一種綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物無機(jī)復(fù)合材料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到層層自組裝法制備綠色熒光蛋白/LDHs復(fù)合發(fā)光超薄膜的方法，并對(duì)其性能作出評(píng)價(jià)。
【背景技術(shù)】
[0002]綠色焚光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)于1962年被發(fā)現(xiàn)，由于它可以發(fā)出穩(wěn)定的熒光，沒有毒性，不具有物種專一性，且易于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，已作為標(biāo)記物廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。當(dāng)GFP基因與目的蛋白基因融合并在生物體內(nèi)表達(dá)時(shí)，目的蛋白仍保持正?；钚?，且GFP能夠保持其熒光，故可以跟蹤目的蛋白的定位、移動(dòng)及其它活動(dòng)。作為最有效的活細(xì)胞標(biāo)記物質(zhì)，熒光蛋白可用于研宄基因表達(dá)調(diào)控、生物大分子相互作用、胚胎發(fā)育以及發(fā)展生物傳感器等。在應(yīng)用過程中除要選擇合適的熒光強(qiáng)度、激發(fā)和發(fā)射波長(特別是FRET和多色標(biāo)記時(shí))、生色團(tuán)成熟時(shí)間、密碼子偏好性和物種差異，還需考慮細(xì)胞所處環(huán)境(溫度、PH、離子強(qiáng)度和種類等)。另外，熒光蛋白的寡聚可能會(huì)影響融合蛋白的正確定位和迀移，而幾乎所有熒光蛋白都有寡聚趨勢(shì)，通過對(duì)有相互作用的側(cè)鏈氨基酸進(jìn)行突變可消除這種趨勢(shì)。
[0003]層狀復(fù)合金屬氫氧化物(Layered Double Hydroxides,簡寫為LDHs，又稱LDHs)是一類典型的陰離子型層狀材料，是帶正電的二維氫氧化物層板與層間陰離子通過靜電相互作用有序堆積形成三維晶體結(jié)構(gòu)，二價(jià)和三價(jià)金屬離子的氫氧化物相互間高度分散并以離子鍵構(gòu)成主體層板，層間陰離子有序排布，以靜電力平衡主體層板電荷，整體呈現(xiàn)電中性。LDHs主體層板內(nèi)的二價(jià)及三價(jià)金屬離子的種類、比例和分布以及插層分子均可以人為調(diào)控，因此可以設(shè)計(jì)合成多種功能性復(fù)合材料的制備。
[0004]因此，將熒光蛋白作為客體插入到層狀材料LDHs的層間，形成生物無機(jī)復(fù)合薄膜，改變提高熒光蛋白的性能，并實(shí)現(xiàn)熒光蛋白固載化，用于研宄熒光蛋白對(duì)于一些生物環(huán)境的檢測，此薄膜有望成為一類新型的生物傳感材料。目前，把熒光蛋白引入到層狀材料LDHs層間的研宄至今還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜及其制備方法。
[0006]本發(fā)明先利用快速成核晶化隔離法或水熱合成法制備了層狀復(fù)合金屬氫氧化物膠體溶液；然后配制熒光蛋白溶液；再將基底用濃硫酸和雙氧水處理后，分別用乙醇和水洗滌，最后利用層層自組裝的方法制備得到了綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜。
[0007]本發(fā)明所述的綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜的制備方法，其具體操作步驟如下:
[0008](I)制備層間陰離子為NO3-,層板二價(jià)、三價(jià)陽離子摩爾比M2+/M3+= 2的層狀復(fù)合金屬氫氧化物膠體溶液；
[0009](2)配制pH = 7-10的綠色熒光蛋白溶液，濃度為0.1-0.05mg/mL ；
[0010](3)將石英片或硅片放置于濃硫酸和雙氧水混合液中浸泡30分鐘，然后分別用乙醇和去離子水超聲洗滌兩次；
[0011](4)將步驟(3)中處理過的石英片或硅片在步驟(I)的膠體溶液中浸泡10-15分鐘，用去離子水充分清洗后，再放置于步驟(2)的綠色熒光蛋白溶液中浸泡10-15分鐘，并充分清洗，得到一次循環(huán)的綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜；
[0012](5)重復(fù)步驟(4)中交替浸泡操作2-100次，得到多層綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜。
[0013]步驟(I)所述的層狀復(fù)合金屬氫氧化物膠體溶液的快速成核晶化隔離制備法為:稱取 0.06mol 的 Mn (NO3)2.6H20 和 0.03mol 的 Min (NO3)3.9H20 溶于 80ml 去(:02去離子水中，記為A溶液；稱取0.18mol NaOH溶于80ml去CO2去離子水中，記為B溶液；將A溶液和B溶液同時(shí)加入全返混液膜反應(yīng)器，調(diào)節(jié)反應(yīng)器轉(zhuǎn)子與定子之間的狹縫寬度為2_，工作電壓為140V，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為5000rpm，將得到的混合漿液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，110°C晶化24小時(shí)后用去離子水充分洗滌，取第四次離心液即為層狀復(fù)合金屬氫氧化物膠體溶液。
[0014]步驟(I)所述的層狀復(fù)合金屬氫氧化物膠體溶液的水熱合成法為:稱取0.0lmol的 M11 (NO3)2.6Η20 和 0.02mol 的 Min (NO3) 3.9Η20 溶于 80ml 去 CO2去離子水中；稱取 0.12mol六次甲基四胺溶于120ml去CO2去離子水中；將兩溶液倒入四口燒瓶，邊攪拌邊混合，同時(shí)通氮?dú)釯小時(shí)，然后80°C水浴加熱攪拌反應(yīng)3天；用去CO2去離子水離心洗滌pH至6.5-7.0，稱取5g離心沉淀溶于10mL去CO2去離子水中，通氮?dú)?0分鐘后置于120°C烘箱12個(gè)小時(shí)，取出后以2000rmp的速度離心30分鐘，取上層液即為層狀復(fù)合金屬氫氧化物膠體溶液。
[0015]所述的Mn為Mg2+，Zn2+，Ni2+中的任何一種；所述的M 111為Al3+。
[0016]上述制備得到的綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜可逆檢測PH值的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明制備得到的綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜實(shí)現(xiàn)了熒光蛋白的固載化，其在PH = 4-8的環(huán)境下熒光強(qiáng)度不同，隨pH的減小該復(fù)合發(fā)光超薄膜的熒光強(qiáng)度降低，且在PH值為4和8的兩種PBS溶液中交替浸泡時(shí)，其熒光響應(yīng)可至少重復(fù)5個(gè)循環(huán)。由于該復(fù)合發(fā)光超薄膜具有較好的pH響應(yīng)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，可用于生物體內(nèi)pH環(huán)境的可逆檢測，提高了熒光蛋白的利用率，為熒光蛋白在生物傳感器上的應(yīng)用研宄以及其他性能的研宄提供基礎(chǔ)。此薄膜有望成為一類新型的生物傳感材料。
【附圖說明】
[0018]圖1是從實(shí)施例1得到的LDHs的XRD圖。
[0019]圖2是從實(shí)施例1得到的綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜的小角XRD圖。
[0020]圖3是從實(shí)施例1得到的鎂鋁硝酸根LDHs、綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜以及空白樣品的ATR-FTIR圖。
[0021]圖4是從實(shí)施例1得到的綠色熒光蛋白溶液的熒光光譜。
[0022]圖5是從實(shí)施例1得到的不同層數(shù)的綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜的熒光光譜圖以及熒光強(qiáng)度與層數(shù)的線性關(guān)系。
[0023]圖6是從實(shí)施例1得到的不同層數(shù)綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜的SEM圖。
[0024]圖7是從實(shí)施例1得到的綠色熒光蛋白溶液的⑶譜。
[0025]圖8是從實(shí)施例1得到的重復(fù)20次操作的綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜的CD譜。
[0026]圖9是從實(shí)施例2得到的綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜在不同pH條件下的焚光光譜。
[0027]圖10是從實(shí)施例2得到的綠色熒光蛋白與層狀復(fù)合金屬氫氧化物復(fù)合發(fā)光超薄膜在pH = 8和pH = 4的PBS溶液中交替浸泡時(shí)，其熒光強(qiáng)度變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面通過具體的實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明。
[0029]實(shí)施例1
[0030]1.采用快速成核晶化隔離法制備LDHs，具體方法為稱取15.385gMg(NO3)2.6H20和11.254g Al(NO3)3.9Η20溶于80ml去CO2去離子水中，記為A溶液，Mg 2+/Α1 3+摩爾比為2:1 ;稱取7.2g NaOH溶于80ml去CO2去離子水中，記為B溶液；將A和B兩種溶液同時(shí)加入全返混液膜反應(yīng)器，調(diào)節(jié)反應(yīng)器轉(zhuǎn)子與定子之間的狹縫寬度為2_，工作電壓為140V，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為5000rpm，將得到的混合漿液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，110°C晶化24小時(shí)后用去離子水充分洗滌，取第四次離心液即為鎂鋁LDHs膠體溶液。離心底物于60°C干燥18小時(shí)，得到干燥的鎂鋁LDHs。
[0031]2.取Img綠色熒光蛋白溶解在pH = 7.4的PBS(50mM)緩沖溶液中，配制成0.1mg/mL的綠色熒光蛋白溶液；
[0032]3.將石英片放置于體積比為7:3的濃硫酸和雙氧水的混合溶液中浸泡30分