平菇多糖的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了平菇多糖在預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病相關(guān)方面的新應(yīng)用。平菇多糖能抑制體外乙酰膽酯酶的活力，有體外抗AD作用，能夠明顯能降低腦內(nèi)p?tau、p?GSK3、Aβ三種蛋白水平，且能改善AD大鼠的認知障礙，并降低AD大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶水平，有明顯的體內(nèi)抗AD作用。本發(fā)明為治療和緩解AD擴寬了途徑，具有十分重要的意義。
【專利說明】
平菇多糖的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及平菇多糖的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來在真菌研究中發(fā)現(xiàn)許多多糖物質(zhì)不僅具有抗腫瘤和較高免疫作用，而且具 有良好的藥理和臨床利用價值，并開發(fā)成臨床藥物?，F(xiàn)代科學研究已證明，食用菌多糖對機 體免疫和細胞免疫均有增強作用;對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)有興奮功能，對動物肝臟有保護作用;具 有廣譜的抗病毒、抗腫瘤的免疫作用和對膽固醇的溶解作用。
[0003] 平菇，在生物分類學中隸屬于真菌門擔子菌綱傘菌目白蘑科側(cè)耳屬，是一種常見 的食用菌，其主要活性成分為平燕多糖，在我國廣泛種植。平燕多糖(Pleurotus ostreatus polysaccharide，POP)是從平燕中提取的一種重要組分，它具有抗氧化，抗腫瘤，抑制癌細 胞增生，誘導(dǎo)細胞凋亡，誘導(dǎo)干擾素合成等多種功能，因而備受人們關(guān)注。目前，有關(guān)平菇多 糖的提取方法多是煎煮法(水提醇沉）、酸堿浸提法、酶解法、超聲波提取法。
[0004] 阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是一種原因不明以認知功能減退為主 要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進行性智能障礙，記憶力減退，伴有人格和 情感改變。隨著我國人口老齡化的日益嚴重，AD已越來越成為一個嚴重的社會問題。因此， 尋找各種途徑去實現(xiàn)治療和緩解AD的研究工作都十分必要也具有十分重要的意義。雖然平 菇多糖具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤的作用，但是在預(yù)防和治療AD方面還未有相關(guān)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供平菇多糖在制備乙酰膽堿酶抑制劑中的應(yīng)用， 以此提供平菇多糖在治療因乙酰膽堿酶過多的疾病中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的在于提供平菇多糖在制備Αβ蛋白抑制劑中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供平菇多糖在制備去tau蛋白和/或GSK3蛋白磷酸化 水平藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于提供平菇多糖在制備治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病藥物 中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明上述提到的抑制劑和藥物可選自顆粒劑、膠囊劑、粉針劑、片劑、口服液、丸 劑、膏劑中的一種。本發(fā)明所述平菇多糖可按照本領(lǐng)域中煎煮法(水提醇沉）、酸堿浸提法、 酶解法、超聲波提取法進行提取獲得。本發(fā)明提供一個較優(yōu)的提取方案為纖維素酶酶解法 配合超聲波提取法進行提取，工藝條件為酶解溫度為52°C，酶解時間為57min，酶用量 0.0165g，超聲時間5min，具體可參照《Box-behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選平燕中多糖的超聲 波輔助纖維素酶提取工藝》中記載的提取方法。
[0010]乙酰膽堿是膽堿型神經(jīng)元的信號遞質(zhì)，它傳導(dǎo)的信號和認知、學習及記憶有關(guān)，其 代謝過程和AD緊密相關(guān)。在AD的早期，膽堿功能缺乏的癥狀早于其他任何癥狀，AD特征之一 的神經(jīng)元凋亡也主要發(fā)生在膽堿神經(jīng)元。患有AD的人90%在神經(jīng)沖動傳輸過程中缺乏乙酰 膽堿，所以減輕病癥方法之一是抑制乙酰膽堿酶對乙酰膽堿的水解，恢復(fù)乙酰膽堿的正常 水平。本發(fā)明從體外對平菇多糖的抗AD作用進行了檢測，結(jié)果表明，平菇多糖能抑制體外乙 酰膽酯酶的活力，有體外抗AD作用。
[0011]同時，AD的主要病理特征之一是在大腦皮層和海馬出現(xiàn)Αβ沉積聚集形成的老年斑 以及Tau蛋白過度磷酸化，形成纖維蛋白纏結(jié)。Αβ來源于份定粉樣前體蛋白（ΑΡΡ)，ΑΡΡ經(jīng)過兩 條途徑代謝:若被α分泌酶酶切，為α分泌酶途經(jīng)，不產(chǎn)生Αβ;若被β分泌酶酶切則為β分泌酶 途徑，可產(chǎn)生AKBACE表達的增加使β分泌酶含量增高，將會促使ΑΡΡ通過β分泌酶途徑代謝， 形成ΑΚΑβ等可通過抑制ΡΙ3Κ和PKC途徑而激活GSK30并使tau蛋白發(fā)生過度磷酸化、聚積， 從而導(dǎo)致神經(jīng)元功能、結(jié)構(gòu)改變，動物記憶障礙；同時抑制PI3K和PKC可持續(xù)激活GSK30; Tau 蛋白經(jīng)PKA預(yù)磷酸化后更易于被GSK30磷酸化。因此，減少Αβ產(chǎn)生減少，抑制tau蛋白的磷酸 化，AD有可能得到有效的防治和治療。本發(fā)明采用免疫蛋白印跡法對AD大鼠腦內(nèi)與AD發(fā)生、 發(fā)展相關(guān)的三種蛋白：p-tau、p-GSK3、Ai3水平進行表達，結(jié)果表明，平菇多糖明顯能降低腦 內(nèi)p-tau、p-GSK3、A0三種蛋白水平。
[0012] 此外，本發(fā)明還通過跳臺行為學實驗、Morris水迷宮行為學實驗評估平菇多糖改 善阿爾茨海默病行為學障礙的藥效，結(jié)果表明，平菇多糖能改善AD大鼠的認知障礙，并降低 AD大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶水平，有明顯的體內(nèi)抗AD作用。
[0013] 由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了平菇多糖在預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病相 關(guān)方面的新應(yīng)用，為治療和緩解AD擴寬了途徑，具有十分重要的意義。
【附圖說明】
[0014] 圖1所示為平菇多糖對乙酰膽堿酯酶的IC5Q曲線圖；
[0015] 圖2所示為定位巡航實驗紅外熱分布圖；
[0016] 圖3所示為空間搜索實驗紅外熱分布圖；
[0017]圖4所示為免疫蛋白印跡結(jié)果。
【具體實施方式】
[0018] 本發(fā)明實施例公開了平菇多糖的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當 改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是 顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所述應(yīng)用已通過較佳實施例進行了描 述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改 動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0019] 以下就本發(fā)明所提供的平菇多糖的應(yīng)用做進一步說明。
[0020] 實施例1:平菇多糖體外乙酰膽堿酯酶抑制作用研究
[0021] 1、實驗方法
[0022] 采用酶標儀，建立體外乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選體系，利用體外酶活性測定方 法對乙酰膽堿酯酶抑制活性進行測定，通過IC5Q對活性成分進行評價。
[0023]酶標儀反應(yīng)體系：
[0024] 樣品（母液稀釋10倍）/ddH2() 10uL 0· 1 mol/L PBS(PH=8.0) 50uL DTNB (5mM) 20uL
[0025] AchE (0.2U/rnL) 10uL ATCl(5mM) lOuL
[0026] 抑制率測定：
[0027] 反應(yīng)體系中，96孔板內(nèi)藥物終濃度定為100mg/L，即母液稀釋10倍后以10yL體積加 入反應(yīng)體系，實驗分為6組，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別為陰性對照組(酶+緩沖液+底物），空白對 照組(底物+緩沖液），陽性對照組(加蘭他敏+酶+緩沖液+底物），陽性空白對照組(加蘭他敏 +緩沖液+底物），樣品組(平菇多糖+酶+緩沖液+底物），樣品空白對照組(平菇多糖+緩沖液+ 底物）（平菇多糖有色物在405nm處檢測時會出現(xiàn)自身顏色干擾，因此在檢測時要設(shè)置每味 平菇多糖各濃度的空白對照盡量避免假陽性現(xiàn)象）。首先將酶和緩沖液、藥物、陽性對照物、 底物在37 °C溫度下水浴30min，然后按照陽性對照物或平菇多糖、酶、緩沖液、底物的順序依 次加入96孔板，使每個孔中的總體積為100yL，按反應(yīng)體系加入，各孔的反應(yīng)溫度為37°C，時 間10min〇
[0028] 抑制率（％) = (0D陰性對照組-0D空白對照組)-(0D樣品組-0D樣品空白對照組)/ (0D陰性對照組-0D空白對照組）X 100%
[0029] 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。實驗結(jié)果以均數(shù)土標準差（r:ts)表示， Student' s t-test進行組間比較。P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0030] 2、實驗結(jié)果
[0031] 通過表1和圖1，可以得出平菇多糖抑制率呈一趨勢上升，當升至最高時，不再上 升，呈下降趨勢，得到抑制率在〇. 〇〇625g/mL(相當于生藥量45.12mg/mL)時最大，此時抑制 率最大為72.41 %，即在此濃度時為最佳抑制狀態(tài)，抑制率最大，IC5〇為3.01mg/mL(相當于生 藥量21.73mg/mL)。從體外對平菇多糖的抗AD作用進行了篩選，結(jié)果表明，平菇多糖能抑制 體外乙酰膽酯酶的活力，有體外抗AD作用。
[0032] 表1平菇多糖對乙酰膽堿酯酶的抑制率
[0033]
[0034] 實施例2:平菇多糖改善阿爾茨海默病行為學障礙的藥效學研究
[0035] 1、大鼠造模及分組
[0036] Wistar大鼠，雄性，體重180_220g，購自吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心，許 可證號：SCXK(吉）2013-0001。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為3組，即：空白組，模型組及平菇 多糖組。除空白組外，其余2組均腹腔注射D-半乳糖60mg/kg和灌胃A1C1 3 200mg/kg造模，每 天1次，連續(xù)60d。第30d開始空白組和模型組按10mL/kg給予雙蒸水，平菇多糖組按2g生藥/ kg灌胃給予受試藥，每日一次，連續(xù)30d。
[0037] 2、跳臺行為學實驗
[0038]末次給藥后，進行大鼠跳臺實驗。實驗時首先將大鼠放在SDT-8跳臺實驗視頻分析 系統(tǒng)銅柵上適應(yīng)5min，然后通以36V電流，以大鼠雙足同時接觸銅柵為觸電，視為錯誤反應(yīng)， 記錄大鼠的錯誤次數(shù)作為學習成績，訓練后，重新再次進行實驗，將大鼠置于塑料 跳臺上適應(yīng)5min，然后通以36V電流，記錄第1次跳下平臺的潛伏期和5min內(nèi)的跳下平臺的 錯誤次數(shù)，若大鼠停留在平臺上超過5min，其潛伏期以300s計。
[0039] 3、Morris行為學實驗
[0040] 分為適應(yīng)性實驗、定位巡航實驗和空間搜索實驗。
[0041] 適應(yīng)性實驗:實驗前一天，將大鼠面朝池壁放入水中游泳120s后除濕放回籠中，進 行適應(yīng)。
[0042] 定位航行實驗：在迷宮（直徑120cm，高50cm)內(nèi)注入一定量水，水溫控制在24 ± 2 °C。選取4個入水點，并將迷宮等分為4個象限。在其中任一象限正中放置透明塑料平臺（直 徑10cm)，沒于水下2cm，并在實驗過程中保持其位置不變。水中加入脫脂奶粉使大鼠不能見 到平臺。將大鼠分別從各象限入水點面朝池壁順次放入水中，記錄其在120s內(nèi)尋找并爬上 平臺的時間，即為逃避潛伏期，爬上平臺后允許大鼠在平臺上停留20s，間隔60s后進行下一 次測試。如果大鼠在120s內(nèi)未能找到平臺，則將其引上平臺并停留20s，記錄其潛伏期為 120s。實驗連續(xù)進行5天。
[0043]空間探索實驗:定位航行實驗結(jié)束24h后，取出平臺，在原平臺所在象限的相對象 限入水點將大鼠放入水中，采集其120s內(nèi)穿越有效區(qū)域的次數(shù)及原平臺所在象限路程/總 路程等實驗參數(shù)。
[0044] 4、體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力的測定 [0045] (1)樣品的處理
[0046]行為學實驗結(jié)束后，麻醉動物，取血，冰臺快速取大腦，放入玻璃皿中，玻璃皿加入 少量冰冷的生理鹽水漂洗，用干凈的濾紙吸去大腦組織表面的水分和血液。精密稱重，放入 小燒杯中。加入少量冰冷的生理鹽水，用眼科剪盡快剪碎組織塊。將剪碎的組織倒入玻璃勻 漿器中，再用少許冰冷生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿器中進行冰 浴勻漿。然后再加入冷凍的生理鹽水，按腦組織重量與勻漿總體積1:10的比例，稀釋混勻。 將制備好的10%腦勾衆(zhòng)以3000印111/111；[11離心15111；[11，取上清待測。取出的血以2500印111/111；[11離 心lOmin，取上層血清。測時將血清用生理鹽水按1:9稀釋。
[0047] (2)腦組織蛋白含量的測定
[0048]采用考馬斯亮藍試劑盒測定腦組織蛋白含量。
[0049] (3)AchE活力的測定
[0050]用改良Ellman比色法測定AchE的活力，按乙酰膽堿脂酶測定試劑盒的方法測定。 設(shè)標準管組、不加藥測定管組、受試化合物測定管組(加藥組），每組均設(shè)空白對照管和測定 管，大鼠腦組織勻漿液和血清取樣量為每管30yL。反應(yīng)體系混勻，37°C準確反應(yīng)6min，然后 終止反應(yīng)，混勻放置15min，在412nm波長測定各管吸光度。
[0051 ] 血清中AchE活力(U/mL) = (A測定管-A對照管)/(A標準管-A空白管）X標準管濃度 (lymol/mL)/蛋白量(mg/mL)。
[0052] 5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法
[0053] 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。實驗結(jié)果以均數(shù)土標準差(I±s)表示， Student' s t-test進行組間比較。P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0054] 6、實驗結(jié)果
[0055] (1)平菇多糖對大鼠跳臺行為學障礙的藥效學研究
[0056]與空白組比較，模型組大鼠的初次錯誤次數(shù)及24h錯誤次數(shù)均明顯增加，24h錯誤 潛伏期縮短，P〈〇. 05或p〈0.01，表明AD模型造模成功；與模型組比較，平菇多糖組大鼠學習 成績(初次錯誤次數(shù)）明顯減少，P〈〇.05;與模型組比較，平菇多糖組大鼠24h錯誤次數(shù)明顯 減少，p〈0.05，出現(xiàn)錯誤的潛伏期明顯延長，p〈0.05，見表2。
[0057] 表2平菇多糖對AD大鼠記憶獲得和記憶鞏固障礙的影響（$±S,n = 10)
[0059] 與空白組比較，郎〈0 · 05，##p〈0 · 01;與模型組比較，*p〈0 · 05。
[0060] (2)平菇多糖對大鼠 Morris水迷宮行為學障礙的藥效學研究(定位巡航實驗）
[0061] 從定位巡航紅外熱分布圖（圖2)可以看出，空白組動物很快就可以找到目標所在 位置(第三象限），而模型組動物主要在外圍活動，活動區(qū)域在各象限分布無顯著差異，表明 模型組大鼠學習記憶能力和記憶獲得能力受損。平菇多糖組動物也可以很快找到目標所在 區(qū)域，活動范圍較模型組相比顯著縮小。上述結(jié)果表明平菇多糖組可以明顯改善AD大鼠學 習記憶能力。
[0062]與空白組比較，模型組大鼠5d內(nèi)潛伏期內(nèi)均增加，p〈0.05或P〈0.01，5d平均潛伏期 明顯增加，P〈〇.01，表明模型組大鼠學習記憶行為能力明顯受損。與模型組比較，平菇多糖 組大鼠5d內(nèi)潛伏期內(nèi)均減少，其中以前3d變化明顯，P〈0.05或P〈0.01，5d平均潛伏期明顯增 加，P〈0.05，表明平菇多糖能改善AD大鼠的記憶能力，見表3。
[0063]表3各組動物連續(xù)5天逃避潛伏期(s)
[0064]
[0065] 與空白組比較，##P〈0 · 01;與模型組比較，*P〈0 · 05，林P〈0 · 01。
[0066] (3)平菇多糖對大鼠 Morris水迷宮行為學障礙的藥效學研究(空間搜索實驗）
[0067]空間探索紅外熱分布圖（圖3)可以看出，空白組大鼠在原平臺所在第三象限（原象 限）出現(xiàn)的頻率較多，而模型組動物主要在外圍活動，活動區(qū)域在各象限分布無顯著差異， 上述結(jié)果表明模型組大鼠記憶鞏固能力受損。與模型組比較，平菇多糖組大鼠在原象限出 現(xiàn)的頻率較高，活動范圍較模型組相比顯著縮小。
[0068]與空白組比較，模型組大鼠在有效區(qū)域的運動時間、運動距離及進入有效區(qū)域的 次數(shù)均減少，其中以有效區(qū)域運動距離和進入次數(shù)減少尤為明顯，P〈〇.05;模型組大鼠在第 三象限（原象限）的運動路程明顯減少，P〈〇.05,進入原象限的百分比明顯減少，P〈0.05;模 型組大鼠在原象限的運動時間明顯減少，P〈〇.05,進入原象限的時間占總時間的百分比明 顯減少，P〈0.05,進一步表明模型造模成功。與模型組比較，平菇多糖組大鼠進入有效區(qū)域 對的運動時間、距離次數(shù)均有所增加，P〈〇.05,在原象限的游泳時間和游泳路程，均有所增 加，表明平菇多糖組能增加 AD大鼠的認知能力，見表4。
[0069]表4各組動物空間搜索實驗數(shù)據(jù)
[0070] 與空白組比較，#P〈0 · 05，##P〈0 · 01;與模型組比較，*P〈0 · 05。
[0071] (4)平菇多糖對AD大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶含量的影響
[0072] 與正常組比較，模型對照組大鼠的腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶水平明顯增加，p〈0.01;與模 型組比較，平菇多糖組腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶水平明顯降低，p〈〇.05,表明平菇多糖能抑制腦內(nèi) 乙酰膽堿酯酶水平，見表5。
[0073] 表5平菇多糖對AD大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶的影響士s,n = 10)
[0075] 與空白組比較，##P〈0 · 01，##P〈0 · 01;與模型組比較，*P〈0 · 05。
[0076] 7、結(jié)論
[0077]跳臺實驗和Morris水迷宮實驗從行為學評價平菇多糖的體內(nèi)抗AD作用，表明平菇 多能增加 AD大鼠記憶獲得、鞏固能力，改善認知障礙;平菇多糖還能降低腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶 含量，有明顯的體內(nèi)抗AD作用。
[0078]實施例3:平菇多糖對AD大鼠腦內(nèi)相關(guān)蛋白表達的影響
[0079]采用免疫蛋白印跡法對分別為空白組、模型組、平菇多糖組(分組參照實施例2)三 組大鼠腦腦組織中p-tau、p-GSK3、Αβ三種蛋白水平進行表達，以GATOH作為內(nèi)參蛋白，使用 image J圖像處理軟件進行灰度分析。
[0080]與空白組比較，模型組Αβ水平及tau、GSK3磷酸化水平增加;與模型組比較，平菇多 糖可降低大鼠腦內(nèi)Αβ水平以及tau、GSK3磷酸化水平，即通過影響Αβ代謝等相關(guān)通路，改善 AD大鼠的認知障礙，結(jié)果見圖3。
[0081 ] 通過采用免疫蛋白印跡法測定AD大鼠腦中p-tau、p-GSK3、Ai3三種蛋白水平含量的 變化，結(jié)果表明，平菇多糖明顯能降低腦內(nèi)與AD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要蛋白Tau、GSK3的磷酸 化水平、降低Αβ蛋白水平，其抗AD機制可能與影響Αβ代謝等相關(guān)通路有關(guān)。
[0082]以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾， 這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 平菇多糖在制備乙酰膽堿酶抑制劑中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述抑制劑為顆粒劑、膠囊劑、粉針劑、片劑、 口服液、丸劑、膏劑中的一種。3. 平菇多糖在制備Αβ蛋白抑制劑中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于，所述抑制劑為顆粒劑、膠囊劑、粉針劑、片劑、 口服液、丸劑、膏劑中的一種。5. 平菇多糖在制備去tau蛋白和/或GSK3蛋白磷酸化水平藥物中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為顆粒劑、膠囊劑、粉針劑、片劑、口 服液、丸劑、膏劑中的一種。7. 平菇多糖在制備治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為顆粒劑、膠囊劑、粉針劑、片劑、口 服液、丸劑、膏劑中的一種。
【文檔編號】A61K31/715GK105902560SQ201610297756
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】張艷, 金剛, 曲小姝, 楊秀東, 張揚, 周鴻立
【申請人】吉林化工學院