一種酶法不對稱還原檸檬醛提高(r)?香茅醛光學純度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)?香茅醛光學純度的方法，即氨基酸催化的檸檬醛順反異構(gòu)反應與釀酒酵母烯醇還原酶OYE1催化的檸檬醛不對稱氫化反應相偶聯(lián)，提高檸檬醛氫化產(chǎn)物(R)?香茅醛光學純度的方法。所述釀酒酵母烯醇還原酶OYE1催化檸檬醛順反異構(gòu)體不對稱氫化合成(R)?香茅醛時，其(R)?香茅醛源自反式檸檬醛，而(S)?香茅醛源自于順式檸檬醛，并且對反式檸檬醛的催化速率要遠高于順式檸檬醛。通過偶聯(lián)氨基酸催化的檸檬醛順反異構(gòu)反應，將部分順式檸檬醛轉(zhuǎn)化為反式檸檬醛，顯著地提高了產(chǎn)物(R)?香茅醛的e.e.值；在10mL催化體系中，添加100mg/mL的甘氨酸，50mM檸檬醛經(jīng)4h的催化反應后，(R)?香茅醛的e.e.值達65.4％，與不偶聯(lián)順反異構(gòu)化反應時(R)?香茅醛的e.e.值(16.7％)相比，提高了48.7％。
【專利說明】
一種酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)-香茅醛光學純度的方法 (一)
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種烯醇還原酶催化檸檬醛的不對稱氫化合成(R)-香茅醛的方法，特 別涉及一種通過檸檬醛的酶法不對稱氫化與氨基酸催化的檸檬醛順反異構(gòu)反應相偶聯(lián)從 而提高氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛光學純度的方法。 (二)
【背景技術】
[0002] 檸檬醛屬于萜烯脂肪醛，分子式為C1QH16O,具有濃烈的檸檬香氣，是一種具有廣闊 應用前景的香料。目前檸檬醛的工業(yè)生產(chǎn)主要是化學法，包括脫氫芳樟醇轉(zhuǎn)位法以及異戊 烯醇和異戊烯醛縮合重排合成法。無論是天然產(chǎn)物中提取的還是化學合成來源的檸檬醛均 存在兩種立體異構(gòu)體:順式檸檬醛(橙花醛)和反式檸檬醛(香葉醛）。氨基酸能催化檸檬醛 的順反異構(gòu)化反應，以順式檸檬醛或反式檸檬醛為底物，經(jīng)氨基酸催化后異構(gòu)化產(chǎn)物中順 式朽 1檬醛與反式梓檬醛的比例約為60:40，與商品梓檬醛中的順反比例相近。梓檬醛是含有 兩個C = C鍵和一個C = O鍵的α，β-不飽和醛，其順反異構(gòu)體的C = C鍵和C = O鍵的選擇性加氫 可得到多種具有重要用途的氫化產(chǎn)物。檸檬醛α，Μ立的C = C鍵不對稱氫化可得到(R)-香茅 醛，而(R)-香茅醛是L-薄荷醇的工業(yè)生產(chǎn)中的關鍵中間產(chǎn)物，其經(jīng)Prins閉環(huán)反應形成異胡 薄荷醇，異胡薄荷醇再經(jīng)氫化反應得到L-薄荷醇;L-薄荷醇具有新鮮并帶有刺激性甜味，還 有強烈的清涼作用，工業(yè)價值巨大。
[0003] 從檸檬醛不對稱氫化合成(R)-香茅醛是最直接的合成路徑，然而檸檬醛的結(jié)構(gòu)特 點決定了該反應在化學合成上要兼顧化學選擇性和立體選擇性。因而，檸檬醛不對稱氫化 合成(R)-香茅醛在化學合成上仍具有較大的難度，事實上目前的(R)-香茅醛工業(yè)化生產(chǎn)并 不是以檸檬醛而是以月桂烯為底物從而實現(xiàn)化學合成。日本高砂公司通過以月桂烯為底物 合成(R)-香茅醛，（R)-香茅醛經(jīng)閉環(huán)反應成L-胡異薄荷醇，再進一步加氫得到高純度的L-薄荷醇。該化學法工業(yè)化合成L-薄荷醇已應用多年，但仍然存在催化劑昂貴、得率不高等問 題。鑒于此，開發(fā)化學法的替代工藝具有重要的學術意義和較高的應用價值。
[0004] 與化學法加氫還原相比，生物酶法不對稱合成具有條件溫和、綠色環(huán)保、立體選擇 性高、工藝簡單、副產(chǎn)物少等優(yōu)點，是最被人寄予期望的化學法的替代者。生物酶法不對稱 氫化檸檬醛合成(R)-香茅醛的關鍵酶是烯醇還原酶。諸多研究表明，野生型的烯醇還原酶 具有兩個不足之處。一方面，烯醇還原酶的催化中心較小，適用于催化小分子底物，而合成 的產(chǎn)物往往是大分子;另一方面，與化學法催化類似，同一烯醇還原酶催化順反異構(gòu)體的加 氫，其產(chǎn)物的手性往往是互補的，因而若底物是順反異構(gòu)體混合物，其氫化反應產(chǎn)物的e. e. 值往往很低。因此，為了實現(xiàn)酶法不對稱氫化檸檬醛合成(R)-香茅醛，通過偶聯(lián)氨基酸催化 的檸檬醛順反異構(gòu)反應進而提高氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛的光學純度具有重要的研究意義和 應用價值。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是利用能耐受高底物濃度的釀酒酵母烯醇還原酶OYEl作為生物催化 劑，直接通過檸檬醛的不對稱氫化合成(R)-香茅醛，在不對稱氫化體系中同時偶聯(lián)氨基酸 催化的檸檬醛順反異構(gòu)反應，從而提高(R)-香茅醛的e.e.值。
[0006] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)-香茅醛光學純度的方法，即氨基 酸催化的檸檬醛順反異構(gòu)反應與釀酒酵母烯醇還原酶OYEl催化的檸檬醛不對稱氫化反應 相偶聯(lián)，提高檸檬醛氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛光學純度的方法，具體所述方法為：以含釀酒酵母 烯醇還原酶OYEl編碼基因的工程菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)超聲破碎后分離純化獲得的 純酶為催化劑，以含博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶n)HCB編碼基因的工程菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得的 濕菌體經(jīng)超聲破碎后分離純化獲得的純酶為偶聯(lián)酶；以檸檬醛為底物，以仲辛醇為溶劑，底 物溶于仲辛醇中；以甲酸鈉為輔底物，以NAD +為輔酶;添加氨基酸，以pH 6.0~9.5的緩沖液 為反應介質(zhì)構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在30°C、200rpm條件下反應3.5~10h，反應結(jié)束后，獲得(R)-香 茅醛，經(jīng)氣相色譜法分析，測定反應液中產(chǎn)物(R)-香茅醛的得率和e.e.值;所述釀酒酵母烯 醇還原酶OYEl編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，所述博伊丁假絲酵母甲酸脫氫 酶FDHCB編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示。
[0008] 所述轉(zhuǎn)化體系中，底物用仲辛醇配制為IM底物溶液，所述底物以IM底物溶液的形 式加入，底物終濃度為50mM(即底物溶液的用量以底物物質(zhì)的量計，底物在轉(zhuǎn)化體系中的終 濃度為50mM)，催化劑用量為0.76U/mL轉(zhuǎn)化體系，偶聯(lián)酶用量為1.25U/mL轉(zhuǎn)化體系，NAD +終 濃度為〇. 625mM，甲酸鈉終濃度為250mM，氨基酸終濃度為100mg/mL轉(zhuǎn)化體系。
[0009] 進一步，所述的氨基酸包括D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、D/L-纈氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、 L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-賴氨酸和L-酪氨酸，更優(yōu)選甘 氨酸。
[0010] 進一步，所述緩沖液優(yōu)選為pH 7.0、50mM的PIPES緩沖液。
[0011] 進一步，本發(fā)明所述催化劑按如下方法制備：（1)將含釀酒酵母烯醇還原酶OYEl編 碼基因的工程菌(E.coli BL21(DE3)/pEASY-El-〇yel)接種至含100yg/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)12h，獲得種子液，然后按體積濃度1 %接種量接種至150mL含100μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在相同條件下（37 °C )培養(yǎng)至菌液濃度(0D_)約為0.6 ~0.8時，添加誘導劑IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至終濃度為0.2mM，在25°C和 200rpm下誘導10~12h，獲得誘導培養(yǎng)液，再將誘導培養(yǎng)液于4 °C和1000 Orpm下離心10min， 棄去上清液，收集濕菌體；（2)將步驟（1)濕菌體加入Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中，在500W下 超聲破碎20min，工作2s，間歇6s，破碎液于4°C和12000rpm下離心10min，重復離心三次后得 到上清粗酶液;所述Tris-HCl緩沖液體積用量以濕菌體重量計為15mL/g。采用Ni-NTA金屬 螯合親和層析，取上清粗酶液上樣至預平衡Ni 2+柱中，再依次用含IOmM咪唑、40mM咪唑、 IOOmM咪唑、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集含IOOmM咪唑的洗脫緩沖 液的流出液，用50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液通過超濾濃縮脫鹽，所得的脫鹽酶液，即為 釀酒酵母烯醇還原酶OYEl酶液;所述的超濾指的是流出液加入截留分子量IOkDa的超濾管 中，加入50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液，在5000rpm下離心20分鐘，然后收集截留的酶液， 即為脫鹽酶液;所述洗脫緩沖液為含300mM氯化鈉的pH 8.0、50mM的Tris-HCl緩沖液。
[0012] 除了篩選基因重組菌的抗性平板中所用的抗生素是Kan外，所述偶聯(lián)酶的表達和 純化流程與催化劑制備流程一致，具體所述偶聯(lián)酶按如下方法制備：（1)將含博伊丁假絲酵 母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因的工程菌接種于含lOOyg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37°C和200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為種子液;然后按體積濃度1%接種量接種至含lOOyg/mL 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C和200rpm條件下培養(yǎng)至OD6qq為0.6~0.8時，添加誘導 劑IPTG至終濃度為0.2mM，在25°C和200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)10~12h，培養(yǎng)液離心，收集濕菌；（2) 將步驟（1)濕菌體用pH 8.(KTris-HCl緩沖液懸浮，在500W下超聲破碎20min，工作2s，間歇 6s，破碎液于4°C和1000 Orpm下離心10min，重復離心三次后得到上清粗酶液;采用Ni-NTA金 屬螯合親和層析，取上清粗酶液上樣至預平衡Ni 2+柱中，再依次用含IOmM咪唑、40mM咪唑、 IOOmM咪唑、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集含有IOOmM咪唑的洗脫緩 沖液的流出液，用50mM、pH 8.0的Tri s-HCl緩沖液通過超濾濃縮脫鹽，所得的脫鹽酶液，即 為甲酸脫氫酶I7DHCB純酶;所述洗脫緩沖液為含300mM氯化鈉的pH 8.0、50mM的Tris-HCl緩 沖液;所述的超濾指的是流出液加入截留分子量IOkDa的超濾管中，加入50mM、pH 8.0的 Tris-HCl緩沖液，在5000rpm下離心20分鐘，然后收集截留的酶液，即為脫鹽酶液。
[0013] 本發(fā)明所述釀酒酵母烯醇還原酶OYEl編碼基因源自購自釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CICC 1002,購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。所述博 伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因源自博伊丁假絲酵母（Candida boidinii) ATCC32195,購自美國典型菌種保藏中心。
[0014] 本發(fā)明所述含釀酒酵母烯醇還原酶OYEl編碼基因的工程菌是由所述釀酒酵母烯 醇還原酶OYEl編碼基因構(gòu)建的重組載體，重組載體再構(gòu)建重組基因工程菌。優(yōu)選所述的重 組基因工程菌的構(gòu)建包括如下步驟：以來源于釀酒酵母的基因組DNA為模板，經(jīng)過PCR擴增 得到釀酒酵母烯醇還原酶OYEl基因，然后克隆至表達載體pEASY-El上，將所述重組載體轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌BL21(DE3)中，即可得到所述含釀酒酵母烯醇還原酶OYEl基因的重組基因工 程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-El-〇yel。類似的，我們構(gòu)建了表達源自博伊丁假絲酵母的 甲酸脫氫酶FDHCB 的基因工程菌E · Co I i BL21 (DE3) /pEASY-E I -f dhcb。
[0015]本發(fā)明所述的方法以釀酒酵母烯醇還原酶OYEl為催化劑，以NAD+為輔酶，催化底 物檸檬醛不對稱還原生成（R)-香茅醛；同時，以博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB為偶聯(lián) 酶，通過輔底物甲酸鈉的脫氫將氧化型輔酶NAD +還原成NADH，從而實現(xiàn)輔酶循環(huán)。當釀酒酵 母烯醇還原酶OYEl催化檸檬醛順反異構(gòu)體不對稱氫化合成(R)-香茅醛時，其(R)-香茅醛源 自反式檸檬醛，而(S)-香茅醛源自于順式檸檬醛。此外，釀酒酵母烯醇還原酶OYEl對反式檸 檬醛的催化速率要遠高于順式檸檬醛。當釀酒酵母烯醇還原酶OYEl催化檸檬醛不對稱氫化 反應時，反式檸檬醛優(yōu)先被利用從而導致反應體系中順反檸檬醛的比例發(fā)生改變，而氨基 酸催化的順反異構(gòu)反應將部分順式檸檬醛轉(zhuǎn)化為反式檸檬醛從而維持順反檸檬醛的平衡 比例，因而檸檬醛不對稱氫化反應與其順反異構(gòu)反應相偶聯(lián)可以提高氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛 的光學純度(圖1)。
[0016]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了一種氨基酸催化 的檸檬醛順反異構(gòu)反應與釀酒酵母烯醇還原酶OYEl催化的檸檬醛不對稱氫化反應相偶聯(lián)， 提高檸檬醛氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛光學純度的方法;所述方法將部分順式檸檬醛經(jīng)氨基酸催 化的順反異構(gòu)反應轉(zhuǎn)化為反式檸檬醛，顯著地提高了產(chǎn)物(R)-香茅醛的e.e.值;在IOmL催 化體系中，添加100mg/mL的甘氨酸，50mM朽 1檬醛經(jīng)4h的催化反應后，（R)-香茅醛的e. e.值為 65.4%，與不偶聯(lián)順反異構(gòu)化反應時(R)-香茅醛的e. e.值(16.7 % )相比，提高了48.7 %。 (四）
【附圖說明】
[0017] 圖1為檸檬醛不對稱氫化反應與其順反異構(gòu)反應相偶聯(lián)提高(R)-香茅醛光學純度 的反應示意圖。
[0018] 圖2為分離純化后釀酒酵母烯醇還原酶OYEl和博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB 的SDS-PAGE圖，M-Protein marker; 1-未誘導菌液；2-純化后0YE2;3-純化后FDHCB。
[0019] 圖3為順式、反式檸檬醛以及(S)-香茅醛、(R)-香茅醛標樣氣相色譜圖。
[0020] 圖4甲酸脫氫酶催化的輔酶循環(huán)與烯醇還原酶催化的檸檬醛不對稱氫化反應相偶 聯(lián)的反應示意圖。
[0021] 圖5不同濃度檸檬醛的氫化反應進程； : 50mM底物；· ： IOOmM底物；▲ : 150mM底 物;▼dOOmM底物。
[0022]圖6為20mM檸檬醛經(jīng)不對稱還原反應后的底物與產(chǎn)物氣相色譜圖；A，反應3.5h后 底物梓檬醛與產(chǎn)物香茅醛的氣相色譜圖；B，反應IOh后底物梓檬醛與產(chǎn)物香茅醛的氣相色 譜圖。
[0023]圖7為偶聯(lián)不同種類氨基酸催化的檸檬醛順反異構(gòu)反應對(R)-香茅醛光學純度的 影響；12種氨基酸分別為D-Met、DL-Va I、Gly、L-Asp、L-Glu、L-Met、L-Ser、L-Ly s、L-Pro、L-Thr和L-Tyr。
[0024]圖8為反應pH對甘氨酸催化檸檬醛順反異構(gòu)反應的影響； :PIPES緩沖液；▲: Tris-HCl緩沖液。
[0025] 圖9為偶聯(lián)甘氨酸催化的順反異構(gòu)反應與檸檬醛不對稱氫化反應生成(R)-香茅醛 氣相色譜圖。
[0026] 圖10在IOmL催化體系中偶聯(lián)甘氨酸催化的順反異構(gòu)反應對產(chǎn)物香茅醛得率和 e. e .值的影響；:未加甘氨酸時香茅醛得率;·：添加甘氨酸時香茅醛得率；□:未加甘氨 酸時(R)-香茅醛e. e.值;〇:添加甘氨酸時(R)-香茅醛e. e.值。 (五)
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0028] 實施例1:釀酒酵母烯醇還原酶OYEl和源自博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶FDHCB的 表達和純化
[0029] (1)釀酒酵母烯醇還原酶OYEl大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建及誘導表達
[0030]釀酒酵母烯醇還原酶OYEl基因 oyel以購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 1002基因組DNA為模板，利用設計的引物Fl和 Rl進行PCR擴增，擴增體系見表1所示。
[0031] 表1PCR擴增反應體系
[0033] 引物如下：Fl，5 ' -ATGCCATTTGTTAAGGACTTTA-3 ' ； Rl，5 ' -TTAATTTTTGTCCCAACCGA-3' ICR反應進程為:94°C預變性5min;之后，以94°C變性30s，57°C復性30s，72°C保持Imin為 一個循環(huán)，重復這樣循環(huán)35次;最后，72 °C保持I Omin。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測 并回收。純化后的PCR產(chǎn)物與載體pEASY-El相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transl-Tl感受態(tài) 細胞中。利用菌落PCR方法檢測并確定陽性克隆子，從陽性克隆子中提取質(zhì)粒。經(jīng)基因測序 后，將所得基因的序列（氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示） 與GenBank中對應的基因序列(基因號:AJU17243.1)進行比對分析，將含有正確片段的質(zhì)粒 命名為 pEASY-El-oyel。
[0034] 用質(zhì)粒提取試劑盒從Transl-Tl菌體中提取重組質(zhì)粒pEASY-El-oyel，將其轉(zhuǎn)入 IOOyL E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，并涂布于含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板 上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆子接種于50mL含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB液體 培養(yǎng)基中，在37°C和200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為種子液。然后按體積濃度1 %接種量擴大培 養(yǎng)接種至150mL含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)至菌液濃度 (0D_)約為0.6~0.8時，添加誘導劑IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至終濃度為 0.2mM，在25°C和200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)10~12h過量表達目的蛋白，培養(yǎng)液離心，收集濕菌體。 [0035] (2)釀酒酵母烯醇還原酶OYEl分離純化
[0036] 將上述濕菌體按Ig濕菌體加15mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.0)的比例加入適量 Tris-HCKpH 8.0)緩沖液，在500W下超聲破碎20min(工作2s，間歇6s)后，破碎液于4°C和 1000 Orpm下離心10min，重復離心三次后得到上清粗酶液。
[0037]按照Ni-NTA金屬螯合親和層析使用說明，取上清粗酶液上樣至預平衡Ni2+柱中，再 依次用含I OmM咪唑、40mM咪唑、10 OmM咪唑、2 5 OmM咪唑的洗脫緩沖液（相應濃度的咪唑和 300mM的氯化鈉溶解在50mM的Tris-HCl緩沖液中，pH 8.0)洗脫雜蛋白和目的蛋白。目的蛋 白經(jīng)含有IOOmM咪唑的洗脫緩沖液洗脫后，用50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液通過超濾濃縮 脫鹽，所得的脫鹽酶液，即為釀酒酵母烯醇還原酶OYEl純酶，酶活為0.72U/mg(采用實施例2 方法測量），用作酶法催化的催化劑;所述的超濾條件指的是酶液加入截留分子量IOkDa的 超濾管中，在5000rpm下離心20分鐘，然后收集截留的酶液。
[0038]博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶roHCB純酶的制備除了篩選基因重組菌的抗性平板中 所用的抗生素是卡納霉素外，用作輔酶的博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB的表達和純化 流程與上述流程一致，以購自美國典型菌種保藏中心的博伊丁假絲酵母（Candida boidinii)ATCC32195為基因來源，制備獲得博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶roHCB純酶(氨基酸 序列為SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示），酶活為2.2U/mg。
[0039] 粗酶液經(jīng)Ni-NTA親和層析分離純化分別獲得了純度較高的目的釀酒酵母烯醇還 原酶OYEl和博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶roHCB，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)檢 測均為單一條帶。重組OYEl與FDHCB均為可溶性蛋白，其分子量大小表觀分別為40.5和 39. OkD，與理論相符，如圖2所示。
[0040] 實施例2:釀酒酵母烯醇還原酶OYEl的酶活力測定
[0041 ] 標準酶活力測定體系（2mL)分別含0 · 4mM NADH、10Oyg/mL釀酒酵母稀醇還原酶 OYEI、20mM梓檬醛(檸檬醛仲用辛醇配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬 醛的量計，反應體系中終濃度為20mM)，以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)為反應介質(zhì);所述濃 度均指在測定體系中的終濃度。反應在30 °C下進行，NADH最后加入，通過檢測反應體系在 340nm處每分鐘的吸光值變化來確定酶活(NADH的摩爾系數(shù)e34() = 6.3mM-1CnT4?；盍挝?(U)定義為每分鐘消耗Ιμπιο? NADH所需的酶量。
[0042]實施例3:釀酒酵母烯醇還原酶OYEl的催化性質(zhì)表征
[0043]標準的催化體系總體積10mL，分別包括20mM檸檬醛(檸檬醛仲用辛醇配制為IM底 物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計，反應體系中終濃度為20mM)、0.25mM NAD+UOOmM甲酸鈉、0.3U/mL 0YEl、0.5U/mL FDHCB，以50mM PIPES緩沖液（pH 7.0)為反應 介質(zhì)。不對稱還原反應的條件優(yōu)化在轉(zhuǎn)速為200rpm水浴搖床上進行。反應液用乙酸乙酯萃 取，所獲得的有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，利用氣相色譜法定量測定底物檸檬醛和產(chǎn)物 (R)-香茅醛。
[0044]底物檸檬醛和產(chǎn)物(R)-香茅醛的氣相色譜(Agilent 6890N)檢測條件如下：手性 柱868-174,30111\25(^111\0.254111;檢測器：卩10,250°(： ;載氣：吣，3311117111丨11;空氣流量： 300mL/min;氫氣流量，30mL/min;分流比：1:30;進樣量：IyL;進樣口溫度:250 °C。柱溫條件： 40°C保持lmin，4°C/min升溫至 120°C，保持lmin，20°C/min升溫至180°C，保持3min。如圖3所 示，在上述色譜條件下，（Z)-檸檬醛、（E)-檸檬醛、（S)-香茅醛、（R)-香茅醛出峰時間分別為 24.90min、25·49min、22·55min和22·61min〇
[0045]實施例4:偶聯(lián)輔酶循環(huán)系統(tǒng)的檸檬醛氫化合成香茅醛的反應進程 [0046]以源自釀酒酵母的重組烯醇還原酶OYEl作為催化劑，以源自博伊丁假絲酵母的重 組甲酸脫氫酶roHCB作為輔酶循環(huán)驅(qū)動力，構(gòu)建酶法不對稱還原檸檬醛生成香茅醛的催化 體系（圖4)。
[0047] 標準催化體系（ImL)如下：0.3U/mL 0YEl、0.1U/mL FDHCB、20mM檸檬醛（檸檬醛仲 用辛醇配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計，反應體系中檸檬 醛終濃度為20mM)、0.5mM NAD+、IOOmM甲酸鈉，以50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)為反應介 質(zhì)。維持體系當中的純酶OYE1的加入量(0.3U/mL)不變，通過改變其他各組分的添加量以及 反應的條件，對標準體系進行優(yōu)化，最終確定最優(yōu)的催化體系。優(yōu)化過程中考察的因素包 括:反應溫度(25~50°C )、反應pH(6 · 0~9 · 0)、FDHCB添加量(0 · 05~0 · 5U/mL)、甲酸鈉濃度 (10~200mM)、NAD+濃度(0.05~I .OmM)、檸檬醛濃度（20~50mM)。優(yōu)化后的催化體系（ImL) 為:20mM檸檬醛(檸檬醛仲用辛醇配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛 的量計，反應體系中檸檬醛終濃度為20mM)、0.3U/mL OYEl純酶（實施例1制備）、0.5U/mL FDHCB純酶（實施例1制備）、0.25mM NAD+、100mM甲酸鈉，以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)反應 介質(zhì);反應溫度為30°C，不對稱還原反應在200rpm的水浴搖床中進行。反應過程中未檢測到 作為副產(chǎn)物的醇或酯，有效地避免了副產(chǎn)物的產(chǎn)生。烯醇還原酶催化的不對稱還原反應往 往適用底物濃度較低（〈10mM)。當適用底物濃度提高至50mM和IOOmM時，催化體系的其它組 分濃度同比例增加(緩沖液濃度不變），成功地提高了檸檬醛不對稱氫化反應中的適用底物 濃度。當?shù)孜餄舛葹?0mM時，優(yōu)選的催化體系（IOmL)如下：0.76U/mL OYEl、1.25U/mL H)HCB、50mM檸檬醛(檸檬醛用仲辛醇配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸 檬醛的量計，反應體系中檸檬醛終濃度為50mM)、0.625mM NAD+、250mM甲酸鈉，以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)反應介質(zhì)。在30 °C和200rpm反應條件下反應3h后，香茅醛的得率達 94% ;反應延長至8h，得率為98.3 %。當適用底物濃度提高至IOOmM，優(yōu)選的催化體系（IOmL) 如下：1.5U/mL OYEl、2.5U/mL FDHCB、IOOmM檸檬醛(檸檬醛用仲辛醇配制為IM底物溶液的 形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計，反應體系中檸檬醛終濃度為IOOmM)、1.25mM NAD +、500mM甲酸鈉、以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)為反應介質(zhì)。在30°C和200rpm反應條件 下反應8h后，香茅醛得率為97.8 %，如圖5所示。
[0048]實施例5:順反檸檬醛與(R/S)-香茅醛的對應關系
[0049]在ImL反應體系中，分別含20mM梓檬醛(檸檬醛用仲辛醇配制為IM底物溶液的形式 加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計，反應體系中檸檬醛終濃度為20mM)、0.3U/mL OYEl 純酶（實施例1制備）、0 · 5U/mL FDHCB純酶（實施例1制備）、0 · 2 5mM NAD+、10OmM甲酸鈉，以 50mM PIPES緩沖液（pH 7.0)反應介質(zhì)。在30°C、200rpm下反應1.5h后，反應的得率為 51.2 %，產(chǎn)物（R)-香茅醛的e . e .值為48.5 %，如圖6中A所示。當反應4h后，反應的得率為 91.5%，產(chǎn)物(R)-香茅醛的e.e.值降低為16.1%，如圖6中B所示。
[0050] 經(jīng)觀察反應過程，（1)釀酒酵母烯醇還原酶OYEl對反式檸檬醛的催化速率要高于 對順式檸檬醛的催化速率；（2)生成的（S)-香茅醛和剩余順式檸檬醛的摩爾數(shù)之和約等于 起始順式檸檬醛的摩爾數(shù)，與此類似的，生成的（R)-香茅醛和剩余反式檸檬醛的摩爾數(shù)之 和約等于起始反式檸檬醛的摩爾數(shù);上百次不同條件的催化反應均驗證了這一事實，因而 推斷(R)-香茅醛是源自反式檸檬醛的不對稱氫化，而(S)-香茅醛是源自順式檸檬醛的不對 稱氫化，并且順反檸檬醛與(S/R)-香茅醛的對應關系是嚴格存在的。
[0051] 實施例6:偶聯(lián)不同氨基酸催化的檸檬醛順反異構(gòu)反應對(R)-香茅醛光學純度的 影響
[0052] 氨基酸可以催化順式和反式檸檬醛之間的異構(gòu)化反應，當順反異構(gòu)反應達到平衡 時順式梓檬醛與反式梓檬醛的比例約為60:40?？疾炝?12種氨基酸對梓檬醛不對稱氫化反 應中（R)-香茅醛光學純度的影響。在ImL反應體系中，分別含50mM檸檬醛(檸檬醛用仲辛醇 配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計，反應體系中檸檬醛終濃 度為50mM)、0.76U/mL OYEl純酶(實施例1方法制備）、1.25U/mL FDHCB純酶(實施例1方法制 備）、0.625mM NAD+、250mM甲酸鈉、100mg/mL氨基酸（分別為D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、D/L-繳氨 酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-賴氨酸 和L-酪氨酸），以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)為反應介質(zhì)。在30°C和200rpm反應條件下反應 4h，結(jié)果如圖7所示。L-天冬氨酸、L-谷氨酸以及L-賴氨酸等3種氨基酸催化順反異構(gòu)反應時 幾乎沒有香茅醛生成，而當酪氨酸催化順反異構(gòu)反應時（R)-香茅醛的e.e.值只有17%左 右，與未添加氨基酸的對照組的結(jié)果(e.e.值為16.7%)相近。其余的氨基酸催化順反異構(gòu) 反應均能有效提高(R)-香茅醛的e.e.值，其e.e.值均在50%以上。在所考察的12種氨基酸 中，以甘氨酸為催化劑催化順反異構(gòu)反應時（R)-香茅醛的光學純度最高，其e.e.值達 57.6%。因此，選擇甘氨酸作為催化劑催化檸檬醛的順反異構(gòu)反應，并進一步考察了pH值對 甘氨酸催化檸檬醛順反異構(gòu)的影響，最終的結(jié)果如圖8所示。在所考察的pH范圍（6.0~9.5) 內(nèi)，（R)-香茅醛的e.e.值均維持在較高水平。考慮到pH對不對稱氫化反應的影響，選擇反應 介質(zhì)為pH 7·0、（50mM、PIPES緩沖液。
[0053]實施例7:通過偶聯(lián)甘氨酸催化的順反異構(gòu)反應提高不對稱氫化合成(R)-香茅醛 光學純度
[0054]與甘氨酸催化的順反異構(gòu)反應相偶聯(lián)，在不對稱氫化的同時使順式檸檬醛異構(gòu)化 為反式檸檬醛。在IOmL反應體系，分別含50mM檸檬醛(檸檬醛用仲辛醇配制為IM底物溶液的 形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計，反應體系中檸檬醛終濃度為50mM)、0.76U/mL OYE1純酶（實施例1方法制備）、1 · 25U/mL FDHCB純酶（實施例1方法制備）、0 · 625mM NAD+、 250mM甲酸鈉、lOOmg/mL甘氨酸以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)為反應介質(zhì)。在30°C、200rpm 下反應3h后，反應的得率為83.9%，產(chǎn)物(R)-香茅醛的e. e.值為67.7%，該反應的底物與產(chǎn) 物的氣相色譜圖如圖9所示。與沒有偶聯(lián)順反異構(gòu)反應的體系（圖6中B)相比，在高產(chǎn)物得率 的情況下，偶聯(lián)順反異構(gòu)反應顯著地提高了產(chǎn)物(R)-香茅醛的e.e.值，該結(jié)果表明一部分 順式檸檬醛經(jīng)順反異構(gòu)反應成為反式檸檬醛，進而不對稱氫化為(R)-香茅醛。甘氨酸催化 的順反異構(gòu)反應偶聯(lián)檸檬醛不對稱氫化反應的反應進程如圖10所示，在反應4h后，反應體 系中香茅醛得率幾乎達到100 %，（R)-香茅醛e. e.值為65.4%，比不偶聯(lián)甘氨酸催化的順反 異構(gòu)反應時(R)-香茅醛e. e.值(16.7 % )提高了48.7 %。
【主權(quán)項】
1. 一種酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)-香茅醛光學純度的方法，其特征在于所述方法 為：以含釀酒酵母烯醇還原酶0YE1編碼基因的工程菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)超聲破碎、 分離純化獲得的純酶為催化劑，以含博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因的工程菌 發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)超聲破碎、分離純化獲得的純酶為偶聯(lián)酶，以檸檬醛為底物，以仲 辛醇為溶劑，以甲酸鈉為輔底物，以NAD+為輔酶，添加氨基酸，以pH 6.0~9.5的緩沖液為反 應介質(zhì)構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在30 °C、200rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應，反應完全后，獲得(R)-香茅醛； 所述釀酒酵母烯醇還原酶OYE1編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，所述博伊丁假 絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示。2. 如權(quán)利要求1所述酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學純度的方法，其特征 在于所述轉(zhuǎn)化體系中，底物以1M底物仲辛醇溶液的形式加入，底物終濃度為50mM，催化劑用 量為0.76U/mL，偶聯(lián)酶用量為1.25U/mL，NAD+終濃度為0.625mM，甲酸鈉終濃度為250mM，氨 基酸終濃度為100mg/mL。3. 如權(quán)利要求1所述酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學純度的方法，其特征 在于所述氨基酸為下列之一:D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、D/L-纈氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨 酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-賴氨酸和L-酪氨酸。4. 如權(quán)利要求1所述酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學純度的方法，其特征 在于所述氨基酸為甘氨酸。5. 如權(quán)利要求1所述酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學純度的方法，其特征 在于所述緩沖液為pH 7.0、50mM的PIPES緩沖液。6. 如權(quán)利要求1所述酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學純度的方法，其特征 在于所述催化劑按如下方法制備：（1)將含釀酒酵母烯醇還原酶0YE1編碼基因的工程菌接 種于含100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C和200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為種子 液;然后按體積濃度1 %接種量接種至含l〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C和 200rpm條件下培養(yǎng)至0D6qq為0.6~0.8時，添加誘導劑IPTG至終濃度為0.2mM，在25 °C和 200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)10~12h，培養(yǎng)液離心，收集濕菌體； (2)將步驟（1)濕菌體用pH 8.0、Tris-HCl緩沖液懸浮，在500W下超聲破碎20min，工作 2s，間歇6s，破碎液于4°C和lOOOOrpm下離心10min，重復離心三次后得到上清粗酶液;采用 Ni-NTA金屬螯合親和層析，取上清粗酶液上樣至預平衡Ni2+柱中，再依次用含10mM咪唑、 40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集含有100mM咪 唑的洗脫緩沖液的流出液，用50mM、pH 8.0的Tri s-HCl緩沖液通過超濾濃縮脫鹽，所得的脫 鹽酶液，即為釀酒酵母烯醇還原酶0YE1純酶;所述洗脫緩沖液為含300mM氯化鈉的pH 8.0、 50mM 的 Tris-HCl 緩沖液。7. 如權(quán)利要求1所述酶法不對稱還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學純度的方法，其特征 在于所述偶聯(lián)酶按如下方法制備：（1)將含博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因的工 程菌接種于含l〇〇yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C和200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為 種子液;然后按體積濃度1 %接種量接種至含l〇〇yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C 和200rpm條件下培養(yǎng)至0D6qq為0.6~0.8時，添加誘導劑IPTG至終濃度為0.2mM，在25 °C和 200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)10~12h，培養(yǎng)液離心，收集濕菌體； (2)將步驟（1)濕菌體用pH 8.0、Tris-HCl緩沖液懸浮，在500W下超聲破碎20min，工作 2s，間歇6s，破碎液于4°C和lOOOOrpm下離心10min，重復離心三次后得到上清粗酶液;采用 Ni-NTA金屬螯合親和層析，取上清粗酶液上樣至預平衡Ni2+柱中，再依次用含10mM咪唑、 40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集含有100mM咪 唑的洗脫緩沖液的流出液，用50mM、pH 8.0的Tri s-HCl緩沖液通過超濾濃縮脫鹽，所得的脫 鹽酶液，即為甲酸脫氫酶H)HCB純酶;所述洗脫緩沖液為含300mM氯化鈉的pH 8.0、50mM的 Tris-HCl緩沖液。
【文檔編號】C12P7/24GK106086089SQ201610438016
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】應向賢, 汪釗, 孟淑敏, 胡寶軍, 程峰
【申請人】浙江工業(yè)大學