環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法
【專利摘要】環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法，涉及環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。通過優(yōu)化Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的密碼子，人工合成環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列，并將基因克隆至載體pUC57?Amp。通過引物擴(kuò)增后得到的糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因cgt與pET?28m質(zhì)粒構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，純化后的蛋白純度高、活力好，為該蛋白的實(shí)際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。通過同源重組表達(dá)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，可以克服分離純化過程復(fù)雜繁瑣、產(chǎn)量低等不足，為該蛋白能廣泛應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】
環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，尤其是涉及Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡 萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)糊精(Cyclodextrin)是指由成環(huán)的葡萄糖基組成的聚合物，葡萄糖基的數(shù)量在 6個及以上。到目前為止主要的三種環(huán)糊精為α-，β_和γ_環(huán)糊精，它們分別含有6個、7個和8 個葡萄糖基。研究證明由于環(huán)糊精的中空桶狀結(jié)構(gòu)使其內(nèi)部具有較強(qiáng)的疏水性，外部卻呈 現(xiàn)較強(qiáng)的親水性質(zhì)，可用于包埋各種疏水的化合物。因此環(huán)糊精在工業(yè)生產(chǎn)以及科學(xué)研究 中具有很大的應(yīng)用性。
[0003] 環(huán)糊精葡萄基轉(zhuǎn)移酶（Cyc 1 odextr in glucanotransferases，CGTase ; EC 2.4.1.19)是一類能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為環(huán)狀葡聚糖的酶，屬于α-淀粉酶、GH13水解酶家族。環(huán) 糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶能夠催化四種反應(yīng)，分別為歧化反應(yīng)(018?1'〇?〇1'1:;[0仙1:;[011)、水解反 應(yīng)(Hydrolysis)、開環(huán)反應(yīng)(Coupling)和環(huán)化反應(yīng)(Cyclization)。根據(jù)酶作用的底物以及 條件的不同，發(fā)生不同的催化作用以及產(chǎn)生不同的產(chǎn)物。
[0004] 自然界中能夠產(chǎn)生環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物有很多，包括芽孢桿菌、假單 胞菌、微球菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌等。到目前為止常用于工業(yè)上生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的 菌種僅包括嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿脂肪芽孢桿菌、軟化芽孢桿菌等少數(shù)幾種。大部分環(huán)糊 精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化淀粉生成的環(huán)糊精種類較雜，專一性較差，且產(chǎn)量也比較低。因此通 過構(gòu)建工程菌，實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的過量表達(dá)成為研究的熱點(diǎn)。
[0005] 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于具有遺傳背景清楚、操作簡單、大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)以及成本 較低等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的表達(dá)系統(tǒng)。近年來環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的可溶性 表達(dá)已取得了較好的結(jié)果，所用的目的基因多來源于芽孢桿菌屬。有人通過將嗜堿脂肪芽 孢桿菌的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因與pET_22b( + )載體質(zhì)粒進(jìn)行重組，在大腸桿菌中 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所得到的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是其天然條件下產(chǎn)量的9倍之多。但是環(huán) 糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)也同樣存在著許多的不足:表達(dá)系統(tǒng)沒有普遍性，部分環(huán) 糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因無法實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)；多數(shù)表達(dá)的酶為環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移 酶，較少α-和γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。因此，尋找具有優(yōu)良性質(zhì)的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移 酶具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因； [0007]本發(fā)明的第二個目的是提供Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的制 備方法；
[0009]本發(fā)明的第四個目的是提供Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生 物學(xué)活性。
[0010] Thermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，編碼Thermococcus sp. 4557 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，記作cgt。
[0011] 所述Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因 cgt的分子類型為DNA，序 列特征：長度為2040bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線性，所述Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因 cgt的序列如下所示，記為SEQ ID No. 1:
[0012]
[0013]
[0014]所述Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列采用以下方法 獲得:在蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的密碼子優(yōu)化改 造，并將基因克隆至載體pUC57-Amp ;以合成序列SEQIDNo.3和SEQIDNo.4作為引物，經(jīng) PCR擴(kuò)增獲得cgt基因核苷酸序列SEQ ID No. 1;相關(guān)的核苷酸序列通過軟件預(yù)測獲得基因 編碼的多肽SEQ ID No.2,然后構(gòu)建原核表達(dá)載體獲得重組表達(dá)蛋白。
[0015] 所述合成序列SEQ ID No.3:CGGGATCCGTACGCCGTTCCGGAACGC。
[0016] 所述合成序列SEQ ID No.4:CCGCTCGAGTAGGGTTCTCA CCGATCGGGC。
[0017] Thermococcus sp . 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，包括具有水解淀粉活性的 Thermococcus sp.4557 CGT〇
[0018] 所述CGT的分子類型為蛋白質(zhì)，序列特征:長度為680aa，類型為氨基酸，所述CGT的 序列如下所示，記為SEQ ID No.2:
[0019]
[0020]
[0021] 所述Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其蛋白具有SEQ ID No. 2所 示氨基酸序列的多肽;或?qū)EQ ID No.2氨基酸序列經(jīng)過至少一個氨基酸殘基的取代、缺失 或添加而形成，且具有與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相似功能的多肽。
[0022] 所述Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，包括以下步驟：
[0023] l)Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶密碼子優(yōu)化改造以及人工合成；
[0024] 2)Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的PCR擴(kuò)增和序列分析；
[0025] 3)Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的重組表達(dá)及純化。
[0026] 本發(fā)明優(yōu)化改造并人工合成Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因， 并將基因克隆至載體pUC57-Amp，通過引物擴(kuò)增、克隆和鑒定了環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因 cgt。通過構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行重組蛋白表達(dá)，克服了原菌分離純化 過程中復(fù)雜繁瑣、產(chǎn)量低等不足。同時純化后的蛋白純度高、活力好，為該蛋白能廣泛應(yīng)用 于生物、食品、醫(yī)藥等研究領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0027] 圖1為cgt基因重組表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖譜。M:蛋白Marker;l:重組載體cgt-pET-28m在菌株BL21 (DE3)的未誘導(dǎo)表達(dá);2:重組載體cgt-pET-28m在菌株BL21 (DE3)的誘導(dǎo) 表達(dá)后超聲破碎后上清;3:重組載體cgt-pET-28m在菌株BL21 (DE3)的誘導(dǎo)表達(dá)超聲破碎后 包涵體。
[0028] 圖2為CGT純化的SDS-PAGE電泳圖譜。M:蛋白Marker; 1:經(jīng)鎳柱介質(zhì)純化所得的目 的蛋白CGT。
[0029] 圖3為溫度對CGT的影響圖譜。橫坐標(biāo)表示不同溫度;縱坐標(biāo)表示CGT的相對活性。
[0030] 圖4為溫度對CGT穩(wěn)定性的影響圖譜。橫坐標(biāo)表示時間；縱坐標(biāo)表達(dá)CGT的相對活 性。
[0031 ] 圖5為pH對CGT的影響圖譜。橫坐標(biāo)表示不同pH;縱坐標(biāo)表示CGT的相對活性。
[0032] 圖6為pH對CGT穩(wěn)定性的影響圖譜。橫坐標(biāo)表示不同pH;縱坐標(biāo)表示CGT的相對活 性。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊（1、薩姆布魯克，拉塞爾（著），黃培堂(譯），《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》， 科學(xué)出版社，2002年，第三版）中所述的實(shí)驗(yàn)條件，或按照試劑或儀器生產(chǎn)廠商所建議的條 件。
[0034] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，其具體步驟是：
[0035] 1 ·人工合成Thermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因
[0036] 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的密碼子優(yōu)化改造在蘇州金唯智生物科技有限公司 進(jìn)行，環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因改造優(yōu)化并合成基因，將基因克隆至載體pUC57-Amp。對 優(yōu)化后獲得的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因命名為cgt。
[0037] 2. Thermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的PCR擴(kuò)增和序列分析 [0038]以Thermococcus sp.4557優(yōu)化改造后序列為模板，用引物F和R擴(kuò)增環(huán)糊精葡萄糖 基轉(zhuǎn)移酶cgt基因。
[0039] F：CGGGATCCGTACGCCGTTCCGGAACGC(SEQ ID No.3)；
[0040] R：CCGCTCGAGTAGGGTTCTCA CCGATCGGGC(SEQ ID No.4)；
[0041] 劃線部分GGATCC代表BamH頂每切位點(diǎn)，GCTAGC代表Xho頂每切位點(diǎn)。
[0042] 在50μ1的反應(yīng)體系中含0.5μ1模板(含有目的基因的載體pUC57-Amp)，lyl引物F (10μΜ)，1μ1 引物R(10yM)，4yl dNTP(各2·5πιΜ)，10μ1 5XPrimerSTAR? Buffer，0.5yl PrimerSTAR? HS DNA Polymerase(2.5UAU)(TaKARa公司），用H2O將總體積補(bǔ)至δΟμΚΡΟ? 反應(yīng)條件為：98°Clmin，30cycles(98°C10s、54°C30s、72°C2min)72°C5min;4°C 保存。PCR 產(chǎn) 物經(jīng)純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ToplO中，菌落PCR后選取有DNA片段 的陽性克隆測序。
[0043] 3.Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)、純化與蛋白復(fù)性 [0044]將含有cgt基因的質(zhì)粒用BamH I和Xho頂每切，膠回收cgt基因片段，同時將質(zhì)粒 pET-28m也用相同的酶進(jìn)行酶切。將兩者連接過夜（12~16h)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感 受態(tài)細(xì)胞T0P10中，提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證。
[0045] 將測序正確的質(zhì)粒cgt-pET-28m轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，37°C生長15小時后菌落PCR驗(yàn)證 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的正確性。挑選轉(zhuǎn)化正確的菌落，接種到500mL含有100mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基 中，37 °C搖培至A6QQ = 0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)至終濃度0.4mM，37 °C誘 導(dǎo)4~5h;將菌液收集至200mL的離心管中，8000g離心10min沉淀細(xì)菌細(xì)胞;將菌體細(xì)胞重新 懸浮在20mL Binding Buffer(50mM磷酸鈉緩沖液，300mM氯化鈉，pH= 7.4)中，超聲波處理 至菌液成半透明，再14000rpm離心20min，棄上清；將包涵體沉淀用含8M尿素的Binding Buffer混勾溶解；待溶解完全后4000g離心5min，所得上清與平衡后的GE Healthcare Ni Sephar〇se(GE公司）室溫結(jié)合過夜。純化過程按照純化試劑盒說明進(jìn)行。純化得到的重組蛋 白CGT經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分析，其分子量約為74kDa，純度達(dá)90%以上（圖l，2)。
[0046]將純化后單一的洗脫液蛋白全部轉(zhuǎn)入透析袋中，放置在含有6M尿素的Binding 811打6^容液于4°(：透析。每隔311更換透析液，使其尿素濃度依次下降（41、21、1.51、1.(^、 0M)。最后獲得的即為復(fù)性CGT蛋白。（若蛋白透析時有沉淀析出，可低轉(zhuǎn)速離心除去沉淀后 繼續(xù)透析）
[0047] 4.重組Thermococcus sp. 4557 CGT的酶學(xué)性質(zhì)
[0048] 4.1藍(lán)值法(2、張樹政.酶制劑工業(yè)[M]，科學(xué)出版社，1984:547)檢測重組環(huán)糊精葡 萄糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活
[0049] 1)在5mL樣品管中加入適量CGI1酶液，加入0.2M甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0) 0.2mL，再加入0.2%馬鈴薯淀粉溶液0.2mL(現(xiàn)配現(xiàn)用），置于一定溫度水浴中放置lOmin; [0050] 2)取出后立即加入0.5M醋酸0.5mL終止反應(yīng)。
[00511 3)加入3mL 0.005%碘液顯色，同時以蒸餾水為空白，未加入酶液的反應(yīng)液為對 照，在700nm波長下測定吸光值(0D)，一個酶活單位定義為使吸光度下降10%所需的酶量， 酶活計(jì)算如下：
[0052] U/mL= (8-13)/&*1000*酶液稀釋倍數(shù) [0053] 式中，a為對照組0D值，b為樣品0D值。
[0054] 4.2重組酶酶學(xué)性質(zhì)的研究
[0055] 1)預(yù)實(shí)驗(yàn)
[0056]分別取5μ1、10μ1、20μ1、30μ1酶液按照步驟4.1中的檢測體系進(jìn)行反應(yīng)，找到最適 加入的酶量進(jìn)行之后的酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)。在保證酶不過量的條件下選取20μ1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該體 系為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系。
[0057] 2)最適反應(yīng)溫度
[0058] 將酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分別置于30~90°C保溫lOmin，測酶活。
[0059] 圖3為溫度對CGT的影響圖譜。橫坐標(biāo)表示不同溫度;縱坐標(biāo)表示CGT的相對活性。
[0060] 3)溫度穩(wěn)定性
[0061 ] 將酶先分別置于30 °C、40 °C、50 °C、60 °C、70 °C、80 °C水浴中，不同時間取出酶液，在 用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體系檢測殘余酶活，以未處理的酶作為對照。
[0062]圖4為溫度對CGT穩(wěn)定性的影響圖譜。橫坐標(biāo)表示時間；縱坐標(biāo)表達(dá)CGT的相對活 性。
[0063] 4)最適反應(yīng)pH
[0064]分別使用NaAc-HAc buffer(4~6)、NaH2P〇4-Na2HP〇4 buffer(6.0~7.5)、Tris-HCl buffer(7 · 5~9 · 0)、Glycine-NaOH buffer(9~11)作為反應(yīng)體系緩沖液以及配置底物溶液 在60°C下檢測酶的活性。
[0065] 圖5為pH對CGT的影響圖譜。橫坐標(biāo)表示不同pH;縱坐標(biāo)表示CGT的相對活性。
[0066] 5)pH 穩(wěn)定性
[0067] 將酶先分別置于他厶(3-骱(：131^€644~6)、他!12?〇4-他2冊〇4 131^€6以6.0~7.5)、 1^8-!1(：1131^€647.5~9.0)、617(^116-恥0!1131^€649~11)緩沖液中，室溫211后，標(biāo)準(zhǔn)反 應(yīng)體系在60 °C檢測殘余酶活。
[0068] 圖6為pH對CGT穩(wěn)定性的影響圖譜。橫坐標(biāo)表示不同pH;縱坐標(biāo)表示CGT的相對活 性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1 .Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其特征在于編碼Thermococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的核巧酸序列，記作cgt。2.如權(quán)利要求1所述化ermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其特征在于 Thermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因 cgt的分子類型為DNA，序列特征：長度 為2040bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線性，所述化ermococ州S sp.4557環(huán)糊精 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因 cgt的序列如下所示，記為SEQ ID No. 1:3. 如權(quán)利要求1所述化ermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其特征在于 其核巧酸序列采用W下方法獲得:進(jìn)行環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的密碼子優(yōu)化改造，并 將基因克隆至載體pU巧7-Amp合成序列SEQ ID No.3和合成序列SEQ ID No.4作為引物， 經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得cgt基因核巧酸序列SEQ ID No. 1;相關(guān)的核巧酸序列通過軟件預(yù)測獲得基 因編碼的多膚SEQ ID No.2,然后構(gòu)建原核表達(dá)載體獲得重組表達(dá)蛋白。 4. Thermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于包括具有水解淀粉活性 的Thermococ州S sp.4557 CGT。5. 如權(quán)利要求4所述化ermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于所述 CGT的分子類型為蛋白質(zhì)，序列特征：長度為680aa，類型為氨基酸，所述CGT的序列如下所 示，記為沈Q ID No.2:481 G朗陡化I鉛VTPYIA離視的LIGGA邸G 3S蝕Π 防&V MR化SW雌了閒LV'邸班祁 巧41 TE艙機(jī)。VV'V ETG(滿A組PA化腳挖駐⑩L PALIAWATPI IT嫌Lfl路S LPEL施P邸L 601 邱SST約?ΡΤ mPWN抑.仲' S呢I:^T巧哪駆LRPLNVTL YGFV殿TWF L肌胖PTV即 661 ETAMMF巧T I視邸 IGENP。6. 如權(quán)利要求5所述化ermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于其蛋 白具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多膚;或 將SEQ ID No.2氨基酸序列經(jīng)過至少一個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成，且具 有與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相似功能的多膚。7. 如權(quán)利要求4所述化ermococcus sp. 4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特 征在于包括W下步驟： 1 )The;rmococcus sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶密碼子優(yōu)化改造 W及人工合成； 2. The;rmococ州S sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的PCR擴(kuò)增和序列分析； 3. The;rmococ州S sp.4557環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的重組表達(dá)及純化。
【文檔編號】C12N15/54GK105936912SQ201610490579
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】阮靈偉, 施泓, 徐洵, 董琦
【申請人】國家海洋局第三海洋研究所