轉(zhuǎn)基因斑馬魚系在評價藥物耐藥性上的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚系在評價藥物耐藥性上的應(yīng)用，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚系是以不改變斑馬魚abcb4基因表達為前提，而通過增強型綠色熒光蛋白（EGFP）監(jiān)測abcb4基因表達變化情況的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。即該轉(zhuǎn)基因斑馬魚系是以abcb4基因啟動子來驅(qū)動EGFP表達的Tg(abcb4:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。本發(fā)明建立一個以不改變斑馬魚abcb4基因（同源于人類ABCB1基因）表達為前提，而通過增強型綠色熒光蛋白（EGFP）監(jiān)測abcb4基因表達變化情況的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。本發(fā)明為abcb4基因在多藥耐藥機制研究提供前期實驗基礎(chǔ)，以解決抗腫瘤新藥在篩選中耐藥性評估的問題。
【專利說明】
轉(zhuǎn)基因斑馬魚系在評價藥物耐藥性上的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚系在評價-藥物耐藥性上的應(yīng)用，以及在新藥篩選 上應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 多藥耐藥(multidrug-resistance，MDR)是腫瘤化療失敗的常見原因，然而對于目 前來說，化療依舊癌癥治療的主要方法。故在判斷癌癥預(yù)后和存活率上，是否產(chǎn)生多藥耐藥 成為了重要的指標(biāo)。而多藥耐藥的定義是指，對于結(jié)構(gòu)及藥理不同的多種藥物，腫瘤同時產(chǎn) 生了耐藥。多藥耐藥產(chǎn)生的機制有多種，傳統(tǒng)的觀點認為是因為腫瘤中的某些細胞發(fā)生了 基因突變而導(dǎo)致的，但是一些病理生理因素，如缺氧、調(diào)控癌基因、腫瘤抑制基因、細胞凋亡 因子的變化也都可能促進對多藥耐藥的發(fā)生。然而，由ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette， ABC)轉(zhuǎn)運蛋白家族所介導(dǎo)的細胞藥物外排作用，才是多藥耐藥產(chǎn)生的主要機制。
[0003] ABCB1作為ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運體成員之一，在生理狀態(tài) 下，主要參與內(nèi)、外源物質(zhì)和毒素的吸收、分布、排泄等，對組織器官起保護和防御作用，其 主要分布于哺乳動物的上皮細胞表面頂層，包括結(jié)腸、小腸、胰腺、膽管、膽汁、腎臟近端小 管、腎上腺等。它還分布在血腦屏障(bloodbrain barrier，BBB)的內(nèi)皮細胞，可將內(nèi)皮細胞 的毒素和藥物排泄到血管腔中，從而保護腦組織。
[0004] 大量研究顯示，ABCB1的高表達在產(chǎn)生多藥耐藥的腫瘤細胞中普遍存在，尤其是在 血液系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤中。檢測患者腫瘤細胞中ABCB1的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)易發(fā)生多藥 耐藥的患者中，其ABCB1的mRNA表達水平都較高于其他患者。并且大量體外腫瘤耐藥細胞株 中的研究表明，ABCB1基因以及其編碼的蛋白在腫瘤耐藥細胞中都有明顯升高，在多藥耐藥 中起著關(guān)鍵作用。
[0005] 斑馬魚ABCD4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法同樣為ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運體成員之一，斑馬魚AB⑶4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法基因位于人 類第7號染色體上。肝細胞對于各種化合物的外排，主要是由ABC轉(zhuǎn)運體蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運作用。 而斑馬魚ABCD4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法存在于人類的肝臟的肝細胞的小管膜上， 同樣通過水解ATP獲得能量，將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)透過肝小葉膽管 膜，轉(zhuǎn)運進入膽汁并與膽汁酸形成微膠粒，從而能保護膽管不受膽汁酸所引起的損害，在正 常膽汁中有著重要作用。
[0006] 在研究腫瘤多藥耐藥機制的同時，如何克服腫瘤多藥耐藥的問題一直是廣大學(xué)者 廣泛關(guān)注的問題。尤其是在藥物開發(fā)的過程中，如何預(yù)見抗腫瘤藥物的多藥耐藥性形成的 可能性?故用ABCB1作為多藥耐藥篩選的靶點進行藥物耐藥性的初篩研究已成熱點。如在腫 瘤細胞株中過度表達ABCB1，使該細胞株作為抗腫瘤藥物篩選的靶點判斷其療效，以及在體 外腫瘤細胞株中，研究針對ABCB1及其相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運蛋白的抑制劑來克服腫瘤多藥耐藥。后 者目前已批準(zhǔn)進行臨床研究，其臨床應(yīng)用效果尚不令人滿意。
[0007] 動物模型研究中，早在1994年荷蘭腫瘤研究所的Schinkel等就建立了Abcbla基因 (同源于人類ABCB1基因）等位基因缺失的小鼠。通過該小鼠與正常小鼠的比較發(fā)現(xiàn)，P-gp大 量的分布于血腦屏障（b 1 oodbrain barri er，BBB);同時，該小鼠許多組織中的藥物濃度明 顯增高，尤其是腦部組織。且藥物自身清除率也明顯降低。而關(guān)于P-gp在Abcbla(-/_)小鼠 中的研究，至今依舊備受關(guān)注。并且針對的ABCB1(或P-gp)抑制劑的研發(fā)，小鼠上也有所進 行。而斑馬魚abcd4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法基因（同源于人類斑馬魚AB⑶4基因啟 動子及其預(yù)測和克隆方法基因）等位基因缺失的小鼠，也在1993年被Smit等建立，通過該小 鼠與正常小鼠的比較發(fā)現(xiàn)，這種小鼠不能分泌卵磷脂進人膽汁。而至今斑馬魚abcd4基因啟 動子及其預(yù)測和克隆方法(-/_)小鼠模型依舊作為研究肝臟、胰腺腫瘤發(fā)生、進展中相關(guān)的 致癌因素的工具同樣也備受關(guān)注。
[0008] 然而，目前已開展的研究仍存在諸多局限性。腫瘤細胞株的體外研究相對于體內(nèi) 并不系統(tǒng)，不能系統(tǒng)性的反應(yīng)ABCB1基因體內(nèi)多藥耐藥中的作用，以致腫瘤藥物多藥耐藥篩 選的片面性。而使用小鼠類哺乳動物建模由于動物生長周期長，無法連續(xù)和有效地示蹤沾 染基因的表達和細胞的分化發(fā)育過程，同樣為Abcbla基因在腫瘤藥物多藥耐藥篩選中帶來 很大的困難。所以在腫瘤藥物多藥耐藥的篩選過程中，尚缺乏有效的高通量、活體的動物篩 選模型，故建立一個有效的、高通量的、活體的、多藥耐藥篩選動物模型，是一項具有創(chuàng)新性 的研究工作，不但可深入系統(tǒng)地開展了ABCB1基因及其編碼蛋白ABCB1 (或P-gp)的功能研 究，同時對于尋找針對多藥耐藥的靶向方法和藥物，開發(fā)出選擇性高，毒副作用小并不易發(fā) 生多藥耐藥的抗癌新藥提供重要的活體高通量篩選模型，具有重要的科學(xué)價值和巨大的應(yīng) 用前景。
[0009] 斑馬魚（zebrafish)是近年來新興的"四維"模式生物，其為原產(chǎn)于印度的硬骨魚 類。在高通量、小分子篩查中體現(xiàn)出來了體積小、易吸收和相對經(jīng)濟等優(yōu)點，且繁殖力強(每 周可產(chǎn)胚胎200枚左右）、生長發(fā)育快(2個月就可成年），這是其他實驗動物所不具備的。斑 馬魚在轉(zhuǎn)基因篩、基因敲除、基因突變中也體現(xiàn)出了特定的優(yōu)勢，是研究脊椎動物發(fā)育機制 及其基因功能的理想模式生物。斑馬魚在進化過程中，發(fā)育與同其他脊椎動物一樣高度保 守，是目前生物發(fā)育學(xué)研究中重要的模式生物。同時，斑馬魚作為新興的模式生物，它的全 基因組測序工作已經(jīng)完成，其具有與人類高度保守的發(fā)育和疾病基因及信號傳導(dǎo)通路，是 研究人類發(fā)育和疾病信號傳導(dǎo)路徑及活體內(nèi)進行高通量先導(dǎo)藥物篩選的最佳模式生物之 〇
[0010] 斑馬魚自上世紀末開始逐漸成為生命科學(xué)研究的優(yōu)勢實驗?zāi)Ｊ缴铩＝陙?，?馬魚的應(yīng)用和研究進展尤為迅速。目前許多斑馬魚疾病模型已經(jīng)建立，涉及心臟疾病、白血 病以及多器官腫瘤包括黑色素瘤、胰腺癌、肝癌和結(jié)腸癌等。這些疾病模型能夠幫助研究者 深入系統(tǒng)地研究各類疾病發(fā)生發(fā)展的機制和干預(yù)手段，目前這類研究成果層出不窮，被公 認為生命科學(xué)領(lǐng)域熱門的研究工具。
[0011]生物信息學(xué)分析證實斑馬魚中不存在abcbl基因，但與人類ABCB1基因具有同源性 的斑馬魚abcd4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法、abcb5基因及其相關(guān)基因的研究卻有所報 道。根據(jù)國外文獻報道，斑馬魚斑馬魚abcd4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法在魚體內(nèi)中與 多種有毒化合物轉(zhuǎn)運密切相關(guān)，且參與阻礙化學(xué)物質(zhì)的吸收。而人類斑馬魚ABCD4基因啟動 子及其預(yù)測和克隆方法同樣為ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運體成員之一， 斑馬魚ABCD4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法編碼基因位于人類第7號染色體上。肝細胞對 于各種化合物的外排，主要是由ABC轉(zhuǎn)運體蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運作用。而斑馬魚ABCD4基因啟動子 及其預(yù)測和克隆方法存在于人類的肝臟的肝細胞的小管膜上，同樣通過水解ATP獲得能量， 將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)透過肝小葉膽管膜，轉(zhuǎn)運進入膽汁并與膽汁酸 形成微膠粒，從而能保護膽管不受膽汁酸所引起的損害，在正常膽汁中有著重要作用。但在 斑馬魚中目前并沒有檢測到磷脂酰膽堿或者膽汁，故相較于人類斑馬魚ABCD4基因啟動子 及其預(yù)測和克隆方法，斑馬魚斑馬魚abcd4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法的功能可能更 近似于ABCB1且不同于斑馬魚AB⑶4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法。而對于abcb5基因來 說，硝苯地平、克霉唑、大黃素等藥物也能誘導(dǎo)abcb5基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平增高。但 是在長春新堿、長春花堿、麝香以及菲等藥物和化合物的研究中，斑馬魚abcd4基因啟動子 及其預(yù)測和克隆方法作為對抗化學(xué)毒物的細胞毒物轉(zhuǎn)運體而被報道。其中提到通過抑制物 和Morpho 1 ino下調(diào)斑馬魚的斑馬魚abcd4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法基因，可以增加 熒光底物在胚胎組織中的累積量和對有毒化合物的敏感性，但是相比abcb5基因卻不存在 這種影響。所以斑馬魚abcd4基因啟動子及其預(yù)測和克隆方法、abcb5基因在斑馬魚多藥耐 藥機制中的所起的作用尚不完全清楚。且基于多藥耐藥研究的斑馬魚abcd4基因啟動子及 其預(yù)測和克隆方法轉(zhuǎn)基因斑馬魚動物模型尚未有建立。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問題是提供一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚系在評價藥物耐藥性上 的應(yīng)用，通過預(yù)測、克隆斑馬魚abcd4基因啟動子，并構(gòu)建出轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，從而建立一種 可以用于篩選抗腫瘤藥物的動物模型。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下內(nèi)容： 轉(zhuǎn)基因斑馬魚系在評價藥物耐藥性上的應(yīng)用，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚系是以不改變斑馬魚 abcb4基因表達為前提，而通過增強型綠色熒光蛋白（EGFP)監(jiān)測abcb4基因表達變化情況的 轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，即以abcb4基因啟動子來驅(qū)動EGFP表達的zTM akM:抓/刊轉(zhuǎn)基因斑馬魚 系。
[0014] 該應(yīng)用是通過以下步驟實現(xiàn)的：預(yù)測及克隆斑馬魚基因啟動子并對該斑馬 魚akM基因啟動子進行測效;通過akM基因啟動子7W2重組質(zhì)粒構(gòu)建、To 12轉(zhuǎn)座酶mRNA 體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座子T〇12系統(tǒng)胚胎顯微注射的步驟建立該轉(zhuǎn)基因斑馬魚系;對該轉(zhuǎn)基因斑馬 魚系進行鑒定和擴增;在體式顯微鏡下，挑選發(fā)育正常的轉(zhuǎn)基因斑馬魚純合子4~8個細胞期 階段的受精卵胚胎，進行藥物處理，收集藥物處理中不同時相的斑馬魚胚胎，通過綠色熒光 蛋白的表達變化情況，來判斷和評估藥物發(fā)生耐藥性的可能性，從而實現(xiàn)藥物發(fā)生耐藥性 的預(yù)評估，對新藥功能評價有重要的價值。
[0015] 本發(fā)明建立一個以不改變斑馬魚abcb4基因（同源于人類ABCB1基因）表達為前提， 而通過增強型綠色熒光蛋白（EGFP)監(jiān)測abcb4基因表達變化情況的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。即以 abcb4基因啟動子來驅(qū)動EGFP表達的Tg(abcb4:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。為接下來的abcb4基 因在多藥耐藥機制研究提供前期實驗基礎(chǔ)。同時也解決了目前已開展的研究仍存在諸多局 限性。如腫瘤細胞株的體外研究相對于體內(nèi)并不系統(tǒng)，不能系統(tǒng)性的反應(yīng)ABCB1基因體內(nèi)多 藥耐藥中的作用，以致腫瘤藥物多藥耐藥篩選的片面性。而使用小鼠類哺乳動物建模由于 動物生長周期長，無法連續(xù)和有效地示蹤沾染基因的表達和細胞的分化發(fā)育過程等。
【附圖說明】 [0016] 圖1是Tol2(abcb4-EGFP)重組質(zhì)粒圖； 圖2是轉(zhuǎn)基因斑馬魚(fi游切6bcb4:EGFP)熒光表現(xiàn)示意圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0018] 實施例1: 1斑馬魚基因啟動子預(yù)測及克隆 1.1斑馬魚基因啟動子預(yù)測 根據(jù)NCBI網(wǎng)站，通過生物信息學(xué)分析，將斑馬魚基因轉(zhuǎn)錄起始位點至上游adaml5 基因之間約8000bp左右的基因序列作為模板，經(jīng)Promoter 2.0 Prediction Server啟動子 預(yù)測網(wǎng)站，進行啟動子范圍預(yù)測。
[0019] 1.2斑馬魚akM基因啟動子克隆 (1) 選取5dpf斑馬魚胚胎約20~30枚，放入RNAse-Free的1 · 5ml Epp管中，1 Xros溶液 清洗胚胎； (2) 清洗完畢后，加入500μ1 Lysis Buffer(其中含有蛋白酶K，終濃度為0.17mg/ml)， 密封后55 °C水浴消化1小時； (3) 室溫14000rpm離心10分鐘，取上清至新的RNAse-Free 1.5ml Epp管中； (4) 向上述Epp管中加入500μ1酚/氯仿混合液（1:1)，劇烈震蕩15秒，室溫14000rpm離 心10分鐘； (5) 取上清，移至新的RNAse-Free的1.5ml Epp管中，加入冰上預(yù)冷的900μ1 75%乙醇+ 1〇〇μ1醋酸鈉(濃度3Μ，ΡΗ6.0)，輕柔混勻，冰上放置10分鐘，14000rpm，4°C離心30分鐘； (6) 棄上清，加入lml冰上預(yù)冷的70%乙醇，洗滌沉淀后，7500rpm，4°C離心5分鐘，此步 驟重復(fù)兩遍； (7) 棄上清，室溫干燥20分鐘后，加50μ1 DEPC水，密封后于55 °C水浴10分鐘，助沉淀溶 解； (8) 取ΙμL基因組DNA樣品，通過1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測所提取DNA片段大小情況。檢 測完畢后于_70°C冰箱保存。
[0020] (9)根據(jù)預(yù)測范圍，并加入處〇1、油61酶切位點以及保護堿基序列通過Primer Premier 6.0軟件設(shè)計特異性引物，并由北京奧維森基因科技有限公司合成。序列如下:F: 5'- CCGCTCGAGGGCCTGGAAACATTTCTTC-3' R: 5 '-CTAGCTAGCTTGCTGTTATCTCAGATGCT-3' (1 〇)以提取的斑馬魚基因組DNA為模板，進行基因啟動子PCR擴增。條件如下:94 °C預(yù)變性2min;94°C變性158、60°(：退火3〇8、68°(：延伸1111丨11共35次循環(huán)；最后延伸68 1€ 1 Omin。PCR產(chǎn)物大小約為1532bp，1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
[0021] 2斑馬魚基因啟動子測效 2.1 組質(zhì)粒構(gòu)建 (1) 通過氯化鈣法，將E.coli DH5a制備感受態(tài)菌； (2) 通過轉(zhuǎn)化方式，向E.coli DH5a感受態(tài)菌內(nèi)轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，并經(jīng)氨芐青霉素 抗性藥物篩選，挑選陽性克隆。轉(zhuǎn)化方式如下： 1) 于-70°C冰箱中，取裝有200μ1 E.coli DH5a感受態(tài)菌的〇.6ml Epp管，置于冰上融 化12分鐘； 2) 待融化過后，向E.coli DH5a感受態(tài)菌中，加入〇.5μ1 質(zhì)粒，并吹吸混 勻，置于冰上30分鐘； 3) 冰上30分鐘結(jié)束后，將Epp管密封置于42°C水浴箱中，熱激90秒后，立即插入冰中5 分鐘； 4) 向Epp管中加入300μ1無抗性LB液體培養(yǎng)基，置于恒溫搖床上，160rpm，37°C溫育45 分鐘； 5) 充分混勻后，通過劃線接種的方式，將E.coli DH5a感受態(tài)菌涂于加有氨芐青霉素 的LB固體培養(yǎng)基平板中； 6) 正放5分鐘后，37 °C倒置培養(yǎng)過夜； (3) 選取氨節(jié)青霉素抗性陽性的單克隆，移至3ml加有氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 置于恒溫搖床上，190rpm，37°C振蕩培養(yǎng)10~14小時； (4) 取出過夜培養(yǎng)的菌液，通過Axygen質(zhì)粒小抽試劑盒，提取擴增的質(zhì)粒DNA。方 法如下： 1) 取3ml菌液至1.5ml Epp管中，12000rpm離心1分鐘； 2) 棄上層清液，加入250μ1經(jīng)RNase A處理過的Buffer S1重懸； 3) 充分重懸完畢后，立即加入250μ1 Buffer S2,上下溫和翻轉(zhuǎn)4~6次； 4) 待溶液透亮后，加入350μ1 Buffer S3,同樣上下溫和翻轉(zhuǎn)6~8次后，12000rpm離心 15分鐘； 5) 吸取上層清液，移至套上回收管的DNA制備管中，12000rpm離心1分鐘； 6) 棄掉廢液，并加入500μ1 Buffer Wl，12000rpm離心1分鐘； 7) 棄掉廢液，并加入700μ1 Buffer W2，12000rpm離心1分鐘;此步驟重復(fù)兩次； 8) 棄掉廢液后，12000rpm空甩離心1分鐘； 9) 將回收管換為新的1.5ml Epp管，在DNA制備管的膜中央加入50μ1 DEPC水，靜止2分 鐘后，12000rpm離心1分鐘； 10) 棄制備管，從Epp管中吸取lyl提取產(chǎn)物，經(jīng)One Drop進行定量，并用1%瓊脂糖凝膠 進行電泳鑒定； (5) 將akM基因啟動子PCR產(chǎn)物以及提取得到的質(zhì)粒分別進行A*el以及 覓〇1雙酶切； (6) 酶切完畢后，將酶切過的akM基因啟動子PCR產(chǎn)物以及提取得到的 粒進行割膠回收，具體方法同前； (7) 將回收的經(jīng)以及ΙΑοΙ雙酶切的akM基因啟動子PCR產(chǎn)物以及提取得到的 質(zhì)粒，通過T4連接酶進行連接，25°C連接過夜； (8) 將連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入E.coli DH5a感受態(tài)菌中，并經(jīng)氨芐青霉素抗性 藥物篩選，挑選陽性克隆。菌落擴增后運用Axgen質(zhì)粒小抽試劑盒提取質(zhì)粒DNA，具體方法同 、r ' 刖； (9) 組質(zhì)粒的鑒定： 1) 經(jīng)油61以及覓〇1雙酶切冰HakM/重組質(zhì)粒，進行酶切鑒定，并通過1%的瓊脂糖 凝膠電泳鑒定目的DNA片段大小是否正確； 2) 將重組質(zhì)粒送至北京奧維森基因科技有限公司進行序列測定鑒定。 [0022] 2.2 K562細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 使用Gibco ? RPMI 1640培養(yǎng)基(其含有10%胎牛血清)對K562細胞于5%C02、37°C、飽和 濕度的條件下進行細胞培養(yǎng)。細胞于培養(yǎng)基中懸浮生長，選取對數(shù)生長期細胞用于實驗。
[0023] (1)取Lipofectamine? 2000 Reagent 10μ1 加至Opti-MEM? Medium 100μΙ中混 勻。
[0024] (2)取兩組質(zhì)粒（即和你質(zhì)粒組、你質(zhì)粒 組）各lyg(每種質(zhì)粒500ng)分別加入50μ1 Opti-MEM? Medium中混勾。
[0025] (3)取步驟（1)中混勻試劑各50μ1，分別與步驟2中兩混勻組各50μ1混合，混勻并 室溫孵育5min。
[0026] (4)將K562細胞以800rpm/min離心后，用Opti-MEM? Medium重懸。重懸充分后以 每孔2 X 105個細胞接種于24孔板中。兩質(zhì)粒組，每組5孔。
[0027] (5)將步驟3中孵育液在25min內(nèi)分別加入步驟4中對應(yīng)孔內(nèi)，每孔加入孵育液100 μL。保證每孔每種質(zhì)粒終量約為500ng，Lipofectamine? 2000 Reagent每孔終量約為1 ·0~ 2·5μ1。輕輕搖勻后，置于37°C，5%C02中培養(yǎng)4~6h。之后每孔各補Opti-MEM? Medium 500μ 1，繼續(xù)放置于37°C，5 %C02中培養(yǎng)3天。3天后進行akM基因啟動子測效分析。（注:培養(yǎng)體 系中未加雙抗，不影響實驗結(jié)果。） 2.3轉(zhuǎn)染后K562細胞熒光素酶活性測定 (1) 將24孔板中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的兩組K562細胞，及正常培養(yǎng)的K562細胞從恒溫孵箱中取 出，各吸取至無菌25ml離心管中，以800rpm/min離心后使用1 XPBS溶液清洗細胞，2次； (2) 各加入Gibco? RPMI 1640 Medium重懸，重懸充分后以75μ1加入不透光的96孔板 中，每孔每組細胞終量約1 X 1〇4個細胞； (3) 向每孔中加入75μ1 Dual-Glo? Luciferase Reagent，充分混勾； (4) 待25°C孵育1.5小時，讓細胞充分裂解后，在BioTek Synergy2多功能酶標(biāo)儀中測 量螢火蟲螢光； (5) 向每孔中加入75μ1 Dual-Glo? Stop & Glo? Reagent，充分混勾； (6) 25°C孵育1.5小時后，在BioTek Synergy2多功能酶標(biāo)儀中測量海腎螢光； (7) 樣品數(shù)據(jù)通過Gen5軟件進行處理，計算公式為：
3 轉(zhuǎn)基因斑馬魚的建立 3.1 akM基因啟動子組質(zhì)粒構(gòu)建 (1) 通過氯化鈣法，將E.coli DH5a制備感受態(tài)菌； (2) 通過轉(zhuǎn)化方式，向E.coli DH5a感受態(tài)菌內(nèi)轉(zhuǎn)入7WJ?質(zhì)粒，并經(jīng)氨芐青霉素抗性藥 物篩選，挑選陽性克隆。轉(zhuǎn)化方式如下： 1) 于-70°c冰箱中，取裝有200μ1 E.coli DH5a感受態(tài)菌的〇.6ml Epp管，置于冰上融 化12分鐘； 2) 待融化過后，向E.coli DH5a感受態(tài)菌中，加入〇.5μ1 質(zhì)粒，并吹吸混勻，置于 冰上30分鐘； 3) 冰上30分鐘結(jié)束后，將Epp管密封置于42°C水浴箱中，熱激90秒后，立即插入冰中5 分鐘； 4) 向Epp管中加入300μ1無抗性LB液體培養(yǎng)基，置于恒溫搖床上，160rpm，37°C溫育45 分鐘； 5) 充分混勻后，通過劃線接種的方式，將E.coli DH5a感受態(tài)菌涂于加有氨芐青霉素 的LB固體培養(yǎng)基平板中； 6) 正放5分鐘后，37 °C倒置培養(yǎng)過夜； (3) 選取氨節(jié)青霉素抗性陽性的單克隆，移至3ml加有氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 置于恒溫搖床上，190rpm，37°C振蕩培養(yǎng)10~14小時； (4) 取出過夜培養(yǎng)的菌液，通過Axygen質(zhì)粒小抽試劑盒，取提擴增的質(zhì)粒DNA。方 法如下： 1) 取3ml菌液至1.5ml Epp管中，12000rpm離心1分鐘； 2) 棄上層清液，加入250μ1經(jīng)RNase A處理過的Buffer S1重懸； 3) 充分重懸完畢后，立即加入250μ1 Buffer S2,上下溫和翻轉(zhuǎn)4~6次； 4) 待溶液透亮后，加入350μ1 Buffer S3,同樣上下溫和翻轉(zhuǎn)6~8次后，12000rpm離心 15分鐘； 5) 吸取上層清液，移至套上回收管的DNA制備管中，12000rpm離心1分鐘； 6) 棄掉廢液，并加入500μ1 Buffer Wl，12000rpm離心1分鐘； 7) 棄掉廢液，并加入700μ1 Buffer W2，12000rpm離心1分鐘;此步驟重復(fù)兩次； 8) 棄掉廢液后，12000rpm空甩離心1分鐘； 9) 將回收管換為新的1.5ml Epp管，在DNA制備管的膜中央加入50μ1 DEPC水，靜止2分 鐘后，12000rpm離心1分鐘； 10) 棄制備管，從Epp管中吸取lyl提取產(chǎn)物，經(jīng)One Drop進行定量，并用1%瓊脂糖凝膠 進行電泳鑒定； (5) 將EGFP基因 PCR片段以及提取得到的7WJ?質(zhì)粒分別進行Mel以及feoR紀雙酶切； (6) 酶切完畢后，將酶切過的EGFP基因 PCR片段以及提取得到的rWJ?質(zhì)粒進行割膠回 收，具體方法同前； (7) 將回收的經(jīng)Mel以及價〇R妒雙酶切的EGFP基因 PCR片段以及提取得到的7WJ?質(zhì) 粒，通過T4連接酶進行連接，25 °C連接過夜； (8) 將連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入E.coli DH5a感受態(tài)菌中，并經(jīng)氨芐青霉素抗性 藥物篩選，挑選陽性克隆。菌落擴增后運用Axgen質(zhì)粒小抽試劑盒提取質(zhì)粒DNA，具體方法同 、r ' 刖； (9) 7b以-及重組質(zhì)粒的鑒定： 1)經(jīng)崩^1以及及雙酶切及滬/重組質(zhì)粒，進行酶切鑒定，并通過1%的瓊脂糖 凝膠電泳鑒定目的DNA片段大小是否正確； 2)將7b^?_及重組質(zhì)粒送至北京奧維森基因科技有限公司進行序列測定鑒定。 [0028] (10)通過轉(zhuǎn)化方式，向E.coli DH5a感受態(tài)菌內(nèi)轉(zhuǎn)入鑒定正確的7b以-五質(zhì)粒， 并經(jīng)氨芐青霉素抗性藥物篩選，挑選陽性克?。?(11) 選取氨節(jié)青霉素抗性陽性的單克隆，移至3ml加有氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，置于恒溫搖床上，190rpm，37°C振蕩培養(yǎng)10~14小時； (12) 取出過夜培養(yǎng)的菌液，通過Axygen質(zhì)粒小抽試劑盒，提取擴增的孤逆質(zhì)粒； (13) 將akM基因啟動子PCR產(chǎn)物以及提取得到的TbM-及;質(zhì)粒分別進行處〇1以及 A*el雙酶切； (14) 酶切完畢后，將酶切過的akM基因啟動子PCR產(chǎn)物以及提取得到的7b^?_五G/y質(zhì) 粒進行割膠回收，具體方法同前； (15) 將回收的經(jīng)處〇1以及A*el雙酶切的akM基因啟動子PCR產(chǎn)物以及提取得到的 TbM-及;質(zhì)粒，通過T4連接酶進行連接，25°C連接過夜； (16) 將連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入E.coli DH5a感受態(tài)菌中，并經(jīng)氨芐青霉素抗性 藥物篩選，挑選陽性克隆。菌落擴增后運用Axgen質(zhì)粒小抽試劑盒提取質(zhì)粒DNA，具體方法同 、r ' 刖； (17) 7b以重組質(zhì)粒的鑒定： 1) 經(jīng)處〇1以及Mel雙酶切7b以-akM;及沢重組質(zhì)粒，進行酶切鑒定，并通過1%的瓊 脂糖凝膠電泳鑒定目的DNA片段大小是否正確； 2) 將及滬/重組質(zhì)粒送至北京奧維森基因科技有限公司進行序列測定鑒 定。
[0029] 3.2 To 12轉(zhuǎn)座酶mRNA體外轉(zhuǎn)錄 (1) 將/76^-77?組質(zhì)粒經(jīng)Notl單酶切后線性化質(zhì)粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，再 割膠回收線性化后的質(zhì)粒DNA; (2) 將線性化/7CS-TP質(zhì)粒作為模板，使用Sp6聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄，經(jīng)2小時，37 °C反應(yīng) 后，得到Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA; (3) 經(jīng)NucAway? Spin Columns純化吸附柱回收mRNA后，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進行定 性分析，以及經(jīng)One Drop儀器進行定量分析，將分裝mRNA后于-70°C保存。
[0030] 3.3轉(zhuǎn)座子T〇12系統(tǒng)胚胎顯微注射 (1) 將7^2-3/^1孤/;7重組質(zhì)粒0嫩及1'〇12轉(zhuǎn)座酶1111?嫩進行純化和混合?；旌虾髢烧?終濃度均為250ng/yl，冰上待用； (2) 選取發(fā)育正常的野生型斑馬魚單細胞期胚胎，置于瓊脂糖凝膠注射板上； (3) 將擺放完畢的斑馬魚胚胎置于體視顯微鏡下，顯微注射針吸取混合溶液約2μ1; (4) 通過顯微注射儀，向斑馬魚單細胞期胚胎的細胞中，以每枚胚胎約0.005 μL注入 7b以滬/重組質(zhì)粒DNA及To 12轉(zhuǎn)座酶mRNA混合溶液； (5) 將注射完畢的斑馬魚胚胎進行飼養(yǎng)，待以后實驗所用。
[0031] 4 轉(zhuǎn)基因斑馬魚的鑒定 4.1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚熒光表達及基因組測序鑒定 (1)收集顯微注射完畢后的胚胎，通過熒光顯微鏡選取存在綠色熒光信號的胚胎進行 飼養(yǎng)。將其定為及滬朽轉(zhuǎn)基因斑馬魚Fo代。
[0032] (2)隨后將Fo代的成魚與野生型斑馬魚成魚進行交配，產(chǎn)出Fi代斑馬魚胚胎，選取 存在正確綠色熒光信號的Fi代胚胎提取基因組DNA，根據(jù)akM.·及轉(zhuǎn)基因特定序列，經(jīng) Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物，進行PCR鑒定： F: 5'-GGCCTGGAAACATTTCTTC-3' ，R: 5'-GTCCATGCCGAGAGTGAT-3' PCR擴增條件：94°C預(yù)變性2min;94°C變性15s、60°C退火30s、68°C延伸lmin共35次循 環(huán);最后延伸68°C lOmiruPCR產(chǎn)物大小為約為2260bp，1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
[0033] (3)再將基因組鑒定正確的FHf胚胎進行飼養(yǎng)，待為成魚后與野生型斑馬魚成魚 進行交配，通過胚胎綠色熒光情況，篩選出產(chǎn)出h代純合子。
[0034] (4)通過Fi代純合子自交的方式，產(chǎn)出F2代純合子胚胎，選取存在正確熒光信號的 F2代進行同樣基因組鑒定工作。
[0035] (5)再將基因組鑒定正確的^代純合子胚胎進行飼養(yǎng)，待為成魚后進行交配，產(chǎn) 出F3代純合子胚胎，選取存在正確熒光信號的F3代純合子胚胎進行同樣基因組鑒定。
[0036] 4.2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚功能性初步鑒定 在體式顯微鏡下，挑選發(fā)育正常的rgfakM.·及;7史」轉(zhuǎn)基因斑馬魚純合子4~8個細胞期 階段的受精卵胚胎，于6孔培養(yǎng)板中進行川你〇2阿霉素藥物處理，每孔20枚，28°C恒溫保 存，暴露時間為120小時。
[0037]收集藥物處理中48、72、96、120小時四個時相的斑馬魚胚胎，對綠色熒光表達變化 進行初步鑒定及評估。為確保實驗準(zhǔn)確，相同實驗條件下重復(fù)3次。
[0038]當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實施方式，凡采用等同 替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 轉(zhuǎn)基因斑馬魚系在評價藥物耐藥性上的應(yīng)用，其特征在于：該轉(zhuǎn)基因斑馬魚系是以 不改變斑馬魚abcb4基因表達為前提，而通過增強型綠色熒光蛋白（EGFP)監(jiān)測abcb4基因表 達變化情況的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，即以abcb4基因啟動子來驅(qū)動EGFP表達的Tg(abcb4: EGFP) 轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系在評價藥物耐藥性上的應(yīng)用，其特征在于:它 是通過以下步驟實現(xiàn)的：預(yù)測及克隆斑馬魚基因啟動子并對該斑馬魚基因啟動 子進行測效;將基因啟動子克隆后，通過基因工程技術(shù)，將該啟動子序列導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因 組質(zhì)粒中、通過轉(zhuǎn)座子To 12轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，建立該轉(zhuǎn)基因斑馬魚系;對該轉(zhuǎn)基因斑馬魚 系進行鑒定和擴增;在體式顯微鏡下，挑選發(fā)育正常的轉(zhuǎn)基因斑馬魚純合子4~8個細胞期階 段的受精卵胚胎，進行藥物處理，收集藥物處理中不同時相的斑馬魚胚胎，通過綠色熒光蛋 白的表達變化情況，來判斷和評估藥物發(fā)生耐藥性的可能性。
【文檔編號】C12Q1/02GK105907837SQ201610530359
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】舒莉萍, 何志旭, 孫琮杰, 胡榮英, 金璐, 何思佳
【申請人】貴州醫(yī)科大學(xué)