專利名稱：提取超氧化物歧化酶復(fù)合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于從人和多種動物血液中提取超氧化物歧化酶復(fù)合物的工藝流程和操作方法。
超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，以下簡稱SOD)廣泛存在于人和多種動物血液和組織中，自1969年被發(fā)現(xiàn)以來，已被提取藥用。從SOD清除人體中超氧自由基的機(jī)理來看，它還需要過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)協(xié)同作用。我們把同時含有SOD和CAT、GSHPx的復(fù)合物稱作SOD復(fù)合物。動物實(shí)驗(yàn)表明，SOD復(fù)合物抗衰老的治療效果較單純SOD要好。而國內(nèi)外現(xiàn)有提取SOD的方法，如異丙醇沉淀法;銅鹽沉淀雜蛋白、離子交換法和超濃縮、凝膠過濾法;乙醇-三氯甲烷沉淀法等，在提取過程中去除和破壞了CAT和GSHPx。因此，需要一種從血液中提取SOD復(fù)合物的方法，我國《醫(yī)藥工業(yè)》雜志1983.(4)4和1985.(16)9介紹的提取SOD純酶的方法，其中間產(chǎn)品也不是SOD復(fù)合物。經(jīng)對1964-1988年世界專利文獻(xiàn)(WPI)和非專利文獻(xiàn)(GAR)檢索，MethodsenEnaymolog1978.108(1)51等文介紹了多種提取SOD純酶的方法，但未見有提取SOD復(fù)合物方法的介紹。
本發(fā)明的任務(wù)，是提供一種從人和動物血液中提取SOD復(fù)合物的方法。其提取物同時含有SOD和CAT、GSHPx，使SOD的總活力損失少，并且保留多種小分子抗氧劑(如硒、胱氨酸、半胱氨酸)以及多種維生素、微量元素、氨基酸等。這種SOD復(fù)合物不僅可作藥用，還可用于多種食品和化妝品作添加劑。其生產(chǎn)周期短，操作相對簡便。可廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，禽類、肉食加工廠都可采用。同時，因?yàn)榧庸ぬ幚砹嗽瓉肀粡U棄的血液，可減少環(huán)境污染。
按本發(fā)明這一任務(wù)可以用以下方法來解決
一.生產(chǎn)流程1.采取血細(xì)胞。取新鮮人或動物血液，加抗凝劑，在0℃-4℃靜置過夜，棄去血漿，保留沉淀的血細(xì)胞。
2.洗滌血細(xì)胞。加入2-5倍的2%氯化鈉溶液，混勻，成血細(xì)胞懸液，以1500轉(zhuǎn)/分-3500轉(zhuǎn)/分離心后棄去上清液。再重復(fù)一次加氯化鈉溶液、離心、棄上清液的過程，成為干凈的血細(xì)胞。(包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板)3.溶血。加去離子水，攪拌，冷藏過夜(或8-10小時)，使血細(xì)胞溶脹破裂。
4.去除血紅蛋白。加乙醇和三氯甲烷，并劇烈攪拌，之后離心，棄沉淀，取其上清液過濾，為淡黃色液體，加鹽酸，調(diào)酸鹼度至SOD等電點(diǎn)(PH5.6-6.8)附近，計(jì)量體積，置-5℃-0℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 5.去乙醇和三氯甲烷。將生產(chǎn)流程4制備的抽提液置于減壓蒸餾器中，加熱至30℃-45℃，同時用真空泵減壓，得到不含乙醇和三氯甲烷的SOD復(fù)合酶抽提液。將此液用超濾器進(jìn)行濃縮，得到SOD復(fù)合酶濃縮抽提液，然后用4N鹽酸調(diào)整酸鹼度至SOD等電點(diǎn)(PH5.6-6.8)附近。
6.沉淀復(fù)合酶。加冷丙酮，不斷攪拌，出現(xiàn)沉淀，成乳白色懸液，靜置片刻，離心，棄上清液，脫去部分水分，留其沉淀物。
7.初步脫水。加75%丙酮適量，離心，棄上清液，脫去部分水分，留其沉淀物。
8.再脫水。加純丙酮適量，離心，棄上清液，繼續(xù)脫水，留其沉淀物。
9.抽干。加純乙醚適量，完成脫水，抽干，即為SOD復(fù)合酶產(chǎn)品。
二.生產(chǎn)工藝1.血源必須新鮮，避免發(fā)生溶血和凝血;血源內(nèi)不得混入動物胃內(nèi)容物和其它雜物。
2.生產(chǎn)流程1所用的抗凝劑如用無水枸櫞酸鈉配制，濃度為3.13%;如用含2分子結(jié)晶水的枸櫞酸鈉配制，濃度為3.8%。使用前均應(yīng)調(diào)整酸鹼度至PH6.4-7.6。
3.生產(chǎn)流程2所用的氯化鈉溶液濃度為2%-5%，而不是0.9%氯化鈉溶液。
4.生產(chǎn)流程3所用的去離子水應(yīng)當(dāng)預(yù)冷;與血細(xì)胞混合后置于-5℃-0℃冷藏箱中過夜，使血細(xì)胞完全溶脹破裂，以提高SOD復(fù)合酶的產(chǎn)品質(zhì)量和得率。
5.生產(chǎn)流程4加用預(yù)冷乙醇和三氯甲烷時，按體積比例分別加入，邊加入邊劇烈攪拌。如加入速度過快使局部濃度過高，會造成酶的失活和其它蛋白質(zhì)變性。應(yīng)于投料前啟動電動攪拌機(jī)。攪拌時間和速度要足夠，防止團(tuán)狀或粗顆粒狀物形成。
6.生產(chǎn)流程5的減壓蒸餾去除抽提液中的乙醇和三氯甲烷，條件為，抽提速率為0.8-1.2升/秒，蒸餾溫度為30℃-45℃，持續(xù)2-4小時。
7.生產(chǎn)流程6所用的丙酮預(yù)冷至-15℃--20℃，緩慢加入抽提液中。
8.全部提取過程中，提取液的溫度除專作調(diào)整的環(huán)節(jié)外，控制在10℃以下。如能控制在0℃左右，則更好。
9.全部提取過程中，提取液的酸鹼度除專作調(diào)整的環(huán)節(jié)外，控制在PH6-9。
10.生產(chǎn)流程9加乙醚抽干時，攪拌時間1分鐘左右。抽干速度，如以1升真空瓶計(jì)，抽氣速度為0.5升/秒-1.0升/秒，極限真空為5×10-4托。
11.生產(chǎn)流程4、7、8、9加入有機(jī)溶劑后的離心，使用冷凍離心機(jī)。離心罐內(nèi)的溫度為-5℃-0℃。離心時間為2-4分鐘，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分-2500轉(zhuǎn)/分。
12.每次向真空瓶中加入SOD復(fù)合酶懸液時，量要適當(dāng)，以不結(jié)塊、不成團(tuán)為度。
以上生產(chǎn)流程和工藝所形成的提取SOD復(fù)合酶的方法，與文獻(xiàn)報(bào)道的提取SOD純品的方法相比，節(jié)省試劑，提高產(chǎn)品得率，減少環(huán)境污染，并有利于丙酮等有機(jī)溶劑的回收。其特點(diǎn)有1.以人和動物血液為原料時，可同時提取紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板中的SOD復(fù)合酶。
2.在對血細(xì)胞洗滌時，不是用09%氯化鈉(生理鹽水)洗滌3次，而是用2%氯化納溶液洗滌1次。
3.溶血方法不是單純使用去離子水低滲溶脹方法，而是綜合使用低滲、低溫，合并冰晶刺破的機(jī)械方法，使血細(xì)胞的溶破過程快速、完全。
4.在加入有機(jī)溶劑，使血紅蛋白變性，去除血紅蛋白時，文獻(xiàn)報(bào)道的提取SOD純品的方法是在室溫下進(jìn)行，本方法是在低溫(-5℃-0℃)下攪拌，使血紅蛋白變性過程加快。
5.省去了向抽提液中加入磷酸二氫鉀，分層柱析的操作。
6.應(yīng)用減壓蒸餾法去除抽提液中的乙醇和三氯甲烷，是文獻(xiàn)報(bào)道的提取SOD純品的方法所沒有的。
7.加入丙酮使酶沉淀的操作，文獻(xiàn)報(bào)道的提取SOD純品的方法是在0℃左右進(jìn)行，本方法是在-20℃--10℃條件進(jìn)行;并在加入丙酮前先調(diào)整抽提液的酸鹼度至等電點(diǎn)附近(PH5.6-6.8)。
8.加75%丙酮脫去部分水分，和再加純丙酮繼續(xù)脫水，用乙醚抽干，為本方法所首創(chuàng)。
實(shí)施例從牛血提取SOD復(fù)合酶的生產(chǎn)工藝和流程的實(shí)例1.取新鮮牛血50千克，立即加入3.8%枸櫞酸鈉溶液6600毫升，輕絨攪拌，注意防止溶血和凝血，得新鮮抗凝牛血。
2.將抗凝血加蓋置于2L4.2L3立式冷藏箱中，調(diào)至2℃-4℃靜置過夜，血細(xì)胞自然沉淀。然后用YB-DX23型手推式電動吸引器吸棄上層淡黃色血漿，保留沉淀物。
3.沿桶壁緩緩加入3倍2%氯化鈉溶液，輕輕攪拌均勻，成為均勻的血細(xì)胞懸液。
4.將血細(xì)胞懸液加入離心罐中，按3500轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，吸棄上清液。
5.按上述3、4兩步驟重復(fù)洗滌一?，得竸h壞難赴 6.計(jì)量洗滌后的血細(xì)胞體積，按等體積量加入預(yù)冷過的去離子水，劇烈攪拌30分鐘，破壞血細(xì)胞。然后置于-5℃-0℃冷藏箱中過夜。通過冷凍作用使血細(xì)胞完全破壞，得溶血液。
7.將預(yù)冷溶血液取出，按體積加入預(yù)冷95%乙醇，劇烈攪拌，混勻，再加入預(yù)冷三氯甲烷，置于不銹鋼電動攪拌桶中劇烈攪拌30分鐘，成為巧克力色糊狀物。配比為溶血液∶95%乙醇∶三氯甲烷＝1∶0.25∶0.158.將上述糊狀物加入離心罐中，以3500轉(zhuǎn)/分離心沉淀15分鐘，糊狀物即分為三層。自上而下分別為SOD復(fù)合酶抽提液、變性血紅蛋白、參與反應(yīng)后的三氯甲烷。
9.將離心罐中上清液部分(即SOD復(fù)合酶抽提液)用布氏漏斗減壓抽濾，得淡黃色清亮透明的SOD復(fù)合酶抽提液。在取樣送檢SOD活力和蛋白濃度后，準(zhǔn)確計(jì)量SOD復(fù)合酶抽提液體積，置于-15℃冷藏箱中過夜，備用。
10.將冷藏備用的抽提液置于減壓蒸餾器中，用600W電爐加熱至抽提液溫度為40℃，同時用真空泵減壓，抽提速率為1升/秒，持續(xù)4小時，得到不含乙醇和三氯甲烷的SOD復(fù)合酶抽提液。將此液用超濾器進(jìn)行濃縮，得到SOD復(fù)合酶濃縮抽提液，然后用4N鹽酸調(diào)整酸鹼度至PH6.6。
11.將SOD復(fù)合酶抽提液置于不銹鋼電動攪拌桶中，啟動電動機(jī)，按抽提液體積的1.2倍緩緩加入-20℃工業(yè)丙酮，桶內(nèi)出現(xiàn)大量白色沉淀物。
12.靜置片刻，用FL.06D大容量冷凍低速離心機(jī)，在-5℃，以2000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘。
13.將上清液收集于搪瓷桶中，作丙酮回收用。用定量加液器迅速將75%丙酮50毫升加入各個離心罐中，啟動組合電動攪拌機(jī)不斷攪拌，使之成為細(xì)顆粒狀均勻渾濁物，置于-5℃離心罐中，以2000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘。
14.將上清液收集于搪瓷桶中，作丙酮回收用。用定量加液器迅速加入100%丙酮50毫升，啟動組合電動攪拌機(jī)攪拌均勻，逐步脫水，成為白色細(xì)顆粒狀均勻渾濁物，置于-5℃離心罐中，以2000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘。
15.將上清液收集于搪瓷桶中，作丙酮回收用。用定量加液器迅將純乙醚50毫升，啟動組合電動攪拌機(jī)迅速攪拌均勻，逐步脫水成為細(xì)顆粒狀均勻渾濁物，置于-5℃離心罐中，以2000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘。
16.將上清液收集于搪瓷桶中，作乙醚回收用。加入乙醚80毫升，迅速攪拌均勻，即成為細(xì)顆粒狀物，立即倒入2500毫升真空瓶中，置于康氏振蕩混合器上，使用2XZ-1型(或2XZ-0.5型和2XZ-2型)旋片式真空泵，邊振蕩邊減壓抽干，即為SOD復(fù)合酶成品。
補(bǔ)正書附表

權(quán)利要求
1.一種從人和動物血液提取酶的方法，其特征在于，應(yīng)用“抗凝-洗滌血細(xì)胞-溶血-加乙醇和三氯甲烷去除血紅蛋白-減壓蒸餾去除乙醇和三氯甲烷-超濾濃縮-調(diào)酸鹼度至等電點(diǎn)-冷丙酮沉淀-丙酮脫水-乙醚抽干”的方法，同時提取紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)。
2.根據(jù)權(quán)力要求1，其特征在于，在使用3.13%-3.8%枸櫞酸鈉溶液對血液抗凝前，先調(diào)整抗凝劑的酸鹼度至PH6.4-7.6。
3.根據(jù)權(quán)力要求1，其特征在于，在對血細(xì)胞洗滌時，使用2%-5%氯化鈉溶液。
4.根據(jù)權(quán)力要求1，其特征在于，溶血方法是綜合使用低滲、低溫，劇烈攪拌，合并冰晶刺破的機(jī)械方法。
5.根據(jù)權(quán)力要求1，其特征在于，在加入有機(jī)溶劑，使血紅蛋白變性，去除血紅蛋白時，是在-5℃-0℃的低溫下連續(xù)攪拌。
6.根據(jù)權(quán)力要求1，其特征在于，應(yīng)用減壓蒸餾法，抽提速率為0.8-1.2升/秒，蒸餾溫度為30℃-45℃，持續(xù)2-4小時，去除乙醇和三氯甲烷。
7.根據(jù)權(quán)力要求1，其特征在于，加入丙酮，使酶沉淀的操作，是在-20℃--10℃條件進(jìn)行;并在加入丙酮前先調(diào)整抽提液的酸鹼度至等電點(diǎn)附近(PH5.6-6.8)。
7.根據(jù)權(quán)力要求1，其特征在于，用75%丙酮脫去部分水分、再加入純丙酮繼續(xù)脫水、用乙醚抽干的方法獲取SOD復(fù)合酶的產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)力要求1，其特征在于，在整個生產(chǎn)流程中，提取液的溫度都保持在10℃以下。
全文摘要
以人和動物血液為原料，應(yīng)用“抗凝—洗滌血細(xì)胞—溶血—加乙醇和三氯甲烷去除血紅蛋白—減壓蒸餾去除乙醇和三氯甲烷—調(diào)酸堿度至等電點(diǎn)—冷丙酮沉淀—丙酮脫水—乙醚抽干”的方法，同時提取紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)，使SOD的總活力損失少，并且保留多種小分子抗氧劑(如硒、胱氨酸、半胱氨酸)以及多種維生素、微量元素、氨基酸等。這種SOD復(fù)合酶不僅可作藥用，還可用于多種食品和化妝品作添加劑。
文檔編號C09D133/08GK1038294SQ8810315
公開日1989年12月27日 申請日期1988年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1988年6月4日
發(fā)明者丁克祥 申請人:海軍工程學(xué)院門診部