專利名稱：用于從食品中提取組分的分子印跡聚合物的制作方法
用于從食品中提取組分的分子印跡聚合物
本申請是申請日為2004年1月29日、申請?zhí)枮?00480003094. 2 的中國專利申請的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及能在水或含水介質(zhì)中選擇性地結(jié)合靶分子，如核黃素 或其類似物的一類新型的與水相容的分子印跡聚合物(AquaMIP),并涉 及其合成和其在食品加工和提取或分離工藝中的用途。
背景技術(shù)：
在醫(yī)療、飲食、環(huán)境和化學科學中，對于從相關(guān)物質(zhì)的復雜混合 物中選擇性地分離特定的物質(zhì)存在日益增長的需求。目標是變化的； 它可以是一種或多種特定化合物的制備性分離，或者其濃度的測量， 或者從多組分混合物中選擇性地除去目標化合物。
核黃素(維生素B2), —種水相容維生素，對人類膳食來說是重要 的，它是決定氧化還原反應的輔酶-黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黃素 單核苷酸(FMN)的主要組分。在肝臟(3. 5mg/100g)、奶酪 (0. 5mg/100g)、牛奶(0. 15mg/100g)和嘩酒(約200 pg/L)中可發(fā)現(xiàn)它。 盡管核黃素對熱和酸性pH相對穩(wěn)定，但它在堿和光存在下分解成光黃 素， 一種有助于維生素C分解的較強的氧化劑。在硫源存在下，核黃 素的光還原造成苦異oc-酸(bitter iso-alpha acid)分解，這導致暴 露于陽光下的白酒、香檳、牛奶和啤酒公知的"曬過(sun-struck)" 的味道。為了防止形成這種非所需的味道，在啤酒和白酒的情況下， 這些產(chǎn)品優(yōu)選儲存在暗色且不透光的瓶子內(nèi)，或者在牛奶的情況下， 優(yōu)選儲存在塑料/紙包裝內(nèi)。對于缺少核黃素的產(chǎn)品來說，這些措施是 不需要的。
因此，在不影響其組成的情況下，從復雜的基體內(nèi)選擇性地除去 核黃素的方法是令人感興趣的。M. G. Duyvis 等在 "J. Agric. Food.Chem. " (2002， Vol. 50，笫1548-1552頁)和C. Laane等在"J. Inst. Brew." (1999， Vol. 105，第392頁)中提出以親合分離 模式使用核黃素結(jié)合蛋白質(zhì)。然而，所提出的工序極強地受到與穩(wěn)定 性和成本相關(guān)的問題的局限，這嚴重地降低了這些工序的可行性。
代替地，在這一點上，在不影響其組成的情況下，使用能從復雜 的基體中除去核黃素的穩(wěn)定聚合物材料可能更加有用。能顯示出這種 性能的材料從而在提高相關(guān)食品和飲料產(chǎn)品的穩(wěn)定性和質(zhì)量方面具有 重要的應用。此外，可使用這種材料在定量分析之前從復雜的基體中 富集并分離黃素，或者作為化學傳感器內(nèi)的識別元件。
一類這樣的材料是已知稱為"分子印跡聚合物(MIP)"的一類，它 可使用分子印跡技術(shù)來制備。
制備分子印跡聚合物(MIP)最廣泛使用的方案(下稱"常規(guī)技術(shù)或 工序")需要下述關(guān)鍵步驟
(i) 在低極性的非質(zhì)子溶劑中，使靶或模板分子，或者其結(jié)構(gòu)類似 物("T"),與所選擇的功能性單體("M")接觸并相互作用，形成非 共價締合的模板-單體組件，
(ii) 使模板-單體組件與交聯(lián)劑或單體("M-M")共聚，從而形成 交聯(lián)的多孔網(wǎng)絡聚合物(也稱為聚合物基體)，
(iii) 從聚合物基體中提取靶或模板("T")，從而使所制得的MIP 具有相應的結(jié)合位點。
在MIP上的這些結(jié)合位點能以高的親合性和選擇性選擇性地再結(jié) 合相應的靼或模板分子，或近似結(jié)構(gòu)的類似物。這些位點的結(jié)合選擇 性常常與抗體-抗原的互補性相當。
在以上所述的常規(guī)技術(shù)中，典型地在步驟(iii)(提取模板)之前粉 碎并篩分MIP,以獲得粒狀材料的所需尺寸部分。然后它們可填充在 色鐠柱內(nèi)，并用于從具有類似結(jié)構(gòu)或官能度的混合物的其它組分中色 譜分離模板。分析以及制備應用是可能的。在制備應用中，其目的可 以是分離或除去特定的化合物?？衫缤ㄟ^親合色譜的工序進行制備 應用，其中可使用或者PH、離子強度或者溶劑梯度或所述參數(shù)的結(jié)合 來控制與固定相相互作用的強度。典型地使粗混合物流經(jīng)MIP的填充床，借此待除去或分離的化合物選擇性地保留在MIP上。隨后，在再 生步驟中從MIP中釋放該化合物。在調(diào)節(jié)步驟之后，MIP準備再次利 用。
以膜形式(membrane formatH吏用MIP是另 一種可選擇的方案，該 方案通過允許較快速的分離和連續(xù)生產(chǎn)純化合物的可能性而提供優(yōu) 點。
或者，可以所謂的"間歇形式(batch format)"進行分離，其中 MIP在粗混合物內(nèi)懸浮被認為足以發(fā)生化合物的選擇性吸附的一段時 間。之后可如上所述進行再生。
MIP在例如氨基酸衍生物、肽、膦酸酯、包括p-阻斷(blocking) 化合物的氨基醇和許多手性藥物的手性分離方面顯示出前景。
此外，在親合色鐠(參見，例如Y.Yu等，"Biotechnology and Bioengineering" ， 2002， Vol. 79，第23-28頁)、化學傳感(參見，例 如K. Haupt等，"Chem. Rev. ，， ， 2000， Vol.100,第2495-2504頁) 和在小的靼分析物的免疫測定中用作抗體的替代品方面(參見，例如 L.Ye等，"J.Am.Chem. Soc. " ， 2001， Vol. 123，第2901-2902頁)， 可看到涉及MIP的有前景的開發(fā)。專利文獻揭示出在所有這些提及的 應用中該材料可找到商業(yè)用途。
在常規(guī)工序中，在稱為生孔劑的成孔溶劑存在下進行聚合工藝。 為了穩(wěn)定功能性單體和模板之間的靜電相互作用，所選的生孔劑通常 是具有低到中度極性的非質(zhì)子溶劑。目前所使用的大多數(shù)模板在這種 溶劑中顯示出中到高的溶解度(下稱"常規(guī)溶劑")，因此可以使用常 規(guī)工序?qū)@些模板或其結(jié)構(gòu)類似物進行印跡。
另一方面，以上所述的常規(guī)工序?qū)τ谟H水性靶或模板來說是不可 能的，所述親水性靶或模板包括大多數(shù)生物學上令人感興趣的分子。 對于這類靶或模板分子來說，現(xiàn)有的印跡技術(shù)與兩個主要的問題相關(guān)。
第 一個問題涉及這種靶在常規(guī)溶劑內(nèi)的有限的溶解度。
核黃素或其類似物(例如FAD、 FMN)屬于一類水溶性維生素，并在 分子印跡技術(shù)典型使用的低極性到非極性的有機溶劑中顯示出最小到零的溶解度。因此不可能使用核黃素自身作為常規(guī)MIP合成技術(shù)中的 模板。
第二個問題涉及當使用常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)的MIP在水中用作吸附劑時， 出現(xiàn)非特異性的疏水性結(jié)合。由于基體單體的疏水特性，因此當在純
的含水介質(zhì)中使用該材料時，大多數(shù)靶非特異性地吸附到聚合物表面 上。
因此必須尋找抑制這種非特異性結(jié)合的措施。為了獲得能從富水 介質(zhì)中強烈且特異性地吸附或結(jié)合親水性生物分子，例如核黃素或其 類似物的MIP吸附劑，必須尋找可導致(1)在水中能結(jié)合靶或模板分子 的印跡位點和(2)抑制非特異性結(jié)合的方法。
為了獲得能在水中結(jié)合模板的印跡位點，滿足下述標準的核黃素 類似物可用作模板，即(a)在常規(guī)溶劑中可溶，(b)在聚合反應條件下 穩(wěn)定，(c)具有與核黃素接近的結(jié)構(gòu)和形狀的相似，從而導致能在含水 介質(zhì)中容納核黃素的印跡位點。
發(fā)明概述
本發(fā)明因此涉及能在水或含水介質(zhì)中選擇性地結(jié)合靶分子的新型 的與水相容的分子印跡聚合物("AquaMIP")。
本發(fā)明進一步涉及能在水或含水介質(zhì)中選擇性地結(jié)合靶的新型 AquaMIP，它可通過包括下述步驟的方法獲得
(a) 提供選擇的靶或模板的結(jié)構(gòu)類似物，
(b) 在含有選擇的自由基引發(fā)劑的合適的聚合介質(zhì)或溶劑中，提供 一種或多種選擇的功能性單體和一種或多種選擇的交聯(lián)劑，
(c) 在所述靶或模板的類似物存在下，使所述一種或多種功能性單 體和所述一種或多種交聯(lián)劑在所述聚合介質(zhì)中共聚，
(d) 通過溶劑萃取或通過光化學方法除去所述模板類似物，
(e) 獲得分子印跡聚合物(AquaMIP)，
(f) 任選地對所述AquaMIP進行后改性("親水化")，以減少非特 異性的疏水性結(jié)合。在具體的方案中，本發(fā)明提供用于分子識別和結(jié)合二酰亞胺或含
二酰亞胺的化合物，如節(jié)基尿嘧啶、核黃素或其類似物的AquaMIP。 為結(jié)合核黃素而設計的這種AquaMIP因此能在含水條件下，如在液體 食品和飲料(如啤酒)中占主導的那些條件下，選擇性地結(jié)合核黃素。
此外，在這樣具體的方案中，本發(fā)明提供新型的分子印跡聚合物， 它能在水或含水介質(zhì)中結(jié)合二酰亞胺(imide)或含二酰亞胺的化合物， 如節(jié)基尿嘧啶、核黃素或其類似物，它可通過包括下述步驟的方法獲 得
(a) 提供選擇的二酰亞胺或含二酰亞胺的靶或模板的結(jié)構(gòu)類似物，
(b) 在含有選擇的自由基引發(fā)劑的合適的聚合介質(zhì)或溶劑中，提供 一種或多種選擇的功能性單體和一種或多種選擇的交聯(lián)劑，
(c) 在所述二酰亞胺或含二酰亞胺的模板類似物存在下，使所述一 種或多種功能性單體和所述一種或多種交聯(lián)劑在所述聚合介質(zhì)中共 聚，
(d) 通過溶劑萃取或通過光化學方法除去所述二酰亞胺或含二酰 亞胺的模板類似物，
(e) 獲得分子印跡聚合物(AquaMIP)，
(f) 任選地對所述AquaMIP進行后改性("親水化，，)，以減少非特 異性的疏水性結(jié)合。
在進一步的方面中，本發(fā)明提供使用核黃素的結(jié)構(gòu)類似物獲得的 AquaMIP，它能在水或含水介質(zhì)中結(jié)合核黃素及其衍生物。這些包括例 如核黃素四羧酸酯，它可藉助糖羥基與鏈烷酸酸肝的簡單的一步酯化 反應來合成。
本發(fā)明還提供使用功能性單體的AquaMIP，所述功能性單體含有給 體 一 受體—給體(DAD)氫鍵特征，在此處將其定義為包括吡啶-和嘧啶-基的單體。 一些實例是對二酰亞胺顯示出強結(jié)合性的2，6-雙(丙烯酰 氨基)吡啶(BAAPy)，或一類嘧啶基單體如2， 4-雙(丙烯酰氨基)嘧啶。 這些單體基于圖2C(A)所示通式結(jié)構(gòu)的6-取代的2，4-雙(酰氨基)嘧啶 (其中R!可以是任何基團，但優(yōu)選"-NC^。" ； R2和113可以是任何基團，但優(yōu)選"-CH-CH2")。 一個實例是圖2C(B)所示的2，4-雙(丙烯酰氨 基)-6-哌啶子基-嘧啶。另 一實例是2， 4-雙(曱基丙烯酰氨基)-6-哌啶 子基-嘧啶(其中R!可以是任何基團，但優(yōu)選--NC晶。；R2和R3可以是任 何基團，但優(yōu)選"-C(CH3)=CH2")。
在又一方面中，本發(fā)明涉及抑制非特異性結(jié)合所使用的兩種不同 方法。
第一種方法是基于添加親水性共聚單體如甲基丙烯酸2-羥基乙酯 (HEMA)、 N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甘油-l-丙烯 酸酯或甘油-l-甲基丙烯酸酯到單體混合物內(nèi)的工序?；蛘撸摴ば蛞?可利用同樣在聚合/共聚反應開始時，添加可水解的交聯(lián)單體如季戊四 醇三丙烯酸酯(PETRA)、亞甲基二丙烯酰胺或亞乙基二曱基丙烯酰胺到 單體混合物中。這些親水性單體在水解之后產(chǎn)生極性官能團并賦予聚 合物基體更多的親水性特征，從而導致降低了非特異性的疏水性驅(qū)動 的結(jié)合。
第二種方法是后改性并從而在合成之后對MIP表面進行"親水化" 的工序。該方法基于使用含有可水解官能團的交聯(lián)或功能性單體，如 環(huán)氧基或酯基。在使用常規(guī)工序聚合這些部分之后，可通過水解這些 基團對聚合物的表面進行后處理，從而提供親水性表面。在使用龐大 的水解試劑的情況下，該方法尤其允許對超過給定尺寸的孔隙進行選 擇性的親水化，即，只有位于尺寸足夠大的孔隙內(nèi)的可水解官能團被 水解。圖4圖示說明了這種方法。該方法使得結(jié)合位點保持一定的疏 水性特征，這類似于在生物受體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的情況。
本發(fā)明還涉及使用所述AquaMIP從食品中提取核黃素或核黃素扔^ 生物的用途，和本發(fā)明在食品加工中的用途。
本發(fā)明進一步涉及所述AquaMIP在色譜法中用于制備性分離，在 化學傳感器中用于分析樣品的預處理和作為合成生物活性化合物的反 應器的用途。
附圖簡述
10

圖1圖示說明了分子印跡的原理。
圖2a列出了用于比較的l-(節(jié)基)尿嗜啶和核黃素的結(jié)構(gòu)。 圖2b列出了 2，6-雙(丙烯酰氨基)吡咬(BAAPy)的結(jié)構(gòu)。 圖2c列出了(a)6-取代的2，4-雙(酰氨基)嘧啶的通式結(jié)構(gòu)，和 (b)2，4-雙(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶的結(jié)構(gòu)。
圖2d列出了功能性單體(BAAPy)和核黃素之間的1:1絡合物的結(jié)構(gòu)。
圖3列出了使用核黃素四乙酸酯作為模板和BAAPy作為功能性單 體合成AquaMIP。
圖4列出了與水相容的MIP(AquaMIP)的合成和孔隙尺寸選擇的表 面親水化策略。
圖5列出了基于PETRA的可能的可水解交聯(lián)單體的結(jié)構(gòu)。
發(fā)明詳述 定義
此處所使用的術(shù)語"靶"可與"模板"互換使用。 此處所使用的術(shù)語"常規(guī)工序"是指制備MIP所最廣泛使用的方 案且與術(shù)語"非共價方法，，可互換使用。
術(shù)語"常規(guī)溶劑"是指在常規(guī)工序包括的聚合或共聚工藝中使用 的溶劑，它包括成孔溶劑(生孔劑)和具有低到中等極性的非質(zhì)子溶劑。 此處所使用的術(shù)語"常規(guī)的MIP"是指使用常規(guī)工序生產(chǎn)的MIP。 此處所使用的術(shù)語"后改性"或"使…親水"或"親水化"可互 換使用，且是指為抑制非特異性結(jié)合所描述的第二種方法。該方法使 得超過給定尺寸的孔隙選擇性親水化，且使得結(jié)合位點保持一定的疏 水性特征，這類似于在生物受體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的情況。圖4圖示說明了該方 法。
此處所使用的術(shù)語"二酰亞胺"是指其中基團"=NH"的兩個自由 價連接到?；系幕衔颷如同在"0-C-NH-C-0"中一樣]，和如在鄰 苯二甲酰亞胺中發(fā)現(xiàn)的一樣(來自H. Benett編輯的"Concise Chemicaland Technical Dictionary" ，Edward Arnold出版，U丄，1986)。
此處所使用的術(shù)語"含有給體-受體-給體(DAD)氫鍵特征的功能 性單體，，旨在作為含有吡啶和嘧啶基單體的通用術(shù)語，正如說明書中所述。
此處所使用的術(shù)語"親水性單體"與術(shù)語"親水性共聚單體"可 互換使用，且旨在包括諸如甲基丙烯酸2-羥基乙酯(HEMA)、 N-乙烯基 吡咯烷酮、丙烯酰胺、曱基丙烯酰胺、甘油-l-丙烯酸酯或甘油-l-甲 基丙晞酸酯之類的單體。
此處所使用的術(shù)語"親水性交聯(lián)單體"是指具有3個或更多個官 能團、可以發(fā)生交聯(lián)反應的單體。實例包括可水解的交聯(lián)單體如季戊 四醇三丙烯酸酯(PETRA)、亞甲基二丙烯酰胺或亞乙基二曱基丙烯酰 胺。
術(shù)語"交聯(lián)劑"在此處與術(shù)語"交聯(lián)單體"可互換使用。交聯(lián)劑 的典型實例是EDMA (二甲基丙烯酸乙二醇酯)。
新型的AQUAMIP
本發(fā)明因此涉及新型的與水相容的分子印跡聚合物(AquaMIP),它
能在水或含水介質(zhì)中選擇性地結(jié)合靶分子。
本發(fā)明進一步涉及新型AquaMIP，它能在水或含水介質(zhì)中選擇性地 結(jié)合靶，它可通過包括下述步驟的方法獲得
(a) 提供選擇的靶或模板的結(jié)構(gòu)類似物，
(b) 在含有選擇的自由基引發(fā)劑的合適的聚合介質(zhì)或溶劑中，提供
一種或多種選擇的功能性單體和一種或多種選擇的交聯(lián)劑，
(c) 在所述乾或才莫板的類似物存在下，使所述一種或多種功能性單 體和所述一種或多種交聯(lián)劑在所述聚合介質(zhì)中共聚，
(d) 通過溶劑萃取或通過光化學方法除去所述模板類似物，
(e) 獲得分子印跡聚合物(AquaMIP),
(f) 任選地對所述AquaMIP進行后改性("親水化")，以減少非特 異性的疏水性結(jié)合。在實施例4-8和10-12中例舉該方法。
在一個具體的方案中，本發(fā)明提供用于分子識別和結(jié)合二酰亞胺 或含二酰亞胺的化合物，如千基尿嘧啶、核黃素或其類似物的 AquaMIP。
為結(jié)合例如核黃素而設計的AquaMIP因此能在含水條件下，如在 液體食品和飲料(例如啤酒)中占主導的那些條件下，選擇性地結(jié)合核 黃素。在水和含水介質(zhì)中，這些AquaMIP顯示出對核黃素強的親合性 和選擇性。
此外，在這樣特定的方案中，本發(fā)明提供新型的分子印跡聚合物， 它能在水或含水介質(zhì)中結(jié)合二酰亞胺或含二酰亞胺的化合物，如芐基 尿嘧啶、核黃素或其類似物，它可通過包括以上對模板或靶所述的步 驟而獲得，所不同的是二酰亞胺或含二酰亞胺的化合物用作步驟(a)、 (c)和(d)的模板。因此，該方法的這些步驟是
(a) 提供選擇的所選二酰亞胺或含二酰亞胺的靶或模板的結(jié)構(gòu)類 似物，
(b) 在含有選擇的自由基引發(fā)劑的合適的聚合介質(zhì)或溶劑中，提供
一種或多種選擇的功能性單體和一種或多種選擇的交聯(lián)劑，
(c) 在所述二酰亞胺或含二酰亞胺的模板類似物存在下，使所述一
種或多種功能性單體和所述一種或多種交聯(lián)劑在所述聚合介質(zhì)中共 聚，
(d) 通過溶劑萃取或通過光化學方法除去所述二酰亞胺或含二酰 亞胺的靶類似物，
(e) 獲得分子印跡聚合物(AquaMIP),
(f) 任選地對所述AquaMIP進行后改性("親水化")，以減少非特 異性的疏水性結(jié)合。
對于核黃素作為二酰亞胺或含二酰亞胺的靶的情況來說，實施例4 和5詳細地列舉并描述了該方法。
為了獲得能在水中結(jié)合模板的印跡位點，滿足下述標準的核黃素 類似物可用作模板，即(a)在常規(guī)聚合介質(zhì)或溶劑中可溶，(b)在聚合反應條件下穩(wěn)定，(C)具有與核黃素接近的結(jié)構(gòu)和形狀的相似，從而導 致能在含水介質(zhì)中容納核黃素的印跡位點。
在本發(fā)明中，所使用的核黃素的結(jié)構(gòu)類似物可包括例如具有核黃 素四羧酸酯形式的那些，它們可藉助糖羥基與鏈烷酸酸酐的簡單的一 步酯化反應而合成。
一些實例是核黃素乙酸四酯、核黃素丙酸四酯和
核黃素甲酸四酯。實施例1和2中分別詳細地描述了核黃素乙酸四酯 和核黃素丙酸四酯的合成。
本發(fā)明還提供使用功能性單體的AquaMIP，所述功能性單體含有給 體 - 受體-給體(DAD)氫鍵特征，在此處將其定義為包括吡啶-和嘧啶-基的單體。 一些實例是對二酰亞胺顯示出強結(jié)合性的2，6-雙(丙烯酰 氨基)吡啶(BAAPy)，或一類嘧啶基單體如2， 4-雙(丙烯酰氨基)嘧啶。 這些單體基于圖2C(A)所示通式結(jié)構(gòu)的6-取代的2，4-雙(酰氨基)嘧啶 (其中l(wèi)可以是任何基團，但優(yōu)選"-NC^。" ； l和R3可以是任何基團， 但優(yōu)選"-CH=CH2")。 一個實例是圖2C(B)所示的2，4-雙(丙烯酰氨 基)-6-哌啶子基-嘧啶。另 一 實例是2， 4-雙(甲基丙烯酰氨基)-6-哌啶 子基-嘧啶(其中R!可以是任何基團，但優(yōu)選》NCsH。；R2和R3可以是任 何基團，但優(yōu)選"-C (CH3) =CH2，，)。實施例3中描述了功能性單體2,4-雙(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶和2，4-雙(丙烯酰氨基)-4-乙氧基 嘧咬的合成。
在共聚反應中使用的典型的自由基引發(fā)劑是偶氮二異丁腈 (AIBN)，但可使用其它合適的引發(fā)劑。
共聚反應中使用的典型的交聯(lián)劑或單體是(二曱基丙烯酸乙二醇 酯)(EDMA)。
因此，使用以上所述的選擇的核黃素類似物和功能性單體，根據(jù) 所述的方法可合成新型的AquaMIP。
抑制非特異性結(jié)合的方法
在又一方面中，本發(fā)明涉及抑制非特異性結(jié)合所使用的兩種不同 方法。本發(fā)明因此提供能抑制非特異性結(jié)合到印跡聚合物上的AquaMIP。
第一種方法是基于添加親水單體，如甲基丙烯酸2-幾基乙酯 (HEMA)、 N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、曱基丙烯酰胺、甘油-l-丙烯 酸酯或甘油-l-甲基丙烯酸酯到單體混合物內(nèi)的工序?；蛘?，該工序也 可利用同樣在聚合/共聚反應開始時，添加可水解的交聯(lián)單體如季戊四 醇三丙烯酸酯(PETRA)、亞甲基二丙烯酰胺或亞乙基二甲基丙烯酰胺到 單體混合物中。這些親水性單體在水解之后產(chǎn)生極性官能團并賦予聚 合物基體更多的親水性特征，從而導致降低了非特異性的疏水性驅(qū)動 的結(jié)合。
在實施例10-12中詳細地列舉并描述了顯示出低的非特異性結(jié)合 的這些"特殊"的AquaMIP的合成。
第二種方法是后改性并從而在合成之后對MIP表面進行"親水化" 的工序。該方法基于使用含有可水解官能團的交聯(lián)或功能性單體，如 環(huán)氧基或酯基。在使用常規(guī)工序聚合這些部分之后，可通過水解這些 基團對聚合物的表面進行后處理，從而提供親水性表面。在使用龐大 的水解試劑的情況下，該方法尤其允許對超過給定尺寸的孔隙進行選 擇性的親水化，即，只有位于尺寸足夠大的孔隙內(nèi)的可水解官能團被 水解。圖4圖示說明了這種方法。該方法使得結(jié)合位點保持一定的疏 水性特征，這類似于在生物受體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的情況。
為了進一步闡述該方法，首先合成一 系列的新型可水解的交聯(lián)單 體，這些交聯(lián)單體在?；糠值碾x去基團的能力方面是不同的。這些 可以是如圖5所示的PETRA的單-、二-或三-氯乙酸酯。使用這種交聯(lián) 劑，通過常規(guī)工序制備MIP,之后使MIP進行孔徑選擇性的水解步驟。 使用氫氧化四烷基銨(QOH)進行所述水解步驟，其中選擇烷基的尺寸， 以使得Q0H從對其滲透而言太小的較小孔隙中被排除。按照這一方 式，只有與較大孔隙相關(guān)聯(lián)的酯基將解離和相應的表面被親水化。這 一通用的工序可應用于對使用常規(guī)工序或類似工序制備的任何MIP的 表面進行親水化。
本發(fā)明的AquaMIP可用于從食品中提取親水性靶或模板分子，和在食品加工應用中使用。
一個具體的方案是將其應用于從食品中提取
核黃素或核黃素衍生物。實施例9表明，本發(fā)明的AquaMIP可用于從 啤酒中成功地提取核黃素。通過實施例8中所述的色譜提取方法證明 并舉例說明了 MIP的另一成功的應用，其中使用本發(fā)明的方法，核黃 素類似物，l-(節(jié)基)尿嘧啶在所合成的MIP上保持了顯著較長的一段 時間。
本發(fā)明進一步涉及將所述AquaMIP用于分析樣品的預處理、在色 譜技術(shù)中用于制備性分離、在化學傳感器中用于基于膜的分離、基于 間歇形式的分離，和作為合成生物活性化合物的反應器的用途。
實施例
現(xiàn)參考許多非限制性實施例，更詳細地描述本發(fā)明。 A.核黃素類似物的合成(實施例1 - 2)
實施例1:核黃素乙酸四酯的合成
稱取2. 65g(7mmol)核黃素，2. 9g(35mrao1)乙酸鈉和50ml乙酸酐到 100ml圓底燒瓶內(nèi)?；旌衔锟雌饋沓柿脸壬膽腋∫骸Ｔ?0 - 90'C的 油浴內(nèi)加熱燒瓶，直到獲得深橙紅色溶液。然后將該透明溶液傾倒在 含有約200ml冰的Erlenmayer燒瓶內(nèi)。然后使用固體碳酸氫鈉(NaHC03) 中和該混合物，然后用3xl00ml氯仿(CHCl3)提取。合并有機部分并 用硫酸鎂(MgSOJ干燥。然后真空蒸發(fā)溶劑并獲得亮橙色固體。在最小 量的曱醇(MeOH)內(nèi)重組(recons t i tute)粗產(chǎn)物，然后通過添加水沉淀。
實施例2:核黃素丙酸四酯的合成
稱取2. 65g(7mmol)核黃素，3. 4g (35mmo1)丙酸鈉和50ml丙酸酐到 100ml圓底燒瓶內(nèi)。混合物看起來呈亮橙色的懸浮液。在80 - 90'C的 油浴內(nèi)加熱燒瓶，直到獲得深橙紅色溶液。然后將該透明溶液傾倒在 含有約200ml冰的Erlenmayer燒瓶內(nèi)。然后使用固體碳酸氫鈉(NaHCO》 中和該混合物，然后用3xl00ml氯仿(CHCh)提取。合并有機部分并 用MgSO,干燥。然后真空蒸發(fā)溶劑并在所有情況下獲得亮橙色固體。 在最小量的MeOH內(nèi)重組粗產(chǎn)物，然后通過添加水沉淀。B.功能性單體的合成(實施例3)
實施例3: 2，4-雙(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶和2，4-雙(丙烯 酰氨基)-4-乙氧基嘧啶的合成 以2步進行合成
(la) 2， 4- (二氨基)-6-哌啶子基嘧啶的合成
根據(jù)Roth等(參見JACS， 72, 1924 (1950))中公開的工序合成 2，4-(二氨基)-6-哌啶子基嘧啶。在圓底燒瓶內(nèi)混合14. 48g的4-氯 -(2，6-二氨基)嘧啶和50ml哌啶并攪拌。緩慢升高溫度到IO(TC。該 溫度下2.5小時之后，將20ml乙醇加入到燒瓶中，并過濾所得混合物。 用50ml乙醇洗滌沉淀。真空蒸發(fā)濾液，并在約200ml水中重組固體殘 渣。加熱該混合物到80。C，然后在劇烈攪拌下使之冷卻。以灰白色固 體形式獲得2， 4- (二氨基)-6-哌啶子基嘧啶。
(lb) 2， 4-二氨基-6-乙氧基嘧啶的合成
在250ml圓底燒瓶內(nèi)，將1.8g鈉溶解在200ml乙醇中，形成乙醇 鈉。然后稱取7. 2g的4-氯-(2，6-二氨基)嘧啶加入到該圓底燒瓶內(nèi)。 回流混合物7天。在這段時間之后，真空蒸發(fā)溶劑，和以灰白色固體 的形式獲得2，4-二氨基-6-乙氧基嘧啶。不需要進一步的純化。 (2a)2， 4-雙(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶的合成 在100ml氯仿內(nèi)的4. 2ml三乙胺存在下，使2. 05g (lO咖ol)通過(la) 中所述的工序獲得的產(chǎn)物與1.8ml(2當量)丙烯酰氯反應。在冰浴中， 在冷卻下逐滴進行添加。在加完之后，在室溫下攪拌反應混合物數(shù)小 時。真空蒸發(fā)溶劑，然后將100ml水加入到固體殘渣中，使三乙胺的 鹽酸鹽(TEA . HC1)溶解。然后用3xlO(hnl CHCl3提取該混合物，合并 有機相，用MgS04干燥，最后真空蒸發(fā)溶劑。用乙醇重結(jié)晶所得的固 體化合物。
(2b) 2， 4-雙(丙烯酰氨基)-6-乙氧基嗜咬的合成 在100ml四氫吹喃內(nèi)的4. 2ml三乙胺存在下，使1. 54g (1 Ommol) 通過(lb)中所述的工序獲得的產(chǎn)物與1.8ml丙烯酰氯反應。在冰浴中，
17在冷卻下逐滴進行添加。在加完之后，在室溫下攪拌反應混合物數(shù)小
時。真空蒸發(fā)溶劑，然后將100ml水加入到固體殘渣中，使TEA.HC1 溶解。然后用3xl00ml CHCl3提取該混合物，合并有機相，用MgS04 干燥，最后真空蒸發(fā)溶劑。最后獲得白色固體，且不需要進一步純化。
C. AquaMIP的合成(實施例4 - 7)
實施例4:使用核黃素四乙酸酯作為核黃素類似物和BAAPY作為功 育巨 性單體制備AquaMIP
在5.6ml CHCl3內(nèi)混合0. 22g(lmmol)BAAPy與0. 55g (lmmol)核黃 素四乙酸酯。然后將3. 8ml (20mmol)EDMA加入到該溶液中，最后添加 40mg(lwt。/。單體)偶氮引發(fā)劑，偶氮二異丁腈(AIBN)。將該混合物轉(zhuǎn)移 到聚合管內(nèi)，用氮氣吹掃10分鐘，最后使用火焰燃燒器密封該管。熱 引發(fā)該聚合反應并使之在恒溫水浴內(nèi)在60'C下聚合24小時。
實施例5:使用核黃素四乙酸酯作為核黃素類似物和2，4-雙(丙烯 酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶作為功能性單體制備AquaMIP
在5. 6ml CHC13內(nèi)混合0. 3g (lmmol) 2， 6-雙丙烯酰氨基-4-(哌咬子 基)嘧啶與0. 55g(lmmol)核黃素四乙酸酯，然后將3. 8ml (20mmol)EDMA 加入到該溶液中，最后添加40mg(lwt。/。單體)的偶氮引發(fā)劑AIBN。將該 混合物轉(zhuǎn)移到聚合管內(nèi)，用氮氣吹掃IO分鐘，最后使用火焰燃燒器密 封該管。熱引發(fā)該聚合反應并使之在恒溫水浴內(nèi)在60C下聚合24小 時。
實施例6:使用l-(爺基)尿嘧啶作為靶和BAAPy作為功能性單體 制備AquaMIP
在5.6ml CHCh內(nèi)混合0. 22g(lmmol)BAAPy與0. 2g (lmmol) 1-(節(jié) 基)尿嘧咬。然后將3. 8fnl(20mmol)EDMA加入到該溶液中，最后添加 40mg(lwt。/。單體)的偶氮引發(fā)劑AIBN。將該混合物轉(zhuǎn)移到聚合管內(nèi)，用 氮氣吹掃IO分鐘，最后使用火焰燃燒器密封該管。熱引發(fā)該聚合反應 并使之在恒溫水浴內(nèi)在60C下聚合24小時。
實施例7:使用l-(爺基)尿嗜啶作為乾和2，4-雙(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶作為功能性單體制備AquaMIP
在5. 6ml CHCl3內(nèi)混合0. 3g(lmmo1)2， 6-雙丙烯酰氨基-4-(哌咬子 基)嘧啶與0. 2g(lmmol)l-(爺基)尿嘧啶。然后將3. 8ml (20mmo1) E賜A 加入到該溶液中，最后添加40rag(lwt。/。單體)的偶氮引發(fā)劑AIBN。將該 混合物轉(zhuǎn)移到聚合管內(nèi)，使用火焰燃燒器密封該管。熱引發(fā)該聚合反 應并使之在恒溫水浴內(nèi)在6(TC下聚合24小時。
實施例8:將實施例4-7中所述的MIP用作選擇性吸附劑的色譜 評價
在恒溫浴內(nèi)24小時之后，在聚合管內(nèi)獲得整料(monolUh)。擊破 該管并將該整料粉碎成較小的顆粒。然后將這些較小的顆粒轉(zhuǎn)移到紙 制套管中并放置在索氏提取器裝置內(nèi)。使用Me0H作為提取溶劑進行提 取并持續(xù)48小時。然后使用實驗室研缽和杵子粉碎該材料，并將所得 的不規(guī)則形狀顆粒篩分為25微米至50微米。為了除去包含在25-50 微米部分內(nèi)的細顆粒(<25微米)，使用MeOH(80。/。)和水(2(^)的混合物 沉降該材料，直到上層清液變得透明。然后將顆粒填充在HPLC柱 (U5imnx4mm內(nèi)徑)內(nèi)。實施例4所述的聚合物在90 %水(含有5 %乙 醇)和10%乙腈中顯示出54分鐘的核黃素的保留時間，而非印跡聚合 物顯示出6.4分鐘的保留時間。
實施例6所述的聚合物在100%乙腈中顯示出34分鐘的l-(節(jié)基) 尿嘧啶的保留時間，而非印跡聚合物保留1-(節(jié)基)尿嘧啶2. 7分鐘。 另外，實施例7中所述的聚合物在相同條件下保留l-(千基)尿嘧梵54 分鐘，而非印跡聚合物保留1-(千基)尿嘧啶3. 2分鐘。
實施例9: AquaMIP從哞酒中提取核黃素的用途
實施例4所述的AquaMIP可以從啤酒中選擇性地結(jié)合核黃素。于 是通過用50mg聚合物平衡10ml啤酒樣品，約40%的核黃素被AquaMIP 吸附，而非印跡對照聚合物吸附約20% 。
C.顯示出降低的非特異性結(jié)合的分子印跡聚合物的合成(實施例 10-12)
實施例10:根據(jù)實施例、4-7但通過添加親水性共聚單體制備的MIPs
在5.6ml CHCl3內(nèi)混合0. 22g(lmmol)BAAPy與0. 55g (lmmol)核黃 素四乙酸酯。然后將3.8ml (20mmol)EDMA和2ml甲基丙烯酸2-羥基乙 酯(HEMA)加入到該溶液中。最后在上述混合物內(nèi)溶解40mg(lwt。/。單體) 的偶氮引發(fā)劑AIBN。將該溶液轉(zhuǎn)移到聚合管內(nèi)，用氮氣吹掃IO分鐘， 最后使用火焰燃燒器密封該管。熱引發(fā)該聚合反應并使之在恒溫水浴 內(nèi)在60。C下聚合24小時。
實施例11:使用核黃素四乙酸酯作為核黃素類似物和BAAPY作為 功能性單體與親水性交聯(lián)單體一起制備MIP
在5.6ml CHCh內(nèi)混合0. 22g(lmmol)BAAPy與0. 55g (lmmol)核黃 素四乙酸酯。然后將20mmo1季戊四醇三丙烯酸酯加入到該溶液中，最 后添加40mg (lwty。單體)的偶氮引發(fā)劑AIBN。將該混合物轉(zhuǎn)移到聚合管 內(nèi)，用氮氣吹掃10分鐘，最后使用火焰燃燒器密封該管。熱引發(fā)該聚 合反應并使之在恒溫水浴內(nèi)在60'C下聚合24小時。在聚合之后，如 實施例8所迷加工聚合物，所得聚合物與實施例4和5所述的聚合物 相比，顯示出顯著降低的非特異性結(jié)合。
實施例12:使用核黃素四乙酸酯作為核黃素類似物和BAAPY作為 功能性單體與可水解的交聯(lián)單體一起制備印跡聚合物并通過堿水解進
行后改性
在5. 6ml CHCl3內(nèi)混合0. 22g(lmmol)BAAPy與0. 55g (lmmol)核黃 素四乙酸酯。然后將20mmo1季戊四醇三丙烯酸酯單(2-氯乙酸酯)加入 到該溶液中，最后添加40mg(lwt。/。單體)的偶氮引發(fā)劑AIBN。將該混合 物轉(zhuǎn)移到聚合管內(nèi)，用氮氣吹掃io分鐘，最后使用火焰燃燒器密封該 管。熱引發(fā)該聚合反應并使之在恒溫水浴內(nèi)在60X:下聚合"小時。 在聚合和如實施例8所述加工之后，在升高的溫度下，在氫氧化四丁 基銨(或更長鏈的氫氧化季銨)的曱醇溶液內(nèi)懸浮并攪拌聚合物顆粒 24小時。所得聚合物與實施例4和5所述的聚合物相比，顯示出顯著
降低的非特異性結(jié)合。
權(quán)利要求
1. 分子印跡聚合物，其特征在于與水相容且具有在水或含水介質(zhì) 顯示出親水性靶或模板的選擇性結(jié)合的印跡位點。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的水相容分子印跡聚合物，其可通過包括下述 步驟的方法獲得(a) 提供靶或模板、或其結(jié)構(gòu)類似物，(b) 在含有選擇的自由基引發(fā)劑的合適的聚合介質(zhì)或溶劑中，提供 一種或多種選擇的功能性單體、任選的親水性共聚單體、以及一種或 多種選擇的交聯(lián)劑，該一種或多種選擇的交聯(lián)劑是任選親水的；(c) 在所述模板類似物存在下，使所述功能性單體和所述交聯(lián)劑在 所述聚合介質(zhì)中共聚，(d) 通過溶劑萃取或通過光化學方法除去所述模板類似物，(e) 獲得水相容分子印跡聚合物，(f) 任選地對所述水相容分子印跡聚合物進行后改性("親水化")，以減少非特異性的疏水性結(jié)合，其中存在所述親水性單體或所述親水性交聯(lián)劑中的至少一種；或 進行步驟(f );或存在所述親水性單體或所述親水性交聯(lián)劑中的至少 一種并進行步驟(f );導致非特異性的疏水性結(jié)合的抑制。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的水相容分子印跡聚合物，其中所述模板是含 酰亞胺的模板或其結(jié)構(gòu)類似物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的水相容分子印跡聚合物，其中所述含酰亞胺的模板或其結(jié)構(gòu)類似物選自芐基尿嘧啶、核黃素或其類似物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的水相容分子印跡聚合物，其中所述核黃素的 結(jié)構(gòu)類似物選自核黃素四羧酸酯。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的水相容分子印跡聚合物，其中所述核黃素四 羧酸酯選自核黃素乙酸四酯、核黃素丙酸四酯和核黃素甲酸四酯。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2的水相容分子印跡聚合物，其中所述親水性共聚 單體當存在時選自甲基丙烯酸2-羥基乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甘油-l-甲基丙烯酸酯和甘油-l-丙烯酸酯。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2的水相容分子印跡聚合物，其中所述親水性交 聯(lián)單體當存在時選自季戊四醇三丙烯酸酯、亞甲基二丙烯酰胺或亞乙基二曱基丙烯酰胺。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2的水相容分子印跡聚合物，其中所述功能性單 體為吡啶-基單體或嘧啶-基單體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的水相容分子印跡聚合物，其中所述吡咬-基 單體為2，6-雙(丙烯酰氨基)吡咬。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9的水相容分子印跡聚合物，其中所述嘧啶-基 單體為選自具有如下通式I的嘧啶-基單體其中Ri選自氫、哌啶子基、C2—u-烷氧基；R2和R3獨立地選自可聚 合基團。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll的水相容分子印跡聚合物，其中R2和R3獨立 地選自OCH2、 -C(CH3)=CH2。
13. 生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求l的水相容分子印跡聚合物的方法，包括:(a) 提供靶或模板、或其結(jié)構(gòu)類似物，(b) 在含有選擇的自由基引發(fā)劑的合適的聚合介質(zhì)或溶劑中，提供 一種或多種選擇的功能性單體、任選的親水性共聚單體、以及一種或 多種選擇的交聯(lián)劑，該一種或多種選擇的交聯(lián)劑是任選親水的；(c) 在所述模板類似物存在下，使所述功能性單體和所述交聯(lián)劑在 所述聚合介質(zhì)中共聚，(d) 通過溶劑萃取或通過光化學方法除去所述模板類似物，(e) 獲得水相容分子印跡聚合物，(f)任選地對所述水相容分子印跡聚合物進行后改性("親水化")， 以減少非特異性的疏水性結(jié)合，其中存在所述親水性單體或所述親水性交聯(lián)劑中的至少一種；或 進行步驟(f );或存在所述親水性單體或所述親水性交聯(lián)劑中的至少 一種并進行步驟(f);導致非特異性的疏水性結(jié)合的抑制。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述模板是含酰亞胺的模板或 其結(jié)構(gòu)類似物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述含酰亞胺的模板或其結(jié)構(gòu) 類似物選自節(jié)基尿嘧啶、核黃素或其類似物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述核黃素的結(jié)構(gòu)類似物選自 核黃素四羧酸酯。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述核黃素四羧酸酯選自核黃 素乙酸四酯、核黃素丙酸四酯和核黃素甲酸四酯。
18. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述親水性共聚單體當存在時 選自甲基丙烯酸2-羥基乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、甲基丙 烯酰胺、甘油-l-甲基丙烯酸酯和甘油-l-丙烯酸酯。
19. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中當進行親水化步驟時，使用氬 氧化四烷基銨。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的水相容分子印跡聚合物用于 從固體和液體食品中提取核黃素或其類似物的用途。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中食品為嘩酒。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的水相容分子印跡聚合物用于 分析樣品的預處理、用于色譜技術(shù)中的制備性分離、用于化學傳感器 中基于膜的分離、基于間歇方式的分離，和作為合成生物活性化合物 反應器的用途。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的水相容分子印跡聚合物用于 從富水介質(zhì)中提取親水性生物分子的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及能在水或含水介質(zhì)中選擇性地結(jié)合靶分子如核黃素或其類似物的一類新型的與水相容的分子印跡聚合物(AquaMIP)，并涉及其合成和其在食品加工與提取或分離工藝中的用途。
文檔編號B01J20/26GK101310855SQ200810099889
公開日2008年11月26日 申請日期2004年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者A·J·霍爾, B·塞勒格倫, P·馬內(nèi)塞奧提斯 申請人:Mip技術(shù)股份公司