鵝t淋巴細(xì)胞表面分子cd4的檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及鵝T淋巴細(xì)胞表面分子⑶4的檢測(cè)方法及 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] T淋巴細(xì)胞是宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)中最重要的免疫活性細(xì)胞之一，除直接介導(dǎo)細(xì)胞 免疫功能外，還對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。未成熟T細(xì)胞前體到成熟T細(xì)胞的分 化依賴于T細(xì)胞表面受體的信號(hào)傳導(dǎo)，反映在胸腺細(xì)胞表面不同程度的表達(dá)CD4和CD8表 面共受體分子。最終，能在外來(lái)抗原入侵機(jī)體時(shí)被激活為效應(yīng)細(xì)胞從而發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng) 的成熟T淋巴細(xì)胞是CD4或者CD8單陽(yáng)性的效應(yīng)淋巴細(xì)胞。CD4分子是一種單鏈跨膜糖蛋 白，包含有一個(gè)疏水跨膜區(qū)，一個(gè)較長(zhǎng)的胞漿區(qū)和一個(gè)胞外區(qū)，該胞外區(qū)含有4個(gè)類免疫球 蛋白的功能區(qū)。在免疫應(yīng)答中，CD4分子對(duì)MHC II類分子有特異的親和力，能與MHC II類 分子結(jié)合，從而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合。因此，在生產(chǎn)實(shí)際中檢測(cè)CD4分子即代表 檢測(cè)到⑶4+T淋巴細(xì)胞。
[0003] 免疫學(xué)方法檢測(cè)抗體最常見的檢測(cè)模式是間接酶聯(lián)免疫分析（ELISA)。ELISA的 基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍 保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。受檢標(biāo)本 與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物 與液體中的其他物質(zhì)分開。加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)反應(yīng)也結(jié)合在固相載體上。加 入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相 關(guān)，根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié) 果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。由于ELISA方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢 測(cè)迅速和非放射性以及可以批量測(cè)定等諸多優(yōu)點(diǎn)，使得ELISA方法得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng) 用。
[0004] 監(jiān)控T細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)于商品化疫苗免疫前后宿主免疫狀態(tài)的監(jiān)控，對(duì)于了解機(jī) 體的免役狀態(tài)，對(duì)于宿主感染疾病進(jìn)程的監(jiān)控，及對(duì)于確定抗感染治療及機(jī)會(huì)性感染預(yù)防 性治療方案，評(píng)估藥物療效等方面均具有十分重要的意義。到目前為止，國(guó)內(nèi)外已有人、 鼠、豬、牛、羊、雞、鴨等種屬的T細(xì)胞表面CD4雙抗體夾心ELISA試劑盒的商品化供應(yīng)。然 而，有關(guān)鵝T細(xì)胞免疫的研宄較少且相對(duì)滯后。目前，僅美國(guó)MyBioSource公司出售的Goose sCD4(SCD4)ELISA Kit(Cat. N〇:MBS020139)，說(shuō)明書指出用于檢測(cè)鵝可溶性CD4的水平。并 且，值得注意的是，該試劑盒是使用鼠抗人sCD4單克隆抗體為一抗，進(jìn)行樣品的檢測(cè)。由于 生物物種遺傳進(jìn)化的遠(yuǎn)近，物種之間序列存在不同的差異。據(jù)我們前期研宄數(shù)據(jù)顯示鵝CD4 氨基酸與人CD4氨基酸的序列一致性僅26%?；谏鲜龅臄?shù)據(jù)，我們推測(cè)該試劑盒并不能 有效、全面、準(zhǔn)確的檢測(cè)鶴體CD4水平。而且，迄今為止，尚未見有可使用抗鶴CD4抗體為一 抗的鵝T細(xì)胞表面CD4雙抗體夾心ELISA試劑盒的商品化產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，首先，本發(fā)明提供了一種鵝CD4多克隆抗體，該鵝CD4多克隆抗體是以 鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫動(dòng)物而得到，特異性強(qiáng)；鵝CD4多克隆抗體可用于定性或 定量檢測(cè)鵝T淋巴細(xì)胞表面分子CD4,也可用于制備定性或定量檢測(cè)鵝T淋巴細(xì)胞表面分 子CD4試劑盒；其次，本發(fā)明提供了 一種鵝T淋巴細(xì)胞表面分子CD4雙抗體夾心ELISA檢 測(cè)試劑盒，該試劑盒易于推廣應(yīng)用，適合臨床與生產(chǎn)實(shí)踐上大批量地檢測(cè)樣品；第三，本發(fā) 明提供了一種鵝T淋巴細(xì)胞表面分子CD4雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法是基于 上述的鵝CD4多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的，其靈敏性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、省時(shí)省力、操作簡(jiǎn) 便；第四，本發(fā)明還提供了一種鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白的制備方法，該方法是通過(guò)構(gòu)建原核 表達(dá)重組質(zhì)粒在原核生物中大量表達(dá)鵝⑶4胞外區(qū)重組蛋白。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] 鵝CD4多克隆抗體，以鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫動(dòng)物，得到鵝CD4多克隆 抗體；所述鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白的序列如SEQ ID NO :3所示，該鵝CD4多克隆抗體是以鵝 CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫動(dòng)物而得到，特異性強(qiáng)。
[0008] 鵝⑶4多克隆抗體可用于定性或定量檢測(cè)鵝T淋巴細(xì)胞表面分子⑶4,也可用于制 備定性或定量檢測(cè)鵝T淋巴細(xì)胞表面分子CD4試劑盒。
[0009] 本發(fā)明所述的一種鵝T淋巴細(xì)胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，所 述試劑盒至少包括所述雙抗體，所述雙抗體中至少一種抗體采用權(quán)利要求1所述的鵝CD4 多克隆抗體。
[0010] 進(jìn)一步，所述的一種鵝T淋巴細(xì)胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，所 述雙抗體均采用權(quán)利要求1所述的鵝CD4多克隆抗體。
[0011] 進(jìn)一步，所述的一種鵝T淋巴細(xì)胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，所 述雙抗體包括鼠抗鵝CD4多克隆抗體和兔抗鵝CD4多克隆抗體，所述鼠抗鵝CD4多克隆抗 體為捕獲抗體，所述兔抗鵝CD4多克隆抗體為檢測(cè)抗體；所述鼠抗鵝CD4多克隆抗體是以鵝 CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫鼠，得到鼠抗鵝CD4多克隆抗體；所述兔抗鵝CD4多克隆抗 體是以鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫兔子，得到兔抗鵝CD4多克隆抗體；所述鵝CD4胞 外區(qū)重組蛋白的序列如SEQ ID NO :3所示。
[0012] 本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)靈敏性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，易于推廣應(yīng)用，適合臨床與 生產(chǎn)實(shí)踐上大批量地檢測(cè)樣品。
[0013] 本發(fā)明所述的一種鵝T淋巴細(xì)胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，所述 雙抗體包括鼠抗鵝CD4多克隆抗體和兔抗鵝CD4多克隆抗體，具體包括如下進(jìn)行的步驟：
[0014] 1)鼠抗鵝CD4多克隆抗體和兔抗鵝CD4多克隆抗體的制備
[0015] 以鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫鼠，得到鼠抗鵝CD4多克隆抗體；以鵝CD4胞 外區(qū)重組蛋白為抗原免疫兔子，得到兔抗鵝CD4多克隆抗體；所述鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白的 序列如SEQ ID NO :3所示。
[0016] 2)鵝T淋巴細(xì)胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)
[0017] 以步驟1)所得到的鼠抗鵝CD4重組蛋白的多克隆抗體為捕獲抗體，所得到的兔抗 鵝CD4重組蛋白的多克隆抗體為檢測(cè)第一抗體，以HRP-羊抗兔IgG為檢測(cè)第二抗體，以鵝 CD4蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行ELISA分析，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后取待測(cè)樣品，以步驟1)所得到的鼠 抗鵝CD4重組蛋白的多克隆抗體為捕獲抗體，所得到的兔抗鵝CD4重組蛋白的多克隆抗體 為檢測(cè)第一抗體，以HRP-羊抗兔IgG為檢測(cè)第二抗體，進(jìn)行ELISA分析，判斷待測(cè)樣品中是 否含有鵝T淋巴細(xì)胞表面分子CD4,然后根據(jù)所制備標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中所含鵝T淋巴 細(xì)胞表面分子CD4的含量。本發(fā)明中應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定待測(cè)樣品中可溶性淋巴細(xì)胞表 面蛋白CD4水平，基本原理為：用純化的捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被捕獲 抗體的微孔中依次加入待測(cè)樣品，再加入檢測(cè)第一抗體，然后與HRP標(biāo)記的檢測(cè)第二抗體 結(jié)合，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用 下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的可溶性抗原呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波 長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（0D450數(shù)值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中可溶性抗原濃度。本發(fā)明的鵝T 淋巴細(xì)胞表面分子CD4雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)方法，其靈敏性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、 省時(shí)省力、操作簡(jiǎn)便。
[0018] 進(jìn)一步，優(yōu)選的，以HRP-羊抗兔IgG為檢測(cè)第二抗體。
[0019] 進(jìn)一步，所述的一種鵝T淋巴細(xì)胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，所述 ELISA分析的具體方法為：將所述捕獲抗體包被于酶標(biāo)板孔中，于4°C孵育過(guò)夜，次日采用 PBST充分洗板，然后采用含有BSA的PBS封閉，PBST充分洗滌后，每孔中加入鵝CD4蛋白 標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品進(jìn)行反應(yīng)，采用PBST洗板后，每孔中加入檢測(cè)第一抗體進(jìn)行孵育，采用 PBST洗板，然后每孔中加入檢測(cè)第二抗體進(jìn)行孵育，采用PBST洗板，每孔加入TMBM2O2底 物溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后以〇. 25 %氫氟酸終止液終止顯色反應(yīng)，讀取波長(zhǎng)450nm光密度 值即0D450nm值。
[0020] 本發(fā)明所述的鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白的制備方