例4:將1. 8mmol金霉素和0. 2mmol 土霉素作為模板分子,與8mmol功能單體甲基丙烯 酸,溶解到2mL含有8mmol N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺和0. OSmmol引發(fā)劑偶氮二異丁腈的 乙腈中,制備成混合液;將混合液超聲脫氣6min,通氮氣5min除去氧分子,然后將混合液密 封,在50°C攪拌條件下聚合反應18h,生成白色粉末狀印跡聚合物。聚合完成后,用乙酸和 甲醇的混合溶液100mL(其中乙酸的體積百分比濃度為10% ),采用索式提取的方式,對上 述白色粉末狀印跡聚合物進行提取以去除模板分子,然后再用甲醇提取去除乙酸分子。提 取結束后,將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重,最后得到對四環(huán)素一族具有特異性識 別能力的分子印跡聚合物。實施例5 將1. 8mmol金霉素和0. 2mmol 土霉素作為模板分子,與20mmol功能單體四乙烯吡 啶,溶解到2mL含有40mmol N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺和0. 8mmol引發(fā)劑偶氮二異丁腈的 乙腈中,制備成混合液;將混合液超聲脫氣lOmin,通氮氣lOmin除去氧分子,然后將混合液 密封,在60°C攪拌條件下聚合反應24h,生成白色粉末狀印跡聚合物。聚合完成后,用乙酸 和甲醇的混合溶液100mL(其中乙酸的體積百分比濃度為30% ),采用索式提取的方式,對 上述白色粉末狀印跡聚合物進行提取,以去除模板分子,然后再用純甲醇提取去除乙酸分 子。提取結束后,將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重,最后得到對四環(huán)素一族均有特異 性識別能力的分子印跡聚合物。將本發(fā)明所得分子印跡聚合物,和在相同條件下以土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力 霉素、土霉素/四環(huán)素為模板分子制得的分子印跡聚合物分別填充入液相色譜空柱中,測 定土霉素、四環(huán)素、去甲金霉素、金霉素、強力霉素、4-差向土霉素、4-差向四環(huán)素、4-差向 金霉素、二甲胺四環(huán)素和甲烯土霉素的保留時間,評價六種分子印跡聚合物對上述10種四 環(huán)素類抗生素特異性的吸附能力。液相色譜條件為甲醇為流動相,流速為lmL/min ;檢測 波長為350nm ;柱溫為30°C。印跡因子定義為I = kMIP/kNIP,其中kMIP和kNIP分別為10種四 環(huán)素類抗生素在分子印跡聚合物(MIP)和空白對照(NIP,制備方法和四環(huán)素分子印跡聚合 物類似,只是不加入模板分子)的保留因子。而保留因子k= (t-、)/、,其中t和、分別為 10種四環(huán)素類抗生素和丙酮(作為空白對照,測定死時間)的保留時間。其結果表明(見 圖2)以土霉素為模板的分子印跡聚合物對土霉素的特異性吸附能力較弱反而對其他9種 四環(huán)素類抗生素吸附能力最高;而分別以金霉素和四環(huán)素為模板的分子印跡聚合物對土霉 素的吸附效果相對較好;分別與以土霉素和四環(huán)素為模板的分子印跡聚合物相比,以土霉素/四環(huán)素為模板的分子印跡聚合物對土霉素的吸附效果較好,但對四環(huán)素、去甲金霉素 和4-差向四環(huán)素的吸附效果相對較弱;而以金霉素/ 土霉素為模板的分子印跡聚合物對 10種抗生素的吸附能力均高于前面五種分子印跡聚合物,可以實現(xiàn)對四環(huán)素一族的特異性 識別。 將濃度均為IP g/kg常見的土霉素(0TC)、四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、強力霉素 (D0X)添加到陰性蜂蜜樣品中,分別通過商品化的HLB柱、C18柱和以本發(fā)明的分子印跡聚 合物制備的分子印跡柱(MIP)凈化和富集后,采用液相色譜測定蜂蜜中四種抗生素的殘留 (分別見圖3、圖4和圖5)。結果表明HLB柱的凈化效果較好,但回收率偏低;C18柱的回 收率較好,但凈化效果較差;以本發(fā)明的分子印跡聚合物制備的MIP柱不僅具有很好的凈 化效果、而且獲得了較高的回收率,實現(xiàn)了對四環(huán)素一族的特異性吸附。
權利要求
一種對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制備方法,其特征在于包括以下步驟(1)以摩爾比為5∶5~9∶1的金霉素和土霉素為模板分子,以四乙烯吡啶或甲基丙烯酸為功能單體,N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑,偶氮二異丁腈為引發(fā)劑,將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶于乙腈中,使模板分子在乙腈中的濃度為0.1~1mol/L,模板分子與功能單體的摩爾比為1∶1~1∶10,功能單體∶交聯(lián)劑∶引發(fā)劑的摩爾比為1∶1~10∶0.01~0.1,得到混合液;(2)將混合液密封后,于45~60℃攪拌條件下充分反應,生成印跡聚合物;(3)以乙酸的甲醇溶液為提取液,對印跡聚合物進行提取以去除模板分子,再用甲醇或乙腈提取去除乙酸分子,最后將印跡聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重,得到對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物。
2.根據(jù)權利要求1所述的對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制 備方法,其特征在于步驟(1)中所述功能單體為甲基丙烯酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制 備方法,其特征在于步驟(2)中是將混合液超聲脫氣5 lOmin,再通氮氣5 lOmin除 去氧分子后密封。
4.根據(jù)權利要求1所述的對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制 備方法,其特征在于步驟(3)中所述乙酸的甲醇溶液中,乙酸的體積百分比濃度為10 30%。
5.根據(jù)權利要求1或4所述的對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物 的制備方法,其特征在于步驟(3)中所述乙酸的甲醇溶液中,乙酸的體積百分比濃度為 10%。
6.根據(jù)權利要求1所述的對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制 備方法,其特征在于步驟(3)中所述提取方法為索氏提取。
7.根據(jù)權利要求1所述的對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制 備方法,其特征在于將金霉素、土霉素、甲基丙烯酸、N,N’ -亞甲基雙丙烯酰胺和偶氮二異 丁腈溶于乙腈中,使金霉素和土霉素在乙腈中的總濃度為lmol/L,金霉素、土霉素、甲基丙 烯酸、N,N,_亞甲基雙丙烯酰胺和偶氮二異丁腈的摩爾比為lmmol 1謹ol 8謹ol 40_o 1 0. OSmmol,得到混合液;將混合液密封后,于50°C攪拌條件下反應18小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對四環(huán)素一族具有特異性識別能力的分子印跡聚合物的制備方法。該方法是將金霉素、土霉素金霉素、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑按一定比例溶解于乙腈中,混合后密封進行聚合,然后將生成的聚合物先用甲醇和乙酸的混合溶液進行提取去除模板分子,再用甲醇提取去除乙酸,最后真空干燥。本發(fā)明方法操作簡單,制備出的分子印跡聚合物對四環(huán)素一族均有特異性識別能力,能夠快速、靈敏、準確、高效地將樣品中的四環(huán)素類抗生素殘留物進行富集凈化、且具有回收率高、重現(xiàn)性好和靈敏度高的優(yōu)點。
文檔編號B01J20/285GK101857664SQ20101020413
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權日2010年6月21日
發(fā)明者王鵬, 胡小鐘, 荊濤 申請人:湖北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心