一種荔枝核均一多糖及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，公開了一種荔枝核均一多糖及其制備方法和應用。制備方法為：(1)將荔枝核粉碎，乙醇回流提??；(2)揮干的藥渣用水于95～100℃提取2～3次，合并提取液；(3)將提取液濃縮后醇沉得到荔枝核多糖粗品；(4)荔枝核多糖粗品上樣于弱堿性陰離子交換柱用水進行洗脫，收集水洗脫有效部位；透析并干燥得到荔枝核多糖；(5)荔枝核多糖上樣于葡聚糖凝膠色譜柱，用水或0.1mmol/L～0.25mol/L的氯化鈉水溶液進行洗脫；收集第四個洗脫段，透析并干燥。這種荔枝核均一多糖對α?葡萄糖苷酶具有抑制作用，可用于制備臨床治療及輔助治療二型糖尿病食品、保健食品及藥物。
【專利說明】
_種惹枝核均_多糖及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種具有抑制a-葡萄糖苷酶作用的荔枝核均 一多糖及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，餐后的高血糖水平是糖尿病患者的 一大特征，葡萄糖苷酶主要功能是水解葡萄糖苷鍵，從而釋放出葡萄糖。葡萄糖苷酶抑制 劑通過抑制食物中淀粉等碳水化合物分解，延緩腸道吸收葡萄糖，從而降低餐后血糖水平。
[0003] 近些年來，大量的關于多糖類成分抑制a-葡萄糖苷酶的研究被報道，比如來自燕 麥的0葡聚糖，來自馬尾藻、喇叭藻、巖衣藻及墨角藻的褐藻糖膠，山杏多糖APP1-2,車前子 多糖PLP，桑葚多糖MFP-1及MFP-2，采絨革蓋菌多糖ePS-F，南瓜子多糖PP1-1，普洱茶多糖 PTPS及黃芪多糖等具有抑制a-葡萄糖苷酶的作用。因此從多糖類尋找安全有效的a-葡萄糖 苷酶抑制劑是開發(fā)改善或治療糖尿病的食品、保健品或藥物的可行途徑之一。
[0004] 蒸枝核(Litch seed)為無患子科植物蒸枝Litchi chinensis Sonn.的干燥成熟 種子，性味甘、微苦，溫;歸肝、腎經(jīng);具有行氣散結，祛寒止痛的功效，主要用于寒疝腹痛，睪 丸腫痛等癥狀。
[0005] 涉及荔枝核的研究主要有以下內容:CN201610147818.5中國專利文獻中公開了一 種含有艾葉的具有止痛功效的中藥組合物，荔枝核是該中藥組合物的主要藥物之一，該中 藥組合物尤其對于血瘀阻滯、寒濕內侵形成的疼痛具有顯著地止痛效果。 CN201610045555.7的中國專利文獻中公開了一種治療緊張性頭痛的中藥藥丸及其制備方 法，荔枝核是該中藥藥丸的主要藥物之一，該中藥藥丸具有解郁行氣、補益肝腎、散瘀通絡、 活血止痛之功效，增強血液循環(huán)，對緊張性頭痛療效好。CN201610045365.5的中國專利文獻 中公開了一種用于治療肝氣郁結型經(jīng)前期緊張綜合征的中藥藥物，荔枝核是該中藥制劑的 組成藥物之一，該中藥制劑對于肝郁氣滯型經(jīng)前期緊張綜合征具有很好的治療作用。 CN201610038040.4的中國專利文獻中公開了一種用于治療急性附睪炎的中藥組合物，荔枝 核是該中藥組合物的組成藥物之一，該中藥組合物具有養(yǎng)肝益腎、活血祛瘀、清熱利濕、行 氣散結、祛寒止痛、解毒消腫的功效，其治療急性附睪炎療效顯著。CN201610034934.6的中 國專利文獻中公開了一種用于治療乳房纖維腺瘤的中藥制劑，荔枝核是該中藥制劑的組成 藥物之一，該中藥組合物具有疏肝解郁、理氣寬胸、軟堅散結、清熱解毒的功效，治療效果顯 著。CN201610021041.8的中國專利文獻中公開了一種治療月經(jīng)過多的外用中藥藥物，荔枝 核是該中藥制劑的組成藥物之一，該中藥藥物具有益氣健脾、補腎填精、涼血行血、溫經(jīng)止 血之功效，對月經(jīng)過多患者治療效果顯著。CN201511013273.0的中國專利文獻中公開了一 種治療關節(jié)疼痛的中藥膏劑，荔枝核是該中藥制劑的組成藥物之一，該中藥膏劑可用于各 種關節(jié)疼痛，尤其對于外傷疼痛效果更好。CN201511033759.0的中國專利文獻中公開了一 種治療脂肪肝的中藥制劑，荔枝核占該中藥制劑的重量百分比為5~30%，該中藥制劑具有 健脾化濕、活血補腎之功，進而抑制肝臟脂質沉積，促進肝脂肪降解、減輕肝臟脂質沉積，對 脂肪肝具有顯著的療效。CN201510987830.2的中國專利文獻中公開了一種治療乳腺增生的 中藥組合物，荔枝核是該中藥組合物的組成藥物之一，該中藥組合物可疏肝理氣、化痰散 結、解郁止痛、行氣活血、疏通乳絡。CN201510995940.3的中國專利文獻中公開了一種治療 胃寒的中藥配方，荔枝核是該中藥配方的組成藥物之一，該中藥配方能夠有效快速治療胃 寒。
[0006]荔枝核制備治療糖尿病及相關疾病的藥物方面的研究主要有:CN201610052213.8 中國專利文獻中公開了一種治療糖尿病的中藥水丸，該中藥水丸以荔枝核等藥材為主要成 分，通過修復胰島細胞，有效降低血糖；申請?zhí)枮镃N201510959590.5的中國專利文獻中公開 了一種治療糖尿病的中藥組合物，荔枝核是該中藥組合物的組成藥物之一，該中藥組合物 能夠顯著改善糖尿病的癥狀，還能延緩糖尿病的進程，減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。 CN201510941659.1的中國專利文獻中公開了一種含有艾葉的治療糖尿病腎病的中藥制劑， 荔枝核是該中藥制劑的組成藥物之一，該中藥制劑具有補益肝腎，通竅止痛，補血養(yǎng)陰，健 脾開胃的功效。CN201510939051.5的中國專利文獻中公開了一種降血糖保健茶，荔枝核是 該保健茶的主要成分之一，該保健茶具有較好的降血糖作用。CN201510939062.3的中國專 利文獻中公開了一種添加了中藥提取物的降血糖酸奶，荔枝核是其中藥提取物的主要成分 之一，該酸奶具有良好的降血糖作用。CN201510938842.6的中國專利文獻中公開了一種糖 尿病人保健飲料，荔枝核是該保健飲料的主要成分之一，該保健飲料降血糖作用明顯。 CN201510938253.8的中國專利文獻中公開了一種治療糖尿病足的內服中藥組合物，荔枝核 是該中藥組合物的主要組成藥物之一，該中藥組合物具有活血化瘀、去腐生肌、生津止渴、 滋陰健脾、清熱解毒的功效，用于治療糖尿病足效果顯著。CN201510683342.2的中國專利文 獻中公開了一種治療糖尿病的中藥組合物，荔枝核是該中藥制劑的組成藥物之一，該中藥 組合物在降低血糖的同時，通過辨證論治的方法采用綜合措施解除糖尿病患者的臨床癥 狀，防治糖尿病的多種并發(fā)癥，治療效果顯著。CN201510615188.5的中國專利文獻中公開了 一種預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的中藥組合物，荔枝核是該中藥組合物的組成藥物之 一，該中藥組合物在預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥方面療效顯著。CN201510545450.3的中 國專利文獻中公開了一種治療糖尿病的中西藥制劑，荔枝核是該中西藥制劑的組成藥物之 一，該中西藥制劑既有降血糖作用又有抑制西藥毒副作用的出現(xiàn)和預防糖尿病并發(fā)癥產(chǎn)生 的作用。CN201510452519.8的中國專利文獻中公開了一種具有降糖、調脂及緩解糖尿病并 發(fā)癥的荔枝核保健口服液，該口服液富集了荔枝核中黃酮、皂苷、脂肪酸類成分，具有降糖、 調脂及緩解糖尿病并發(fā)癥的功效。CN201510402745.5的中國專利文獻中公開了一種治療糖 尿病的中藥配方，荔枝核是該中藥配方的組成藥物之一，該中藥配方具有顯著的降血糖、尿 糖的作用。CN201510310227.0的中國專利文獻中公開了一種降低血糖、調理體質的中藥組 合物，荔枝核是該中藥組合物的組成藥物之一，該中藥組合物具有降低血糖、尿糖，調整、修 復胰島分泌功能，增加肝糖原含量，防治糖尿病并發(fā)癥，改善糖尿病癥狀，減少合并應用的 兩藥或胰島素對肝、腎等臟的副作用。CN201510002438.8的中國專利文獻中公開了一種治 療糖尿病的中藥配方，荔枝核是該中藥配方的組成藥物之一，該中藥配方具有控制和降低 血糖并且防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展的作用。CN201410693149.2的中國專利文獻中公 開了一種治療糖尿病引起的周圍神經(jīng)病變的中藥組合物，荔枝核是該中藥組合物的組成藥 物之一，該中藥配方能夠安全有效的治療糖尿病引起的周圍神經(jīng)病變。CN201410643318.1 的中國專利文獻中公開了一種治療胰島素依賴型糖尿病的藥物，荔枝核是該中藥配方的組 成藥物之一，該中藥配方對胰島素依賴型糖尿病的有效率可以達到97 . 5%。 CN201410552565.0的中國專利文獻中公開了一種具有降糖降脂保護血管內皮作用的中藥 組合物，荔枝核是該中藥配方的組成藥物之一，該中藥組合物具有很好的降糖降脂作用，還 對血管內皮具有很好的保護作用。
[0007] 綜上所研究的內容可見，目前已有很多關于荔枝核的抗糖尿病方面的研究，但是 關于荔枝核均一多糖抑制a-葡萄糖苷酶活性的研究至今未見任何相關技術報道。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種荔枝核均一多糖(LSP-W-4)及其提取純化方法。
[0009] 本發(fā)明還提供了這種荔枝核均一多糖在制備a-葡萄糖苷酶抑制劑、制備治療糖尿 病藥物方面的應用。
[0010] 本發(fā)明技術方案為，一種荔枝核均一多糖的制備方法，包括如下步驟：
[0011] (1)將荔枝核粉碎至60~320目，50~80°C下乙醇回流提取6~10小時后取藥渣揮 干；
[0012]優(yōu)選的，所述乙醇體積濃度為85%~100%，乙醇與荔枝核的用量比為5~15L/kg; 優(yōu)選的，乙醇回流提取的時間為7.5~9小時；
[0013 ] (2)揮干的藥渣用水于95~100 °C提取2~3次，合并提取液；
[0014]優(yōu)選的，提取方法為包煎提取;優(yōu)選的，第一次提取的用水量與荔枝核的比例為12 ~20L/kg，第二次和第三次提取的用水量與荔枝核的比例為5~12L/kg，每次提取時間為2 ~5小時;優(yōu)選的，提取次數(shù)為兩次，每次2.5~4小時，第一次和第二次提取的用水量與蒸枝 核的比例分別為12~18L/kg和6~11 L/kg;
[0015] (3)將提取液濃縮后加入乙醇進行醇沉，醇沉體系中的乙醇體積濃度控制在70 % ~80%;醇沉18~30小時，離心、過濾或抽濾取沉淀，得到荔枝核多糖粗品；優(yōu)選的，取沉淀 后離心和冷凍干燥，得到荔枝核多糖粗品；
[0016] 優(yōu)選的，所述提取液濃縮至1/4~3/4體積后醇沉；
[0017] (4)將步驟(3)獲得的荔枝核多糖粗品上樣于弱堿性陰離子交換柱，用水進行洗 脫，收集有效部位;透析并干燥得到荔枝核多糖；
[0018]優(yōu)選的，將荔枝核多糖粗品溶解于水或者O.lmmol/L~0.25mol/L的氯化鈉水溶 液，配制成0.01g/mL~飽和溶液，上樣于弱堿性陰離子交換柱;優(yōu)選的，所述弱堿性陰離子 交換柱為DEAE瓊脂糖凝膠柱(如DEAE Sepharose Fast Flow柱）；
[0019]優(yōu)選的，用硫酸-苯酚法跟蹤洗脫曲線，收集水洗脫有效部位;優(yōu)選的，用水和孔徑 2000~4000D的透析袋進行透析12~72小時，冷凍干燥得到荔枝核多糖；
[0020] (5)將步驟(4)得到的荔枝核多糖溶解于水或者0.1mm〇l/L~0.25mol/L的氯化鈉 水溶液，離心，取上清液上樣于葡聚糖凝膠色譜柱(例如Superdex 75)，用水或0. lmmol/L~ 0.25mol/L的氯化鈉水溶液進行洗脫;收集第四個洗脫段，透析并干燥，得到荔枝核均一多 糖；
[0021 ]優(yōu)選的，用0.15~0.25mol/L的氯化鈉水溶液溶解荔枝核多糖;優(yōu)選的，用0.15~ 0.25mol/L的氯化鈉水溶液進行洗脫;優(yōu)選的，用示差折光檢測器檢測或者硫酸-苯酚法跟 蹤洗脫曲線;優(yōu)選的，用水和孔徑2000~4000D的透析袋透析12~72小時。
[0022]由上述方法獲得的荔枝核均一多糖（用LSP-W-4表示)是一種中性雜多糖，平均分 子量為7.55 X 103~7.63 X 103道爾頓，其單糖組成為阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖;阿 拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為7.6±0.5:32.8±0.5:100.0:13.7±0.5;中性 多糖含量大于88*1:%，為88￥1:%~92￥1:%，蛋白含量低于1￥1:%。優(yōu)選的，平均分子量為7.6 X103道爾頓，阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為7.6:32.8:100.0:13.7。一個 優(yōu)選實施例中，中性多糖的含量為89.5wt %，蛋白含量為0.8wt %。
[0023]這種荔枝核均一多糖LSP-W-4能夠抑制a-葡萄糖苷酶活性，呈劑量依賴性的抑制 葡萄糖苷酶活性，其對葡萄糖苷酶的抑制模型為非競爭性抑制。
[0024]上述荔枝核均一多糖可用于制備抑制a-葡萄糖苷酶活性的藥物、保健品或食品。 上述荔枝核均一多糖還可用于制備治療或改善糖尿病的食品、保健品或藥物，尤其是治療 或改善二型糖尿病的藥物、保健品或食品。
[0025] 本發(fā)明的另一個方案為，具有抑制a_葡萄糖苷酶活性的藥物、保健品或食品，以上 述蒸枝核均一多糖為活性成分。
[0026] 在制備以抑制a-葡萄糖苷酶活性為機制來治療及輔助治療二型糖尿病食品、保健 食品及藥物中的應用。
[0027] 本發(fā)明提供了一種以抑制a-葡萄糖苷酶活性為機制來治療及輔助治療二型糖尿 病的食品、保健食品及藥物，該食品、保健食品或藥物以荔枝核多糖LSP-W-4為活性成分。 [0028]本發(fā)明從荔枝核中分離純化獲得了具有抑制a_葡萄糖苷酶活性的均一多糖，而且 制備方法簡單，整個制備過程中沒有使用酸、堿或其它有毒有害試劑，可充分保證荔枝核均 一多糖LSP-W-4活性結構的穩(wěn)定性，適合規(guī)?；a(chǎn);尤其是該荔枝核均一多糖LSP-W-4可 以用于制備治療二型糖尿病的食品、保健品及藥物，為開發(fā)治療二型糖尿病的食品、保健品 及藥物提供依據(jù)，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0029] 圖1是實施例1獲取的荔枝核均一多糖LSP-W-4的凝膠色譜洗脫曲線；
[0030] 圖2是實施例2中荔枝核均一多糖LSP-W-4的中性多糖含量測定試驗的標準曲線； [0031 ]圖3是實施例2中荔枝核均一多糖LSP-W-4的蛋白含量測定試驗的標準曲線；
[0032] 圖4是實施例2中荔枝核均一多糖LSP-W-4的高效液相凝膠色譜(HPGPC)圖；
[0033] 圖5是實施例2中荔枝核均一多糖LSP-W-4單糖組成試驗中的標準品的GC結果圖；
[0034] 圖6是實施例2中荔枝核均一多糖LSP-W-4單糖組成試驗中的LSP-W-4的GC結果圖；
[0035] 圖7是實施例3中荔枝核均一多糖LSP-W-4對a-葡萄糖苷酶的抑制曲線圖；縱軸為 抑制率，橫軸為荔枝核均一多糖LSP-W-4濃度(mg/ml)對數(shù)；
[0036] 圖8是實施例3中阿卡波糖對a-葡萄糖苷酶的抑制曲線圖；縱軸為抑制率，橫軸為 阿卡波糖濃度(mg/ml)對數(shù)；
[0037] 圖9是實施例3中荔枝核均一多糖LSP-W-1~LSP-W-3對a-葡萄糖苷酶的抑制曲線 圖；縱軸為抑制率，橫軸為LSP-W-1、LSP-W-1、LSP-W-3濃度(mg/ml)對數(shù)；
[0038] 圖10是實施例3中荔枝核均一多糖LSP-W-4對a-葡萄糖苷酶的抑制動力學曲線圖；
[0039] 圖11是實施例3中荔枝核均一多糖LSP-W-4對a-葡萄糖苷酶的抑制作用機制圖。
【具體實施方式】
[0040]下面結合實施例是對本發(fā)明作進一步詳細、完整地說明，而不是對本發(fā)明的限制。 下述實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條 件。
[00411實施例1制備荔枝核均一多糖(LSP-W-4)
[0042] (1)將荔枝核2kg粉碎至60~320目，16L 95% (體積濃度）乙醇加熱回流提取8小 時，過濾，藥渣揮干；
[0043] (2)藥渣揮干后包煎，用水于100°C提取二次，每次3小時；第一次加水量為30L，第 二次加水體積為20L;合并二次提取液；
[0044] (3)濃縮至1/2體積后加入95 % (體積濃度）乙醇進行醇沉，將醇沉體系中的乙醇體 積濃度控制在75% ;醇沉24小時后，過濾，收集沉淀;對沉淀進行離心和冷凍干燥，得荔枝核 多糖粗品（用LSP表不）；
[0045] (4)取步驟(3)獲得的荔枝核多糖粗品LSP 10g，溶解于100mL蒸餾水，上樣于DEAE Sepharose Fast Flow(500 X 55mm)柱，用蒸餾水進行洗脫；使用硫酸-苯酸法跟蹤洗脫曲 線，收集利用蒸餾水進行洗脫的有效部位，裝入3000D孔徑的透析袋，用蒸餾水透析48小時， 冷凍干燥即得有效部位荔枝核多糖(用LSP-W表示）；
[0046] (5)將步驟(4)得到的有效部位LSP-W 100mg用3mL 0.2mol/L的氯化鈉水溶液進行 溶解，離心后取上清液上樣于Superdex 75( 100 X 2.6cm)色譜柱，用0.2mol/L的氯化鈉水溶 液進行洗脫;利用硫酸-苯酚法跟蹤洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線（如圖1所示，每個試管5mL)收 集洗脫的有效部位;收集第四個洗脫段的洗脫液裝入3000D孔徑的透析袋透析48h，濃縮，冷 凍干燥，即得荔枝核均一多糖(用LSP-W-4表示）。
[0047] 第一至第三個洗脫段的洗脫液透析干燥后的產(chǎn)品分別命名為LSP-W-ULSP-W-2、 LSP-ff-3〇
[0048]實施例2荔枝核均一多糖LSP-W-4的物理化學性質測定
[0049] 2.1荔枝核均一多糖LSP-W-4的中性多糖含量測定
[0050] 6 %苯酚溶液配制:準確稱取苯酚30g，加蒸餾水溶解并定容到500mL即得。
[00511標準曲線繪制：準確稱取標準葡萄糖20mg于500mL容量瓶中，加水至刻度，溶解混 勻后，分別吸取0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL及1.8mL，各以水補至2 . OmL，然后加入 1.0mL6 %苯酚及5. OmL濃硫酸，靜置10分鐘，搖勻，室溫放置20分鐘以后于490nm測吸光度 (表1)，以2.OmL水按同樣步驟操作為空白組，橫坐標為多糖微克數(shù)，縱坐標為吸光度值，得 標準曲線（圖2)。樣品含量測定:取三組樣品LSP-W-4各10mg，置于200mL容量瓶中，蒸餾水定 容至200mL，按照標準曲線同法操作，得三組數(shù)據(jù)的平均值，根據(jù)標準曲線計算LSP-W-4的總 糖含量。
[0052] 經(jīng)測算，LSP-W-4中性多糖含量為89.5wt%。
[0053] 表1. LSP-W-4糖含量測定試驗的標準品吸光度值
[0056] 2.2荔枝核均一多糖LSP-W-4的蛋白含量測定
[0 05 7 ]使用P i e r c e B CA蛋白定量分析試劑盒測定，按照試劑盒說明配制工作液，并配制 lmg/mL的樣品溶液。根據(jù)微孔板方案(樣品與工作液的比例為1:8)進行LSP-W-4蛋白含量測 定，標準品吸光度值見表2,所得標準曲線見圖3。取實施例1所獲得的LSP-W-4樣品測定含 量，進行三次重復試驗。
[0058] 經(jīng)測算，LSP-W-4總蛋白含量為0 ? 8wt %。
[0059] 表2. LSP-W-4蛋白含量測定試驗的標準品吸光度值
[0061 ] 2.3荔枝核均一多糖LSP-W-4的純度和分子量測定
[0062] 采用高效液相凝膠色譜（HPGPC)法：色譜柱為KS-804和KS-802串聯(lián)；流動相為 0.2mol/L的氯化鈉水溶液;柱溫:40°C ;流速:0.8mL/min;進樣體積:20此。
[0063] 取分子量已知的 DextranP-系列標準葡聚糖 P-5，P_10，P_20，P_50，P_100，P_200， P-400和P-800各2mg，分別用流動相0.2mol/L的氯化鈉水溶液配制成2mg/mL的溶液；以 1 OOOOrpm離心1 Omin;取上清液，每次進樣20yL;以分子量的對數(shù)值對保留時間做標準曲線。
[0064] 取待測樣品2mg，用流動相0.2mo 1/L的氯化鈉水溶液配制成2mg/mL的溶液；以 lOOOOrpm離心10min;取上清液，進樣20yL，進行高效液相凝膠色譜測試。
[0065]根據(jù)測定的樣品保留時間，可從標準曲線中求得樣品的平均分子量。
[0066]標準曲線的繪制處理及分子量計算由GPC軟件自動完成。
[0067]圖4為得到的均一多糖LSP-W-4的高效液相凝膠色譜(HPGPC)圖，由圖4還可說明： 所獲得的多糖為均一多糖。
[0068] 經(jīng)測算，所獲得的均一多糖LSP-W-4的平均分子量為7.6X 103道爾頓。
[0069] 2.4荔枝核均一多糖LSP-W-4的單糖組成分析
[0070] 完全酸水解及糖組成：取2mg LSP-W-4樣品，置于安瓿瓶中，加入2mol/L三氟乙酸 (TFA)3ml，封口，121°C水解2h，水解完畢，多次加甲醇蒸干除去TFA;加入30mg硼氫化鈉，并 lml水，還原5-8h，多次加甲醇:冰醋酸= 5:1減壓蒸去溶劑，直至粉末，再加甲醇蒸干3次，于 105<€烘干1〇111；[11;加入31111乙酸酐，105 <€乙?；?0111；[11，趁熱加入11111水振搖以終止反應；用 2ml氯仿萃取乙?；a(chǎn)物，水洗三次，氯仿層經(jīng)無水硫酸鈉干燥，GC-MS分析。
[0071] 標準品不水解，其余操作同樣品。
[0072] GC-MS條件:TR-5MS(Thermo)色譜柱(60m X 0.25_ X 0.25wii);程序升溫條件為:起 始溫度140 °C，以2 °C /min升溫至198 °C，保持4min;再以4 °C /min升溫至214 °C ;然后以1°C / min升溫至217°C，保持4min;最后以3°C/min升溫至250°C，保持5min;進樣口溫度為250°C; 載氣為He，流速為lml/min。
[0073] 根據(jù)GC-MS結果，對比標準品（圖5,依次為鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露 糖、葡萄糖和半乳糖），得出LSP-W-4的糖組成結果（圖6,依次為阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖和 半乳糖)如下:LSP-W-4由阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖組成，根據(jù)峰積分面積（圖6)可 得其組成比為阿拉伯糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖為7.6:32.8:100.0:13.7(摩爾比）。
[0074]實施例3荔枝核均一多糖LSP-W-4抑制a-葡萄糖苷酶活性試驗
[0075] 3.1試驗試劑
[0076] a-葡萄糖苷酶和p-硝基苯-0-D-半乳P比喃糖苷(PNPG)購自美國Sigma公司，拜糖平 (阿卡波糖片)為德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號BJ25653。
[0077] 3.2a-葡萄糖苷酶的酶活測定及原理
[0078]以p-硝基苯-0-D-半乳吡喃糖苷(PNPG)為a-葡萄糖苷酶的反應底物。PNPG能被a-葡萄糖苷酶水解，生成物為PNP，該物質在40 0nm波長處可被檢測到。因此根據(jù)測定40 0nm波 長處的吸光度值的大小，可計算出PNP的生成量，判斷a-葡萄糖苷酶的活性大小，以空白為 參考，從而得出樣品對葡萄糖苷酶的抑制作用大小。
[0079] 3.3LSP-W-4對a-葡萄糖苷酶的半抑制濃度測定
[0080] PBS緩沖液的配制：磷酸二氫鉀(KH2P〇4): 0.27g，磷酸氫二鈉(Na2HP〇4): 1.42g，氯 化鈉(NaCl): 8g，氯化鉀(KC1): 0.2g，加蒸餾水水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調 pH至7.4,最后定容到1L。
[0081 ] LSP-W-4樣品的配制：精密稱取LSP-W-4約10mg，用PBS緩沖液配制成2.000mg/mL的 LSP-W-4的樣品溶液，并稀釋得到 1 ? 000mg/mL，0 ? 500mg/mL，0 ? 250mg/mL，0 ? 125mg/mL， 0 ? 031mg/mL的LSP-W-4的樣品溶液。
[0082]阿卡波糖(Acarbose)溶液的配制：阿卡波糖在本試驗中為陽性對照藥物，根據(jù)預 實驗結果，選取合適的濃度范圍進行IC5Q的測定。精密稱取阿卡波糖約322.80mg，用PBS緩沖 液配制成32 ? 28mg/mL的阿卡波糖樣品溶液，即50 ? OOmmol/L，并稀釋得到25 ? OOmmol/L， 12 ? 50mmol/L，6 ? 25mmol/L，3 ? 12mmol/L，1.56mmol/L 的阿卡波糖的樣品溶液。
[0083] 具體步驟：
[0084] (1)在96孔板中分別加入90yl/孔的2.000mg/mL，l .000mg/mL，0.500mg/mL， 0 ? 250mg/mL，0 ? 125mg/mL，0 ? 031mg/mL的LSP-W-4溶液或50 ? 00mmol/L，25 ? OOmmol/L， 12.50mmol/L,6.25mmol/L，3 ? 12mmol/L, 1 ? 56mmol/L 的阿卡波糖溶液或 PBS 溶液，PBS 作為空 白對照。
[0085] (2)加入10yL/孔的a-葡萄糖苷酶（10U/L)，并輕微搖勻。
[0086] (3)搖勻后置于37°C培養(yǎng)箱中孵育5分鐘。
[0087] (4)加入100yL的5mM濃度的PNPG，震蕩1分鐘。
[0088] (5)震蕩后置于37°C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。
[0089] (6)酶標儀37°C測定每孔吸光度值，檢測波長為400nm。實驗中每孔重復十三次試 驗，實驗結果用樣品的抑制率（％ )表示，計算公式見下：
[0091 ] 0D(抑制劑+酶）：抑制劑，酶和PNPG同時存在；
[0092] 0D (抑制劑）：有抑制和PNPG，沒有酶；
[0093] 0D(酶）：有酶和PNPG，沒有抑制劑；
[0094] 0D(空白）：只有PNPG，沒有抑制劑和酶；
[0095]試驗結果：如圖7所示，LSP-W-4可以劑量依賴性的抑制a-葡萄糖苷酶的活性，R2 = 0.98，IC5Q為0.4532mg/mL。如圖8所示，阿卡波糖可以劑量依賴性的抑制a-葡萄糖苷酶的活 性，R 2 = 0.98，IC5q為16.83mmol/L，即 10.86mg/mL。由 IC5q數(shù)據(jù)可知，LSP-W-4抑制a-葡萄糖苷 酶的活性大于陽性藥阿卡波糖。
[0096] 洗脫段LSP-W-1、LSP-W-2、LSP-W-3用同樣的方法進行檢測，結果如圖9所示，LSP-W-ULSP-W-2和LSP-W-3沒有抑制a-葡萄糖苷酶的活性或者抑制a-葡萄糖苷酶的活性非常 微弱。
[0097] 3.4LSP-W-4對a -葡萄糖苷酶的抑制作用的動力學研究
[0098]原理:在酶反應過程中，抑制劑對酶的抑制作用，根據(jù)抑制劑和酶的結合特點，主 要分為不可逆性抑制和可逆性抑制。其中，不可逆性抑制指抑制劑以很牢固的共價鍵和酶 結合，不能用物理方法除去，抑制后酶活力不能恢復，即造成酶失活?？赡嫘砸种浦敢种苿?以非共價鍵和酶可逆性結合，造成酶活性的抑制，除去抑制劑后，酶活力可以恢復。可逆性 抑制分為競爭性抑制，非競爭性抑制和反競爭性抑制。競爭性抑制指抑制劑和底物不能同 時和酶的同一活性中心結合，當抑制劑與酶的活性部位結合后，底物便不能與酶結合，反之 也成立。非競爭性抑制指抑制劑不僅與酶結合，也可以去酶-底物復合物結合的一種抑制作 用，抑制劑在酶活性部位以外與酶結合，不與底物與酶活性產(chǎn)生競爭，酶-底物-抑制劑復合 物不能進一步釋放出產(chǎn)物。反競爭性抑制指抑制劑不與酶結合，只與酶-底物復合物結合， 阻止產(chǎn)物生成。
[00"] 酶抑制劑的抑制類型可以根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法來確定，直線相交在Y軸為 競爭性抑制;直線相交在X軸為非競爭性抑制;直線相交在象限內，為混合型競爭性抑制;直 線平行不相交為反競爭性抑制。
[0100] 實驗步驟:根據(jù)3.3項下的實驗具體步驟進行，其中LSP-W-4濃度為0，0.2mg/mL， 0 ? 4mg/mL和0 ? 6mg/mL，底物PNPG濃度分別為4 ? 00mmol/L、2 ? 00mmol/L、1 ? 00mmol/L、 0?50mmol/L和0?25mmol/L。
[0101] 試驗結果：在不同濃度LSP-W-4和不同濃度PNPG條件下，LSP-W-4抑制a-葡萄糖苷 酶的抑制動力學結果如圖1 〇，〇、〇. 2mg/mL，0.4mg/mL和0.6mg/mL濃度下的線性方程為： 0： y=0.7039x+1.8707 R?=0.99038 0.2mg/m L: v=0.791 x+2.0645 R:=0.97861
[0102] 0.4mg/mL； y=l.ll；08x+2.9027 R-=0.98934 0.6mg/mL： y=] ,5239x f-3.8159 R-=0.992
[0103]結果顯示LSP-W-4對a-葡萄糖苷酶的抑制模型是非競爭性抑制。其抑制機制如圖 11所示。
[0104]最后有必要在此說明的是：以上實施例只用于對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳 細說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，根據(jù)上述實施例內容作出一些非本質的改 進和調整均屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種荔枝核均一多糖的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將荔枝核粉碎至60~320目，50~80°C下乙醇回流提取6~10小時后取藥渣揮干； (2) 揮干的藥渣用水于95~100 °C提取2~3次，合并提取液； (3) 將提取液濃縮后加入乙醇進行醇沉，醇沉體系中的乙醇體積濃度控制在70%~ 80%;醇沉18~30小時，離心、過濾或抽濾取沉淀，得到荔枝核多糖粗品； (4) 將步驟(3)獲得的荔枝核多糖粗品上樣于弱堿性陰離子交換柱，用水進行洗脫，收 集水洗脫有效部位;透析并干燥得到荔枝核多糖； (5) 將步驟(4)得到的荔枝核多糖溶解于水或者O.lmmol/L~0.25mol/L的氯化鈉水溶 液，離心，取上清液上樣于葡聚糖凝膠色譜柱，用水或0 · lmmol/L~0 · 25mol/L的氯化鈉水溶 液進行洗脫;收集第四個洗脫段，透析并干燥，得到荔枝核均一多糖。2. 根據(jù)權利要求1所述荔枝核均一多糖的制備方法，其特征在于，步驟（1)所述乙醇體 積濃度為85%~100%，乙醇與荔枝核的用量比為5~15L/kg，乙醇回流提取的時間為7.5~ 9小時； 步驟(2)所述提取方法為包煎提取;第一次提取的用水量與荔枝核的比例為12~20L/ kg，第二次和第三次提取的用水量與荔枝核的比例為5~12L/kg，每次提取時間為2~5小 時。3. 根據(jù)權利要求1或3所述荔枝核均一多糖的制備方法，其特征在于，提取次數(shù)為兩次， 每次2.5~4小時，第一次和第二次提取的用水量與荔枝核的比例分別為12~18L/kg和6~ llL/kg〇4. 根據(jù)權利要求1所述荔枝核均一多糖的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述弱堿性 陰離子交換柱為DEAE瓊脂糖凝膠;用硫酸-苯酚法跟蹤洗脫曲線收集有效部位，并用水和孔 徑2000~4000D的透析袋透析12~72小時； 步驟(5)中，用0.1~0.25mol/L的氯化鈉水溶液溶解荔枝核多糖和洗脫；用示差折光檢 測器檢測或者硫酸-苯酚法跟蹤洗脫曲線，收集第四個洗脫段，用水和孔徑2000~4000D的 透析袋透析12~72小時;所述的干燥方法為冷凍干燥。5. -種荔枝核均一多糖，其特征在于，通過權利要求1~4任一項所述方法制備，平均分 子量為7.55 X 103~7.63 X 103道爾頓，是單糖組成為阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的 中性雜多糖;阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為7.6±0.5:32.8±0.5:100.0: 13·7±0·5 〇6. 根據(jù)權利要求5所述荔枝核均一多糖，其特征在于，平均分子量為7.6 X 103道爾頓，阿 拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為7.6:32.8:100.0:13.7。7. 權利要求5或6所述荔枝核均一多糖，其特征在于，中性多糖含量大于88wt%，蛋白含 量低于lwt%。8. 權利要求5~7任一項所述荔枝核均一多糖在制備治療或改善糖尿病的藥物、保健品 或食品方面的應用。9. 權利要求5~7任一項所述荔枝核均一多糖在制備抑制α-葡萄糖苷酶活性的藥物、保 健品或食品方面的應用。10. -種改善或治療糖尿病的食品、保健品或藥物，其特征在于，其活性成分為權利要 求5~7任一項所述的蒸枝核均一多糖。
【文檔編號】A61K31/715GK105968219SQ201610427432
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】王順春, 吳建軍, 陳苗苗, 施松善
【申請人】上海中醫(yī)藥大學