脂肪胺的微生物生產(chǎn)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開涉及用于脂肪胺及其衍生物的生產(chǎn)的重組微生物有機(jī)體。本發(fā)明進(jìn)一步考慮了培養(yǎng)的重組宿主細(xì)胞以及通過使用這些宿主細(xì)胞生產(chǎn)脂肪胺的方法。
【專利說明】
脂肪胺的微生物生產(chǎn)
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年12月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/912,184的權(quán)益，該申請(qǐng)的 內(nèi)容全部W引用方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明公開設(shè)及用于脂肪胺及其衍生物生產(chǎn)的重組微生物有機(jī)體。另外包括表達(dá) 生物合成的蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞，其中所述的生物合成的蛋白質(zhì)在體內(nèi)將脂肪醒轉(zhuǎn)化成 脂肪胺。本發(fā)明公開還涵蓋了通過使用表達(dá)運(yùn)些生物合成的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞來生產(chǎn)脂肪 胺的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 脂肪胺是脂肪酸、締控或醇的氮衍生物。它們由天然脂肪或油形成，或者由合成的 或石油化工原材料形成。今天，運(yùn)些化合物主要通過甘油=醋（例如動(dòng)物脂或植物油（例如 挪子油、芥花油和菜巧油））的化學(xué)改性來生產(chǎn)。
[0005] 市售可得的脂肪胺是由碳鏈或特定鏈長(范圍為Cs至C22)的混合物形成的。通常， 根據(jù)氨分子的氨原子被脂肪烷基或甲基基團(tuán)替代的數(shù)量，脂肪胺分為伯胺、仲胺和叔胺。已 知脂肪胺是通過物理鍵合或化學(xué)鍵合而強(qiáng)烈地粘附在表面上的陽離子表面活性化合物。許 多市售的產(chǎn)品是使用脂肪胺作為反應(yīng)中間體而制備的。例如脂肪胺用作表面活性劑和個(gè)人 護(hù)理產(chǎn)品（例如洗發(fā)劑和調(diào)理劑）的成分。脂肪胺的最大的市場是織物柔軟劑和洗涂劑。月旨 肪胺還用作發(fā)泡劑和潤濕劑，抗靜電劑(在紡織和塑料工業(yè)中），潤滑劑，涂料增稠劑，油田 化學(xué)品，漸青乳化劑，石油添加劑，腐蝕抑制劑，汽油和燃油添加劑，浮選劑，顏料潤濕劑，環(huán) 氧樹脂固化劑，殺蟲劑等（參見Visek K. (SOOS)^tty Amines;Kirk-〇thmer Encyclopedia of Chemic曰I Technology)。
[0006] 通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)脂肪胺提供了許多益處，例如提供了更一致的組成，W較低 的成本制造，和降低對(duì)環(huán)境的影響。此外，開啟了除了目前使用的天然脂肪和油、W及合成 的或石油化工原材料W外的多樣的新原料。目前，沒有用于脂肪胺的微生物生產(chǎn)的有效的 方法。本發(fā)明公開解決了運(yùn)種需要。
[0007] 發(fā)明概述
[000引本發(fā)明公開的一個(gè)方面提供了用于脂肪胺生產(chǎn)的重組微生物有機(jī)體，包含用于將 脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的改造的代謝途徑。在此，所述的重組微生物有機(jī)體具有用于將脂肪 醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的改造的代謝途徑，包括具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的外源生物合成 酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，外源的生物合成酶是腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶，例如YgjG。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，外源的生物合成酶是GABA氨基轉(zhuǎn)移酶，例如化UEsYgjG是由在重組微生物有機(jī)體或重 組微生物細(xì)胞中表達(dá)的編碼ygjG基因的核酸序列編碼。相似地，PimE是由在重組微生物有 機(jī)體或重組微生物細(xì)胞中表達(dá)的編碼PimE基因的核酸序列編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，外 源的生物合成酶是胺脫氨酶，例如得自脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的甲基胺 脫氨酶。重組微生物有機(jī)體或重組微生物細(xì)胞在體內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)脂肪胺。脂肪胺重組 微生物有機(jī)體或重組微生物細(xì)胞釋放至培養(yǎng)基中。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物有機(jī)體 或微生物細(xì)胞為重組細(xì)菌細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了用于脂肪胺生產(chǎn)的重組微生物有機(jī)體，包含用于 將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的改造的代謝途徑。重組微生物有機(jī)體具有用于將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂 肪胺的第一改造的代謝途徑，包括具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的外源生物合成酶(如 上）。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物有機(jī)體具有用于將酷基-ACP或酷基-CoA轉(zhuǎn)化成脂肪酸 的另一種或第二改造的代謝途徑。第二改造的代謝途徑是可任選的。在此，通過具有硫醋酶 活性的生物合成酶，酷基-ACP或酷基-CoA轉(zhuǎn)化成脂肪酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有硫醋酶活 性的生物合成酶是由在重組微生物有機(jī)體或微生物細(xì)胞中表達(dá)的編碼tesA基因的核酸序 列所編碼。重組微生物有機(jī)體或重組微生物細(xì)胞在體內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)脂肪胺。脂肪胺被 重組微生物有機(jī)體或重組微生物細(xì)胞釋放至培養(yǎng)基中。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物有 機(jī)體或微生物細(xì)胞為重組細(xì)菌細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了用于脂肪胺生產(chǎn)的重組微生物有機(jī)體，包含用于 將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的第一改造的代謝途徑。重組微生物有機(jī)體具有用于將脂肪醒轉(zhuǎn)化 成脂肪胺的第一改造的代謝途徑，包括具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的外源生物合成酶 (如上）。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物有機(jī)體具有用于將酷基-ACP或酷基-CoA轉(zhuǎn)化成脂 肪酸的另一種或第二改造的代謝途徑(如上）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物有機(jī)體還 具有用于將脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醒的另一種或第=改造的代謝途徑。運(yùn)種第=改造的代謝途 徑是可任選的，并且與第二改造的代謝途徑無關(guān)。在此，通過具有簇酸還原酶(CAR)活性的 生物合成酶，脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醒。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有CAR活性的生物合成酶是由在 重組微生物有機(jī)體或微生物細(xì)胞中表達(dá)的編碼Ca巧基因的核酸序列所編碼。重組微生物有 機(jī)體或重組微生物細(xì)胞在體內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)脂肪胺。脂肪胺被重組微生物有機(jī)體或重組 微生物細(xì)胞釋放至培養(yǎng)基中。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物有機(jī)體或微生物細(xì)胞為重組 細(xì)菌細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了用于脂肪胺生產(chǎn)的重組細(xì)菌細(xì)胞，其包含編碼具 有硫醋酶活性的外源生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的基因；編碼具有簇酸還原酶活性的外 源生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的基因；W及編碼具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的外源 生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的基因，其中所述的重組細(xì)菌細(xì)胞在體內(nèi)或在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)生 產(chǎn)脂肪胺。脂肪胺被重組細(xì)菌細(xì)胞釋放至培養(yǎng)基中。在此，具有硫醋酶活性的外源生物合成 酶將酷基-ACP或酷基-CoA轉(zhuǎn)化成脂肪酸。具有簇酸還原酶(CAR)活性的外源生物合成酶將 脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醒。具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的外源生物合成酶將脂肪醒轉(zhuǎn)化成 脂肪胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有硫醋酶活性的外源生物合成酶是由編碼tesA基因的核酸 序列所編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有CAR活性的外源生物合成酶是由編碼Ca巧基因的核 酸序列所編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有氨基轉(zhuǎn)移酶活性的外源生物合成酶為腐胺氨基 轉(zhuǎn)移酶，例如YgjG或GABA氨基轉(zhuǎn)移酶例如化證。YgjG是由編碼ygjG基因的核酸序列所編碼。 化UE是由編碼PimE基因的核酸序列所編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有胺脫氨酶活性的外 源生物合成酶為甲基胺脫氨酶，例如得自脫氮副球菌的甲基胺脫氨酶。
[0012] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了用于脂肪胺生產(chǎn)的重組細(xì)菌細(xì)胞，包含編碼具有 硫醋酶活性而將酷基-ACP或酷基-CoA轉(zhuǎn)化成脂肪酸的外源生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)表達(dá) 的基因；編碼具有簇酸還原酶活性(CAR)而將脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醒的外源生物合成酶的一 個(gè)或多個(gè)表達(dá)的基因；W及編碼具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性而將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺 的外源生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的基因，其中所述的重組細(xì)菌細(xì)胞在體內(nèi)或在細(xì)菌細(xì) 胞內(nèi)生產(chǎn)脂肪胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的外源生物合成酶 為腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶，例如YgjG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的外 源生物合成酶為GABA氨基轉(zhuǎn)移酶，例如化UEsYgjG是由在重組細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的編碼ygjG 基因的核酸序列編碼。相似地，PimE是由在重組細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的編碼PimE基因的核酸序 列編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的外源生物合成酶是胺脫 氨酶，例如得自脫氮副球菌的甲基胺脫氨酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有硫醋酶活性的外源生 物合成酶是由編碼tesA基因的核酸序列所編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有CAR活性的外源 生物合成酶是由編碼Ca巧基因的核酸序列所編碼。重組細(xì)菌細(xì)胞在體內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)脂 肪胺。脂肪胺重組細(xì)菌細(xì)胞釋放至培養(yǎng)基中。
[0013] 本發(fā)明公開進(jìn)一步包括用于脂肪胺生產(chǎn)的重組細(xì)菌細(xì)胞，包含用于將酷基-ACP或 酷基-CoA轉(zhuǎn)化成脂肪酸的第一改造的途徑;用于將脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醒的第二改造的代謝 途徑；W及用于將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的第=改造的代謝途徑，其中所述的重組細(xì)菌細(xì)胞 在體內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)脂肪胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，酷基-ACP或酷基-CoA通過外源表達(dá)的 具有硫醋酶活性的生物合成酶而轉(zhuǎn)化成脂肪酸；脂肪酸通過外源表達(dá)的具有簇酸還原酶 (CAR)活性的生物合成酶而轉(zhuǎn)化成脂肪酸；W及脂肪醒通過外源表達(dá)的具有氨基轉(zhuǎn)移酶或 胺脫氨酶活性的生物合成酶而轉(zhuǎn)化成脂肪胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫 氨酶活性的外源生物合成酶為腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶，例如化jG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有氨基 轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的外源生物合成酶為GABA氨基轉(zhuǎn)移酶，例如化UEnYgjG是由在重組 細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的編碼ygjG基因的核酸序列編碼。相似地，PuuE是由在重組細(xì)菌細(xì)胞中表 達(dá)的編碼PimE基因的核酸序列編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活 性的外源生物合成酶為胺脫氨酶，例如得自脫氮副球菌的甲基胺脫氨酶。在一個(gè)實(shí)施方案 中，具有硫醋酶活性的外源生物合成酶是由編碼tesA基因的核酸序列所編碼。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，具有CAR活性的外源生物合成酶是由編碼Ca巧基因的核酸序列所編碼。重組細(xì)菌 細(xì)胞在體內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)脂肪胺。脂肪胺被重組細(xì)菌細(xì)胞釋放至培養(yǎng)基中。
[0014] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了用于脂肪胺生產(chǎn)的重組微生物有機(jī)體，包括但不 限于埃希氏菌屬、芽抱桿菌屬、藍(lán)藻口、乳桿菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、曲 霉菌屬、木霉屬、脈抱菌屬、鑲刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、根毛霉菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、 毛霉菌屬、毀絲菌屬(Myceliophtora)、青霉屬、毛平革菌、側(cè)耳屬、栓菌屬、金抱子菌屬、酵 母菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬（Steno化ophamonas)、裂殖酵母屬、耶氏酵母屬和鏈霉菌屬。在一個(gè) 實(shí)施方案中，埃希氏菌屬為大腸桿菌化scherichia coli)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藍(lán)藻口包 括但不限于原綠球藻、聚球藻、集胞藻屬、藍(lán)桿藻和念珠藻(Nostoc punctiforme)。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，藍(lán)藻口包括但不限于細(xì)長聚球藻（Synechococ州S elongaUis)PCC7942、集 胞藻屬的菌種PCC6803和聚球藻的菌種PCC7001。
[0015] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了生產(chǎn)脂肪胺的方法，包括在包含碳源的發(fā)酵肉湯 中培養(yǎng)重組微生物有機(jī)體。微生物有機(jī)體涵蓋了用于在體內(nèi)生產(chǎn)脂肪胺的至少一種改造的 代謝途徑(如上）。本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了在重組細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)脂肪胺的方法， 包括在碳源存在下，在發(fā)酵肉湯中，培養(yǎng)表達(dá)用于生產(chǎn)脂肪胺的改造的代謝途徑(如上）的 細(xì)胞;W及收獲在發(fā)酵肉湯中收集的脂肪胺。
[0016] 本發(fā)明公開進(jìn)一步涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含用于胺生產(chǎn)的重組微生物細(xì)胞(如 上）。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物涵蓋了用于胺生產(chǎn)的重組細(xì)菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，重組微生物細(xì)胞為重組細(xì)菌細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了重組微生物有機(jī)體，其具有用于脂肪醒生產(chǎn)的改 造的代謝途徑，和將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的生物合成酶，其中所述的生物合成酶具有氨基 轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成酶是腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶或GABA 氨基轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成酶為胺脫氨酶或胺氧化酶。
[0018] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了重組微生物有機(jī)體，其具有用于脂肪醒生產(chǎn)的改 造的代謝途徑和用于脂肪胺生產(chǎn)的改造的代謝途徑，包括將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的生物合 成酶，其中所述的重組微生物有機(jī)體為微生物細(xì)胞。在一個(gè)方面中，微生物細(xì)胞為重組細(xì) 胞。微生物細(xì)胞包括但不限于埃希氏菌屬、芽抱桿菌屬、藍(lán)藻口、乳桿菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、 紅球困屬、假單胞困屬、曲霉困屬、木霉屬、脈抱困屬、鑲刀困屬、腐質(zhì)霉屬、根毛霉困屬、克 魯維酵母屬、畢赤酵母屬、毛霉菌屬、毀絲菌屬、青霉屬、毛平革菌、側(cè)耳屬、栓菌屬、金抱子 菌屬、酵母菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、裂殖酵母屬、耶氏酵母屬和鏈霉菌屬。在一個(gè)實(shí)施方案中， 埃希氏菌屬為大腸桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藍(lán)藻口包括但不限于原綠球藻、聚球藻、集 胞藻屬、藍(lán)桿藻和念珠藻。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，藍(lán)藻口為細(xì)長聚球藻P(X7942、集胞 藻屬的菌種PCC6803、或聚球藻的菌種P(X7001。
[0019] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了重組微生物有機(jī)體，其具有用于脂肪醒生產(chǎn)的改 造的代謝途徑和用于脂肪胺生產(chǎn)的改造的代謝途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于脂肪醒生產(chǎn) 的改造的代謝途徑包括將脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醒的硫醋酶和/或簇酸還原酶(CAR),而用于脂 肪胺生產(chǎn)的改造的代謝途徑包括將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨 酶。在一些實(shí)施方案中，硫醋酶是由編碼tesA基因的核酸序列（具有或不具有前導(dǎo)序列）編 碼的，而簇酸還原酶(CAR)是由編碼Ca巧基因的核酸序列編碼的，兩者均在微生物有機(jī)體中 表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶為腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶或GABA氨基轉(zhuǎn)移酶。在一 個(gè)實(shí)施方案中，腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶為YgjG,其是由在微生物有機(jī)體中表達(dá)的編碼ygjG基因的 核酸序列編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GABA氨基轉(zhuǎn)移酶為化證，其是由在微生物有機(jī)體中表 達(dá)的編碼PimE基因的核酸序列編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胺脫氨酶為得自脫氮副球菌的 甲基胺脫氨酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪胺被微生物有機(jī)體釋放至上清液或培養(yǎng)基中。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪胺從微生物有機(jī)體的內(nèi)部收集，其中可W在發(fā)酵過程中或發(fā)酵過程 之后提取脂肪胺。
[0020] 本發(fā)明公開進(jìn)一步考慮了生產(chǎn)脂肪胺的方法，包括在包含碳源的發(fā)酵肉湯中培養(yǎng) 重組微生物有機(jī)體，其中所述的重組微生物有機(jī)體包含用于脂肪醒生產(chǎn)的改造的代謝途 徑，W及將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的生物合成酶，其中所述的生物合成酶具有氨基轉(zhuǎn)移酶或 胺脫氨酶活性，并且其中所述的微生物有機(jī)體在體內(nèi)生產(chǎn)脂肪胺。
[0021] 本發(fā)明公開進(jìn)一步涵蓋了重組微生物細(xì)胞，其包括一種或多種具有硫醋酶或簇酸 還原酶(CAR)活性的酶的表達(dá)；W及具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性的酶的表達(dá)，其中所述 的微生物細(xì)胞生產(chǎn)脂肪胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成酶為腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶，例如化jG或 GABA氨基轉(zhuǎn)移酶，例如化址。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成酶為胺脫氨酶，例如得自脫氮 副球菌的甲基胺脫氨酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成酶為胺氧化酶。
[0022] 此外，本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了在重組的微生物有機(jī)體中生產(chǎn)脂肪胺的方 法。該方法包括在碳源存在下，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物細(xì)胞(如上）；W及收獲在上清液 或發(fā)酵培養(yǎng)基中收集的脂肪胺。重組微生物細(xì)胞表達(dá)用于脂肪醒生產(chǎn)的改造的代謝途徑， W及將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的生物合成酶，其中所述的生物合成酶具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫 氨酶活性。在另一個(gè)方面中，重組微生物細(xì)胞表達(dá)用于脂肪醒生產(chǎn)的改造的代謝途徑，W及 用于胺生產(chǎn)的改造的代謝途徑，包括將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的生物合成酶，其中所述的生 物合成酶具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性。
[0023] 本發(fā)明的公開的另一個(gè)方面提供了由碳源衍生的脂肪胺，其中所述的碳源不是石 油化工原材料。例如本發(fā)明公開提供了由可再生的原料衍生的脂肪胺，例如C〇2、CO、葡萄 糖、薦糖、木糖、阿拉伯糖、甘油、甘露糖或它們的混合物。本文所提供的可W衍生出脂肪胺 的其他原料包括淀粉、纖維素生物質(zhì)、糖蜜和碳水化合物的其他來源(包括由纖維素生物質(zhì) 的水解而衍生得到的碳水化合物混合物，或由植物或天然油處理衍生得到的廢料）。
[0024] 附圖簡述
[0025] 當(dāng)與附圖相關(guān)聯(lián)來閱讀時(shí)，可W更好地理解本發(fā)明公開，其中附圖起到說明優(yōu)選 的實(shí)施方案的作用。但是應(yīng)該理解的是本發(fā)明公開不限于附圖中公開的具體的實(shí)施方案。
[0026] 圖1為由微生物細(xì)胞提取物得到的MS/GC色譜，其示出了通過硫醋酶、簇酸還原酶 和氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶（中間一排）的表達(dá)而生產(chǎn)的獨(dú)特的脂肪胺峰(參見在7.61分鐘出的 中間面板，用箭頭標(biāo)記）。上方一排為F16陰性對(duì)照；中間一排為F16-YG樣品；而下方一排為 YG陰性對(duì)照。在上方和中間一排的其他峰為脂肪醇。
[0027] 圖2描繪了另一個(gè)MS/GC色譜，其示出了與1-十二燒胺參照標(biāo)準(zhǔn)品（下方一排）相 比，F(xiàn)16-YG樣品（上方一排)的稀釋圖譜。在上方和中間一排的其他峰為脂肪醇。
[002引圖3示出了由F16-YG樣品（上方一排)和1-十二燒胺參照標(biāo)準(zhǔn)品（下方一排)得到的 7.6分鐘峰的離子碎片圖案。在上方一排中還示出了 1-十二燒胺的特征性離子碎片（包括 Cii出4N、Cio出2N、C姐20N )的分子結(jié)構(gòu)。
[0029] 發(fā)明詳述
[0030] 一般綜述
[0031] 本發(fā)明公開設(shè)及脂肪胺的微生物生產(chǎn)，其代表了一種新類型的可再生化學(xué)產(chǎn)品。 脂肪胺是由微生物有機(jī)體生產(chǎn)的，其中所述的微生物有機(jī)體表達(dá)將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的 改造的代謝途徑。由此，微生物有機(jī)體表達(dá)至少一種外源生物合成酶，從而在體內(nèi)生產(chǎn)脂肪 胺。外源生物合成酶可W具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶活性;或者簇酸還原酶(CAR)活性;硫 醋酶活性;或者它們的組合。本文還涵蓋了酶活性的備選形式。
[0032] 定義
[0033] 除非內(nèi)容中明確地作出另外的指示，如本說明書和所附的權(quán)利要求書所用，單數(shù) 形式"一"、"一個(gè)"和"一種"包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如"宿主細(xì)胞'包括兩種或更多種此類 重組宿主細(xì)胞，"脂肪胺"包括一種或多種脂肪胺或胺的混合物，"核酸序列"包括一種或多 種核酸序列；"酶"包括一種或多種酶等。
[0034] 術(shù)語"改造的代謝途徑"是指一種或多種基因改造的或優(yōu)化的化學(xué)反應(yīng)，其是由細(xì) 胞中表達(dá)的至少一種生物合成酶所催化的，從而在細(xì)胞的內(nèi)部生產(chǎn)某種物質(zhì)（或增加該物 質(zhì)的生產(chǎn)）（即，前體、中間體或終產(chǎn)物）。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物合成酶為外源生物合成 酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改造的代謝途徑允許所需的終產(chǎn)物的細(xì)胞生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，改造的代謝途徑允許所需的前體的細(xì)胞生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改造的代謝途徑 允許所需的中間體的細(xì)胞生產(chǎn)。
[0035] 當(dāng)術(shù)語"在體內(nèi)"在生產(chǎn)特定產(chǎn)物的內(nèi)容中使用時(shí)，是指"在細(xì)胞的內(nèi)部"。例如在 體內(nèi)的脂肪胺的生產(chǎn)是指在細(xì)胞的內(nèi)部的脂肪胺的生產(chǎn)。
[0036] 本文中所指的序列編號(hào)得自由NCBI (National Center for Biotechnology Information)提供的數(shù)據(jù)庫，其由the 化tional Institutes of Health,U.S.A.維護(hù)（該 編號(hào)在本文中確認(rèn)為"NCBI編號(hào)"或備選地確認(rèn)為"GenBank編號(hào)"），W及得自由the Swiss Institute of Bioinformatics提供的UniProt Knowledgebase(UniProtKB)和Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(該編號(hào)在本文中確認(rèn)為"UniProt邸編號(hào)"）。
[0037] 酶分類化C)號(hào)由the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(IUBMB)建立，其描述可W在國際互聯(lián)網(wǎng)的 IUBMB Enzyme Nomencla化re網(wǎng)站上獲得。EC號(hào)是根據(jù)酶催化的反應(yīng)將酶分類。例如如果不 同的酶(例如得自不同的有機(jī)體)催化相同的反應(yīng)，則它們被分類在相同的EC號(hào)下。此外，通 過趨同進(jìn)化，不同的蛋白質(zhì)折疊可W催化相同的反應(yīng)，因此被指定為相同的EC號(hào)（參見 Omelchenko et al.(2010)Biol.Direct 5:31)。在進(jìn)化無關(guān)的并且可W催化相同的生物化 學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)通常稱為類似的酶（即，與同源的酶相對(duì)）dEC號(hào)不同于(例如)通過氨基酸 序列來指定蛋白質(zhì)的化iProt識(shí)別器。
[0038] 如本文所用，術(shù)語"核巧酸"是指多核巧酸的單體單元，其由雜環(huán)堿基、糖和一個(gè)或 多個(gè)憐酸基構(gòu)成。天然形成的堿基(鳥嚷嶺(G)、腺嚷嶺(A)、胞喀晚(C)、胸腺喀晚(T)和尿喀 晚化)）通常為嚷嶺或喀晚的衍生物，但是應(yīng)該理解的是天然和非天然形成的堿基類似物也 被包括在內(nèi)。天然形成的糖為戊糖(五碳糖）、脫氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA)，但 是應(yīng)該理解的是天然和非天然形成的糖類似物也被包括在內(nèi)。核酸通常通過憐酸鍵連接， 從而形成核酸或多核巧酸，但是本領(lǐng)域已知許多其他的鍵(例如憐硫酷鍵、棚燒憐酸鍵等）。
[0039] 術(shù)語"多核巧酸"是指核巧酸(RNA)和脫氧核巧酸(DNA)的聚合物，其可W是單鏈的 或雙鏈的，并且其可W包括非天然或改變的核巧酸。術(shù)語"多核巧酸"、"核酸序列"和"核巧 酸序列"在本文中可W交換使用，其是指任何長度的核巧酸的聚合形式。運(yùn)些術(shù)語是指分子 的一級(jí)結(jié)構(gòu)，因此包括雙鏈和單鏈DNA、W及雙鏈和單鏈RNA。該術(shù)語包括由核巧酸類似物和 修飾多核巧酸(例如但不限于甲基化的和/或加帽的多核巧酸)形成的RNA或DNA的類似物作 為等價(jià)物。多核巧酸可W為任何形式，包括但不限于質(zhì)粒、病毒、染色體、EST、cDNA、mRNA和 rRNA。
[0040] 如本文所用，術(shù)語"多膚"和"蛋白質(zhì)"可W交換使用，其是指氨基酸殘基的聚合物。 術(shù)語"重組多膚"是指通過重組技術(shù)生產(chǎn)的多膚，其中通常，將編碼所表達(dá)蛋白質(zhì)的CDNA或 RNA插入到合適的表達(dá)載體中，該載體進(jìn)而用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而生產(chǎn)多膚。相似地，術(shù)語 "重組多核巧酸"、"重組核酸"或"重組DNA"是通過本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的重組技術(shù)生 產(chǎn)的。
[0041] 如本文所用，術(shù)語"同源"和"同源的"是指包括如下序列的多核巧酸或多膚，其中 所述的序列與相應(yīng)的多核巧酸或多膚序列具有至少大約50% ( % )的一致性。優(yōu)選的是，同 源的多核巧酸或多膚具有如下多核巧酸序列或氨基酸序列，該多核巧酸序列或氨基酸序列 與相應(yīng)的氨基酸序列或核巧酸序列具有至少大約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或者至少大約 99% 的 同源性。如本文所用，術(shù)語序列"同源性"和序列"一致性"可W交換使用。
[0042] 本領(lǐng)域的任一普通技術(shù)人員很好地知道確定兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的同源性的 方法。簡言之，計(jì)算兩個(gè)序列之間的"同源性"可W按W下方式進(jìn)行。為了達(dá)到最佳比較的目 的，將序列進(jìn)行比對(duì)(例如可W在第一和第二氨基酸或核酸序列的一者或二者中引入空位 W達(dá)到最佳比對(duì)的目的，并且可W忽視非同源的序列W達(dá)到比較目的）。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，用于比較目的而比對(duì)的第一序列的長度為第二序列的長度的至少大約30%、優(yōu)選 至少大約40 %、更優(yōu)選地至少大約50%、甚至更優(yōu)選地至少大約60%、甚至更優(yōu)選地至少大 約70 %、至少大約80 %、至少大約85 %、至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%或者大 約100%。然后，比較在第一和第二序列的相應(yīng)的氨基酸位置或核巧酸位置處的氨基酸殘基 或核巧酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄械奈恢帽坏诙蛄兄邢鄳?yīng)位置處的相同氨基酸殘基或核巧酸占據(jù) 時(shí)，則分子在該位置處是相同的。兩個(gè)序列之間的百分同源性為序列所共有的相同位置的 數(shù)量的函數(shù)，其考慮了空位的數(shù)量和各空位的長度，必須引入空位的數(shù)量和各空位的長度 W達(dá)到兩個(gè)序列的最佳比對(duì)的目的。序列的比較W及兩個(gè)序列之間的百分同源性的確定可 W 使用數(shù)學(xué)算法來完成，例如化 AST(Altschul et al.，J.Mol.Biol ,215(3) :403-410 (1990))。此外，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同源性還可W使用化edleman和Wunsch算法來 確定，其中所述的算法被引入到GCG軟件包的GAP程序中，其中使用了Blossum 62矩陣或 PAM250矩陣，W及16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重(化6(116111曰11 and WunschJ.Mol.Biol. ,48:444-453(1970))。此外，兩個(gè)核巧酸序列之間的百分同源性 還可W使用GCG軟件包中的GAP程序來確定，其中使用了 NWSgapdna. CMP矩陣W及40、50、60、 70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。本領(lǐng)域的任一普通技術(shù)人員可W進(jìn)行最初 的同源性計(jì)算，并相應(yīng)地調(diào)整算參數(shù)。優(yōu)選的參數(shù)組(和如果操作者不確定應(yīng)當(dāng)應(yīng)用哪些參 數(shù)來確定分子是否在所要求的同源性限制內(nèi)而應(yīng)該使用的參數(shù)組)是具有12的空位罰分、4 的空位延伸罰分和5的移碼空位罰分的Blossum 62評(píng)分矩陣。序列比對(duì)的其他方法是生物
技術(shù)領(lǐng)域已知的（例如參見Rosenberg(2005)BMC Bioinformatics 6:278;Altschul et al. (2005)陽BS J.272(20):5101-5109)。
[0043] 術(shù)語"在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性、高嚴(yán)謹(jǐn)性或極高嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下雜交"描述了用于 雜交和洗涂的條件。實(shí)施雜交反應(yīng)的指導(dǎo)可W在生物技術(shù)的文章中找到(例如參見化rrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y. (1989),6.3.1-6.3.6,其中詳 細(xì)描述了水性和非水性方法，并且可W使用任何一種方法）。例如具體的雜交條件如下：（1) 低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件一在大約45°C下、在6x氯化鋼/巧樣酸鋼(SSC)中，然后在至少50°C下、在 0.2乂55(：、0.1%505中洗涂2次(對(duì)于低嚴(yán)謹(jǐn)性條件，洗涂溫度可^升至55°(：);(2)中嚴(yán)謹(jǐn)性 雜交條件一在大約45°C下、在6xSSC中，然后在60°C的0.2義55(：、0.1%505中洗涂一次或多 次；（3)高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件一在大約45°C的6xSSC中，然后在65°C下、在0.2XSSC、0.1 %SDS中 洗涂一次或多次；W及(4)極高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件一在65°C的0.5M憐酸鋼、7%SDS，然后在65 °C下、在0.2xSSC、l%SDS中洗涂一次或多次。除非另外指示，極高的嚴(yán)謹(jǐn)性條件(4)是優(yōu)選 的條件。
[0044] 術(shù)語"內(nèi)源的"是指"內(nèi)部起源的"。因此，"內(nèi)源的"多膚是指由宿主細(xì)胞的天然基 因組編碼的多膚。例如內(nèi)源的多膚可W指由親代微生物細(xì)胞(例如親代宿主細(xì)胞)的基因組 編碼的多膚，其中重組細(xì)胞由所述的親代微生物細(xì)胞改造(或衍生）。
[0045] 術(shù)語"外源的"是指"外部起源的"。因此，"外源的"多膚是不是指由細(xì)胞的天然基 因組編碼的多膚。外源的多膚和/或外源的多核巧酸可W轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，并且可W由不同的 細(xì)胞類型或種類克隆或衍生得到；或者可W由相同的細(xì)胞類型或種類克隆或衍生得到。例 如"外源的生物合成酶"是外源的多膚的實(shí)例，其中所述的多膚編碼了具有某種酶活性的 酶。在另一個(gè)實(shí)例中，變體(即，突變的或改變的）多膚是外源的多膚的實(shí)例。相似地，非天然 形成的核酸分子一旦被引入至細(xì)胞中，對(duì)于該細(xì)胞而言，便認(rèn)為是外源的。術(shù)語"外源的"還 可W用于指在非天然狀態(tài)的重組宿主細(xì)胞中存在的多核巧酸、多膚或蛋白質(zhì)。例如相對(duì)于 在相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞中天然存在的野生型序列而言，"外源的"多核巧酸、多膚或蛋白 質(zhì)序列可W經(jīng)過修飾，例如在表達(dá)水平或者在多核巧酸、多膚或蛋白質(zhì)的序列的水平下修 飾。在運(yùn)些相同的細(xì)胞系中，天然形成的核酸分子對(duì)于特定的細(xì)胞而言也可W是外源的。例 如由細(xì)胞X分離的完整的編碼序列對(duì)于細(xì)胞Y而言，一旦所述的編碼序列被引入細(xì)胞Y，即使 X和Y是相同的細(xì)胞類型，則也是外源的核酸。
[0046] 術(shù)語"過表達(dá)的"是指與基因的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄速率相比，使得該基因在升高的速率下轉(zhuǎn) 錄。在一些實(shí)例中，過表達(dá)另外包括與蛋白質(zhì)的內(nèi)源翻譯速率相比，相應(yīng)的蛋白質(zhì)的升高的 翻譯速率。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語"過表達(dá)"是指在相同的條件下在相應(yīng)的野生型細(xì)胞中 正常表達(dá)的更高的濃度下，在細(xì)胞中表達(dá)多核巧酸或多膚。用于過表達(dá)的測試方法是本領(lǐng) 域公知的，例如可W使用dPCR來評(píng)估轉(zhuǎn)錄的RNA水平，并可W使用SDS page凝膠分析來評(píng) 估蛋白質(zhì)水平。
[0047] 術(shù)語"異源的"是指"由不同的有機(jī)體、不同的細(xì)胞類型和/或不同的物種衍生得到 的"。如本文所用，術(shù)語"異源的"通常與多核巧酸、多膚或蛋白質(zhì)相關(guān)，并且是指在給定的有 機(jī)體、細(xì)胞類型或物種中不是天然存在的多核巧酸、多膚或蛋白質(zhì)。例如由植物得到的多核 巧酸序列可W通過重組方法引入至微生物宿主細(xì)胞中，并且植物多核巧酸則對(duì)于所述的重 組微生物宿主細(xì)胞而言是異源的。相似地，由藍(lán)細(xì)菌得到的多核巧酸序列可W通過重組方 法引入至埃希氏菌屬的微生物宿主細(xì)胞中，并且由藍(lán)細(xì)菌得到的多核巧酸則對(duì)于所述的重 組微生物宿主細(xì)胞而言是異源的。在運(yùn)些細(xì)胞系中，"異源的生物合成酶"是異源的多膚的 實(shí)例，其中所述的多膚編碼了具有某種酶活性的酶。
[0048] 如本文所用，術(shù)語多膚的"片段"是指全長多膚或蛋白質(zhì)的較短的部分，其大小為2 個(gè)氨基酸殘基至整個(gè)氨基酸序列減去1個(gè)氨基酸殘基。在本發(fā)明公開的某些實(shí)施方案中，片 段是指多膚或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域(例如底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域或催化結(jié)構(gòu)域)的整個(gè)氨基酸序列。
[0049] 術(shù)語"誘變"是指一種方法，通過該方法有機(jī)體的遺傳信息W穩(wěn)定的方式被改變。 編碼蛋白質(zhì)的核酸序列的誘變產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)。此外，誘變還指非編碼核酸序列的改變， 而運(yùn)種改變會(huì)導(dǎo)致修飾的蛋白質(zhì)活性。
[0050] 如本文所用，"突變"是指基因的核酸位置中或者多膚或蛋白質(zhì)的氨基酸位置中的 永久性改變。突變包括取代、加入、插入和/或刪除。例如氨基酸位置中的突變可W為一種類 型的氨基酸被另一種類型的氨基酸的取代(例如絲氨酸（S)可W被丙氨酸(A)取代;賴氨酸 (L)可W被T(蘇氨酸)取代等）。因此，多膚或蛋白質(zhì)可W具有一個(gè)或多個(gè)突變，其中一個(gè)氨 基酸被另一個(gè)氨基酸取代。例如生物合成多膚或蛋白質(zhì)在其氨基酸序列中可W具有一個(gè)或 多個(gè)突變。
[0051] 如本文所用，術(shù)語"生物合成酶"是指具有與脂肪酸衍生物(例如脂肪酸、脂肪醒、 脂肪醇、脂肪胺、脂肪醋等)的生物合成有關(guān)的酶活性的蛋白質(zhì)。如本文所用，生物合成酶的 實(shí)例是可W將脂肪醒前體轉(zhuǎn)化成脂肪胺的酶(例如產(chǎn)生脂肪胺的生物合成酶）。如本文所 用，生物合成酶的另一個(gè)實(shí)例是可W將脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醒的酶(例如產(chǎn)生脂肪醒的生物 合成酶）。如本文所用，生物合成酶的另一個(gè)實(shí)例是可W將酷基-ACP或酷基-CoA轉(zhuǎn)化成脂肪 酸的酶(例如產(chǎn)生脂肪酸的生物合成酶）。當(dāng)使用生物合成酶轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)，其為表達(dá)生物合 成酶的細(xì)胞(例如重組細(xì)胞）。在一個(gè)實(shí)施方案中，由表達(dá)產(chǎn)生脂肪胺的生物合成酶的細(xì)胞 所生產(chǎn)的脂肪胺相關(guān)化合物的效價(jià)和/或產(chǎn)率是相應(yīng)的野生型細(xì)胞（即，不表達(dá)產(chǎn)生脂肪胺 的生物合成酶的相應(yīng)的細(xì)胞）的至少2倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由表達(dá)產(chǎn)生脂肪胺的生物 合成酶的細(xì)胞所生產(chǎn)的脂肪胺相關(guān)化合物的效價(jià)和/或產(chǎn)率是相應(yīng)的野生型細(xì)胞的至少大 約1倍、至少大約2倍、至少大約3倍、至少大約4倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7 倍、至少大約8倍、至少大約9倍或至少大約10倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，由表達(dá)產(chǎn)生脂肪胺的 生物合成酶的細(xì)胞所生產(chǎn)的脂肪胺相關(guān)化合物的效價(jià)和/或產(chǎn)率為相應(yīng)的野生型細(xì)胞的至 少大約1 %、至少大約2%、至少大約3 %、至少大約4%、至少大約5 %、至少大約6%、至少大 約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10% W上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由于產(chǎn)生脂 肪胺的生物合成酶的表達(dá)而得到的效價(jià)和/或產(chǎn)率為野生型細(xì)胞的至少大約20%至至少大 約100%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由于產(chǎn)生脂肪胺的生物合成酶的表達(dá)而使得細(xì)胞生產(chǎn)的脂 肪胺相關(guān)化合物的效價(jià)和/或產(chǎn)率為相應(yīng)的野生型細(xì)胞的至少大約20%、至少大約25%、至 少大約30 %、至少大約35 %、至少大約40 %、至少大約45 %、至少大約50 %、至少大約55 %、 至少大約60 %、至少大約65 %、至少大約70 %、至少大約75 %、至少大約80 %、至少大約 85%、至少大約90 %、至少大約95 %、至少大約97 %、至少大約98 %、至少大約100 % W上。
[0052] 如本文所用，術(shù)語"基因"是指編碼RNA產(chǎn)物或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的核酸序列；W及影響 RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)的可操作地連接的核酸序列（例如此類序列包括但不限于啟動(dòng)子或增 強(qiáng)子序列）或編碼影響RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)的序列的、可操作地連接的核酸序列（例如此類 序列包括但不限于核糖體結(jié)合位點(diǎn)或翻譯控制序列）。
[0053] 表達(dá)控制序列是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多聚腺巧酸化信 號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)等，它們提供了多核巧酸序列在宿主細(xì)胞中的 表達(dá)。表達(dá)控制序列特異性地與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用（Maniatis et al.， Science ,236:1237-1245( 1987))。示例性的表達(dá)控制序列在生物技術(shù)教科書（例如參見 Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif. (1990))中所述。在本發(fā)明公開的方法中，一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序 列與一個(gè)或多個(gè)多核巧酸序列可操作地連接。"可操作地連接"是指多核巧酸序列和表達(dá)控 制序列W運(yùn)樣的方式連接，使得在合適的分子(例如轉(zhuǎn)錄活化蛋白質(zhì)）與表達(dá)控制序列結(jié)合 時(shí)，允許基因表達(dá)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向，可操作地連接的啟動(dòng)子位于所選的多核巧酸序 列的上游。可操作地連接的增強(qiáng)子可W位于所選的多核巧酸的上游、內(nèi)部或下游。
[0054] 如本文所用，術(shù)語"載體"是指能夠運(yùn)送所連接的另一種核酸（即，多核巧酸序列） 的核酸分子。一種類型的有用的載體為附加體（即，能夠在染色體外復(fù)制的核酸）。有用的載 體為能夠使所連接的核酸自主復(fù)制和/或表達(dá)的那些。能夠使與其可操作地連接的基因定 向表達(dá)的載體在本文中稱為"表達(dá)載體"?？傮w而言，用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常為 "質(zhì)粒"形式，其通常是指環(huán)狀雙鏈的DNA環(huán)，該DNA環(huán)作為載體形式不能與染色體結(jié)合。其他 有用的表達(dá)載體W線性形式提供。而且，還包括此類其他形式的表達(dá)載體，運(yùn)些載體發(fā)揮著 等價(jià)的功能并且到目前為止是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，重組載體進(jìn)一步包括與 多核巧酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子、細(xì) 胞器特異性的啟動(dòng)子、組織特異性的啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子、構(gòu)成型的啟動(dòng)子或者是細(xì)胞 特異性的啟動(dòng)子。重組載體通常包括選自W下的至少一個(gè)序列：與多核巧酸序列可操作地 綴合的表達(dá)控制序列；與多核巧酸序列可操作地綴合的選擇標(biāo)記；與多核巧酸序列可操作 地綴合的標(biāo)記序列；與多核巧酸序列可操作地綴合的純化部分;與多核巧酸序列可操作地 綴合的分泌序列；W及與多核巧酸序列可操作地綴合的祀向序列。在某些實(shí)施方案中，核巧 酸序列被穩(wěn)定地引入到宿主細(xì)胞的基因組DNA中，并且核巧酸序列的表達(dá)處于受調(diào)節(jié)的啟 動(dòng)子區(qū)的控制之下。如本發(fā)明所用，表達(dá)載體包括適用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核巧酸序列 的形式的、本文所述的特定的多核巧酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是表達(dá)載體的 設(shè)計(jì)可W取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需多膚的表達(dá)水平之類的因素。本發(fā)明 所述的表達(dá)載體可W被引入到宿主細(xì)胞中，從而產(chǎn)生由本文所述的多核巧酸序列編碼的多 膚，包括融合多膚。
[0055] 術(shù)語"重組細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"在本文中可交換使用，并且是指經(jīng)修飾而外源 表達(dá)至少一種生物合成酶的細(xì)胞。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，生物合成酶可W將脂肪醒前 體轉(zhuǎn)化成脂肪胺。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)胞涵蓋了可W增加重組細(xì)胞生產(chǎn)脂肪胺 或脂肪胺衍生化合物的比活的生物合成酶。重組細(xì)胞可W衍生自微生物有機(jī)體或微生物細(xì) 胞，例如細(xì)菌、病毒或真菌。重組細(xì)胞可W用于生產(chǎn)脂肪胺。在一些實(shí)施方案中，重組細(xì)胞外 源表達(dá)一種或多種多核巧酸（多種），編碼多膚的每一種多核巧酸均具有生物合成酶活性， 其中當(dāng)所述的重組細(xì)胞在碳源存在下在有效表達(dá)多核巧酸（多種）的條件下培養(yǎng)時(shí)會(huì)生產(chǎn) 脂肪胺相關(guān)組合物。
[0056] 如本文所用，術(shù)語"微生物有機(jī)體"是指微小的有機(jī)體。微生物有機(jī)體的實(shí)例為細(xì) 菌、病毒或真菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物有機(jī)體為細(xì)菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生 物有機(jī)體為原核生物或原核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物有機(jī)體為真菌細(xì)胞，例如酵 母菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物有機(jī)體為病毒細(xì)胞。在相關(guān)的實(shí)施方案中，"重組微 生物有機(jī)體"為經(jīng)遺傳改變并且表達(dá)或涵蓋外源和/或異源核酸序列的微生物有機(jī)體。在另 一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，"重組微生物有機(jī)體"為經(jīng)遺傳改變并且表達(dá)改造的代謝途徑的微 生物有機(jī)體，其中所述的改造的代謝途徑包括至少一種外源表達(dá)的蛋白質(zhì)（例如外源生物 合成酶）。
[0057] 術(shù)語"酷基-ACP"是指在烷基鏈的幾基碳與酷基載體蛋白質(zhì)(ACP)的憐酸泛酷琉基 乙胺基部分的硫氨基之間形成酷基硫醋。憐酸泛酷琉基乙胺基部分在翻譯后通過全-酷基 載體蛋白質(zhì)合酶(ACPS)(-種憐酸泛酷琉基乙胺基轉(zhuǎn)移酶)的作用與ACP上的保守絲氨酸殘 基連接。在一些實(shí)施方案中，酷基-ACP為完全飽和的酷基-ACP的合成中的中間體。在其他的 實(shí)施方案中，酷基-ACP為不飽和的酷基-ACP的合成中的中間體。在一些實(shí)施方案中，碳鏈具 有大約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個(gè)碳。運(yùn)些 酷基-ACP的每一種都是將它們轉(zhuǎn)化為脂肪酸衍生物的酶的底物。
[0058] 術(shù)語"酷基-CoA"是指在活細(xì)胞內(nèi)部當(dāng)輔酶A(CoA)與脂肪酸的末端連接時(shí)所形成 的暫時(shí)化合物?？峄?CoA是指與脂肪酸的代謝有關(guān)的一類輔酶。在一些實(shí)施方案中，碳鏈具 有大約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個(gè)碳。運(yùn)些 酷基-CoA的每一種都是將它們轉(zhuǎn)化為脂肪酸衍生物的酶的底物。
[0059] 術(shù)語"脂肪醒生產(chǎn)的代謝途徑"是指生產(chǎn)脂肪醒的任何生物合成途徑。用于脂肪醒 生產(chǎn)的代謝途徑可W包括任何數(shù)量的生產(chǎn)脂肪醒的酶。
[0060] 術(shù)語"用于脂肪胺生產(chǎn)的代謝途徑"是指生產(chǎn)脂肪胺的任何生物合成途徑。用于脂 肪胺生產(chǎn)的代謝途徑可W包括生產(chǎn)脂肪胺的至少一種酶。
[0061] 如本文所用，"脂肪胺"是指具有式RNH2的胺。如本文所指，脂肪胺可W為由（例如） 脂肪酸、脂肪醒或由脂肪酷基-ACP衍生的脂肪醒制得的任何脂肪胺。在一些實(shí)施方案中，R 基團(tuán)的長度為至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、 至少15、至少16、至少17、至少18或至少19個(gè)碳。備選地或此外，R基團(tuán)的長度為24或更低、23 或更低、22或更低、20或更低、19或更低、18或更低、17或更低、16或更低、15或更低、14或更 低、13或更低、12或更低、11或更低、10或更低、9或更低、8或更低、7或更低、6或更低個(gè)碳。因 此，R基團(tuán)可W具有通過上述任意2個(gè)端點(diǎn)鍵合的R基團(tuán)。例如R基團(tuán)的長度可W為6-16個(gè)碳， 長度為10-14個(gè)碳或者長度為12-18個(gè)碳。在一些實(shí)施方案中，脂肪胺組合物包含C6、C7、C8、 〔9、(：10、(：11、(：12、(：13、(：14、(：15、(：16、(：17、(：18、(：19、〔20、〔21、22、23和〔24脂肪胺的一種或多 種。在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺組合物包含C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、 C16、C17和C18脂肪胺的一種或多種。在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺組合物包含C12、C14、C16 和C18脂肪胺;C12、C14和C16脂肪胺;C14、C16和C18脂肪胺;或者C12和C14脂肪胺。脂肪胺的 R基團(tuán)可W是直鏈或支鏈。支鏈可W具有多于一個(gè)的分支點(diǎn)，并且可W包含環(huán)狀分支。在一 些實(shí)施方案中，支化的脂肪胺為C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、 019^20^21^22^23或〔24支化的脂肪胺。支化的或非支化的脂肪胺的1?基團(tuán)可^是飽和 的或不飽和的。如果是不飽和的，貝化基團(tuán)可W具有一個(gè)或多于一個(gè)的不飽和點(diǎn)。在一些實(shí) 施方案中，不飽和脂肪胺為單不飽和脂肪胺。在某些實(shí)施方案中，不飽和脂肪胺為C6:1、C7: 1、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20: 1、C21:1、C22:1、C23:1或C24:1不飽和脂肪胺。在某些實(shí)施方案中，不飽和脂肪胺為ClO: 1、 C12:1、C14:1、C16:1或C18:1不飽和脂肪胺。在其他的實(shí)施方案中，不飽和脂肪胺為在CO -7 位置處不飽和的。在某些實(shí)施方案中，不飽和脂肪胺具有Cis雙鍵。根據(jù)氨分子的氨原子被 脂肪烷基或甲基基團(tuán)替代的數(shù)量，脂肪胺分為伯胺、仲胺和叔胺。在水處理中可W用作去污 劑，在石油中用作浮選劑，在紡織品、橡膠等中用作腐蝕抑制劑的脂肪胺的實(shí)例為叔胺，例 如二甲基烷基胺((：10，(：12、(：14、(：16或(：18)和二烷基甲基胺((：10);叔胺共混物，例如二甲基 烷基胺（C8-C18、C12-C18、C12-C14 或 C16-C18)。
[0062] 術(shù)語"克隆"通常是指起源于單一的共同的祖先并且與單一的共同的祖先在遺傳 上基本一致的細(xì)胞或一組細(xì)胞，例如由單一的細(xì)菌細(xì)胞形成的克隆的細(xì)菌集落的細(xì)菌。
[0063] 如本文所用，術(shù)語"培養(yǎng)物"通常是指包括活細(xì)胞的液體培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案 中，培養(yǎng)物包括在受控的條件下在預(yù)定的培養(yǎng)物培養(yǎng)基中再生產(chǎn)的細(xì)胞，例如在包括所選 的碳源和氮的液體培養(yǎng)基中生長的重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物。動(dòng)詞形式的"培養(yǎng)"或名詞形式 的"培養(yǎng)"是指使宿主細(xì)胞(例如重組宿主細(xì)胞)的群體在液體或固體培養(yǎng)基中在合適的條 件下生長。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)是指底物W發(fā)酵方式生物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。培養(yǎng)用的培養(yǎng) 基是公知的，并且此類培養(yǎng)物培養(yǎng)基的單個(gè)成分可得自商業(yè)來源(例如DIFCO培養(yǎng)基和BBL 培養(yǎng)基）。在一個(gè)實(shí)例中，水性營養(yǎng)培養(yǎng)基為包括氮、鹽和碳的復(fù)合來源的"富集培養(yǎng)基"，例 如YP培養(yǎng)基，其包含lOg/L蛋白腺W及l(fā)Og/L酵母提取物。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，營養(yǎng) 培養(yǎng)基為由痕量元素、營養(yǎng)物和鹽組成的"基本培養(yǎng)基"。
[0064] 術(shù)語"修飾的活性"或"改變的活性水平"（例如對(duì)于重組宿主細(xì)胞中的酶活性)是 指在相對(duì)于親代或天然宿主細(xì)胞確定的活性中存在的一個(gè)或多個(gè)特征的差異。通常，活性 的運(yùn)種差異是在重組宿主細(xì)胞（即，具有修飾的活性)與相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞之間確定的 (具體通過重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物與相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞的比較）。修飾的活性可W是W下 情況的結(jié)果，例如:重組宿主細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)的量改變(例如編碼蛋白質(zhì)的DNA序列的 拷貝數(shù)量升高或降低、編碼蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄子的數(shù)量升高或降低、和/或由mRNA形成蛋白 質(zhì)的蛋白質(zhì)翻譯的量升高或降低的結(jié)果）；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變(例如一級(jí)結(jié)構(gòu)改變，如蛋白 質(zhì)的編碼序列的改變，其導(dǎo)致底物特異性的改變、所見的動(dòng)力學(xué)參數(shù)改變）；W及蛋白質(zhì)的 穩(wěn)定性改變(例如蛋白質(zhì)降解的升高或降低）。在某些情況下，用于本文所述的多膚的編碼 序列為為了在特定的宿主細(xì)胞中的表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。例如就在大腸桿菌巧.COli)中的 表達(dá)而言，可W相應(yīng)地優(yōu)化一個(gè)或多個(gè)密碼子(參見61'〇3^'6日1161日1.(1982)66]16 18:199-209)。
[0065] 如本文所用，術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"通常是指DNA中堿基的序列，該序列與編碼蛋白質(zhì)的 DNA序列可操作地連接，其中所述的堿基的序列最終巧制蛋白質(zhì)的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包 括但不限于RNA啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(例如增強(qiáng)子 元件）、影響RNA穩(wěn)定性的核巧酸序列W及翻譯調(diào)節(jié)序列(例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)（例如原核生 物中的化ine寸algarno序列或真核生物中的Kozak序列）、起始密碼子、終止密碼子）。如本 文所用，短語"相對(duì)于野生型核巧酸序列來修飾所述的核巧酸序列的表達(dá)"是指內(nèi)源核巧酸 序列的表達(dá)和/或活性、或者異源或非天然的多膚編碼核巧酸序列的活性的水平的增加或 降低。術(shù)語"改變的表達(dá)水平"和"修飾的表達(dá)水平"可W交換使用，并且的相同的條件下，與 多核巧酸、多膚或碳氨化合物在相應(yīng)的野生型細(xì)胞中的濃度相比，多核巧酸、多膚或碳氨化 合物在改造的宿主細(xì)胞中W不同的濃度存在。如本文所用，術(shù)語"表達(dá)"對(duì)于多核巧酸而言 是使其發(fā)揮功能。當(dāng)編碼多膚(或蛋白質(zhì)）的多核巧酸表達(dá)時(shí)，其被轉(zhuǎn)錄并翻譯，從而生產(chǎn)所 述的多膚(或蛋白質(zhì)）。
[0066] 如本文所用，術(shù)語"效價(jià)"是指每單位體積的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的脂肪胺或者脂 肪胺相關(guān)化合物或組合物的量。在本文所述的組合物和方法的任何方面中，脂肪胺W大約 2 5mg/L、大約 5 Omg/L、大約 7 5mg/L、大約 1 OOmg/L、大約 12 5mg/L、大約 150mg/L、大約 17 5mg/L、 大約 200mg/L、大約 225mg/L、大約 250mg/L、大約 275mg/L、大約 300mg/L、大約 325mg/L、大約 350mg/L、大約 375mg/L、大約 400mg/L、大約 425mg/L、大約 450mg/L、大約 475mg/L、大約 500mg/L、大約 525mg/L、大約 550mg/L、大約 575mg/L、大約 600mg/L、大約 625mg/L、大約 650mg/L、大約 675mg/L、大約 700mg/L、大約 725mg/L、大約 750mg/L、大約 775mg/L、大約 800mg/L、大約 825mg/L、大約 850mg/L、大約 875mg/L、大約 900mg/L、大約 925mg/L、大約 950mg/L、大約 975mg/L、大約 lOOOmg/L、大約 1050mg/L、大約 1075mg/L、大約 llOOmg/L、大約 1125mg/L、大約 1150mg/L、大約 1175mg/L、大約 1200mg/L、大約 1225mg/L、大約 1250mg/L、大 約 1275mg/L、大約 1300mg/L、大約 1325mg/L、大約 1350mg/L、大約 1375mg/L、大約 1400mg/L、 大約 1425mg/L、大約 1450mg/L、大約 1475mg/L、大約 1500mg/L、大約 1525mg/L、大約 1550mg/ L、大約 1575mg/L、大約 1600mg/L、大約 1625mg/L、大約 1650mg/L、大約 1675mg/L、大約 1700mg/L、大約 1725mg/L、大約 1750mg/L、大約 1775mg/L、大約 1800mg/L、大約 1825mg/L、大 約 1850mg/L、大約 1875mg/L、大約 1900mg/L、大約 1925mg/L、大約 1950mg/L、大約 1975mg/L、 大約 2000mg/L(2g/L)、3g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、 90g/L、100g/L或上述任意兩個(gè)值所限定的范圍的效價(jià)生產(chǎn)。在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺 W高于lOOg/L、高于200g/L、或高于300g/L的效價(jià)生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明公開的方法由重組宿主 細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪胺的一個(gè)優(yōu)選效價(jià)為5g/L至200g/L、10g/L至150g/L、20g/L至120g/L、W及 30g/L至lOOg/L。效價(jià)可W指由給定的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的特定脂肪胺或者脂肪胺 的組合或組合物。例如在重組宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌）中可W將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的生 物合成蛋白質(zhì)的表達(dá)得到了比表達(dá)相應(yīng)的野生物多膚的重組宿主細(xì)胞(其缺乏可W將脂肪 醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的生物合成蛋白質(zhì)的表達(dá))更高效價(jià)的生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，更高的效 價(jià)范圍為至少大約5g/L至大約200g/L。
[0067]如本文所用，"由宿主細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪胺相關(guān)化合物(包括脂肪胺)的產(chǎn)率"是指輸 入的碳源在宿主細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的效率。根據(jù)本發(fā)明公開的方法經(jīng)改造從而生產(chǎn)脂肪 胺或脂肪胺相關(guān)化合物的宿主細(xì)胞具有的產(chǎn)率為至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至 少7 %、至少8%、至少9%、至少10%、至少11 %、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、 至少16%、至少17 %、至少18%、至少19%、至少20%、至少21 %、至少22%、至少23%、至少 24%、至少25 %、至少26 %、至少27 %、至少28 %、至少29 %、至少30 %或者由上述任意兩個(gè) 值所限定的范圍。在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺W高于大約30%、高于大約35%、高于大約 40%、高于大約45%、高于大約50%、高于大約55%、高于大約60%、高于大約65%、高于大 約70%、高于大約75%、高于大約80%、高于大約85%、高于大約90%或更高的產(chǎn)率生產(chǎn)。備 選地或此外，產(chǎn)率為大約30%或更低、大約27%或更低、大約25%或更低、大約22%或更低。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)率為大約50%或更低，大約45%或更低，或者大約35%或更低。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)率為大約95%或更低、90%或更低、85%或更低、80%或更低、75%或 更低、70%或更低、65%或更低、60%或更低、55%或更低、50%或更低。因此，產(chǎn)率可W由上 述任意兩個(gè)端點(diǎn)來限定。例如根據(jù)本發(fā)明公開的方法由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪胺或脂肪 胺相關(guān)化合物的產(chǎn)率可W為大約5%至大約15%、大約10%至大約25%、大約10%至大約 22%、大約15%至大約27%、大約18%至大約22%、大約20%至大約28%、大約20%至大約 30%、大約30%至大約40%、大約40%至大約50 %、大約50%至大約60%、大約60%至大約 70%、大約70%至大約80%、大約80%至大約90%、或大約90%至大約100%。產(chǎn)率可W指由 給定的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的特定的脂肪胺或脂肪胺相關(guān)化合物或脂肪胺的組合物。 例如在重組宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌）中可W將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的生物合成蛋白質(zhì)的 表達(dá)使得脂肪胺或脂肪胺衍生物的化合物(包括脂肪胺的組合物或共混物）W比表達(dá)相應(yīng) 的野生型多膚的宿主細(xì)胞更高的產(chǎn)率生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，更高的產(chǎn)率范圍為大約 10%至大約100%的理論產(chǎn)率。
[0068] 如本文所用，術(shù)語"生產(chǎn)率"是指每單位時(shí)間內(nèi)每單位體積的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn) 一種或多種脂肪胺或脂肪胺相關(guān)化合物(包括一種或多種脂肪胺的組合物或共混物)的量。 在本文所述的組合物和方法的任何方面中，由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)脂肪胺相關(guān)化合物(包括 脂肪胺的組合物或共混物）的生產(chǎn)率為至少lOOmg/L/小時(shí)、至少200mg/L/小時(shí)、至少300mg/ L/小時(shí)、至少400mg/L/小時(shí)、至少500mg/L/小時(shí)、至少600mg/L/小時(shí)、至少700mg/L/小時(shí)、至 少800mg/L/小時(shí)、至少900mg/L/小時(shí)、至少lOOOmg/L/小時(shí)、至少1 lOOmg/L/小時(shí)、至少 1200mg/L/小時(shí)、至少1300mg/L/小時(shí)、至少1400mg/L/小時(shí)、至少1500mg/L/小時(shí)、至少 1600mg/L/小時(shí)、至少1700mg/L/小時(shí)、至少1800mg/L/小時(shí)、至少1900mg/L/小時(shí)、至少 2000mg/L/小時(shí)、至少2100mg/L/小時(shí)、至少2200mg/L/小時(shí)、至少2300mg/L/小時(shí)、至少 2400mg/L/小時(shí)、或至少2500mg/L/小時(shí)，或者高達(dá)lOg/L/小時(shí)(取決于細(xì)胞質(zhì)量）。例如根據(jù) 本發(fā)明公開所述的方法由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪胺相關(guān)化合物(包括脂肪胺的組合物或 共混物）的生產(chǎn)率可W為500mg/L/小時(shí)至2500mg/L/小時(shí)、或700mg/L/小時(shí)至2000mg/L/小 時(shí)。所述的生產(chǎn)率可W指由給定的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的特定的脂肪胺相關(guān)化合物， 包括脂肪胺的組合物或者脂肪胺的共混物或脂肪胺的組合。例如在重組宿主細(xì)胞(例如大 腸桿菌）中可W將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的生物合成蛋白質(zhì)的表達(dá)使得脂肪胺衍生的化合物 (包括脂肪胺W及其組合物和共混物）W比表達(dá)相應(yīng)的野生型多膚的重組宿主細(xì)胞升高的 生產(chǎn)率生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，較高的生產(chǎn)率范圍為大約〇.3g/L/h至大約3g/L/h。
[0069] 如本文所用，術(shù)語"總脂肪物質(zhì)"、"總脂肪胺產(chǎn)物"和"脂肪胺衍生物"在本文中可 W交換使用，其是指脂肪胺的量，所述的脂肪胺可W由表達(dá)可W將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的 生物合成蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞生產(chǎn)，運(yùn)可W通過GC-FID來評(píng)價(jià)。
[0070] 如本文所用，術(shù)語"葡萄糖利用率"是指每單位時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)物使用的葡萄糖的量， 其報(bào)告為克/升/小時(shí)(g/L/hr)。
[0071] 如本文所用，術(shù)語"碳源"是指適于用作原核或簡單的真核細(xì)胞生長所需的碳源的 底物或化合物。碳源可W為多種形式，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醒、酬、氨 基酸、膚和氣體(例如CO和C〇2)。示例性的碳源包括但不限于:單糖，例如葡萄糖、果糖、甘露 糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖;寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如淀粉、纖維素、 膠質(zhì)和木聚糖;二糖，例如薦糖、麥芽糖、纖維二糖和松二糖;纖維素材料和變體，例如半纖 維素、甲基纖維素和簇甲基纖維素鋼;飽和的或不飽和的脂肪酸、班巧酸鹽、乳酸鹽和醋酸 鹽;醇，例如乙醇、甲醇和甘油;或它們的混合物。此外，碳源還可W為光合成產(chǎn)物，例如葡萄 糖。在某些實(shí)施方案中，碳源為得自廢氣的包含CO的氣體混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，碳 源為得自包含碳的材料(例如生物質(zhì)、木炭或天然氣）的重構(gòu)的、包含CO的氣體混合物。在其 他的實(shí)施方案中，碳源為合成氣、甲燒或天然氣。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源為生物質(zhì)。 在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源為葡萄糖。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源為薦糖。在其他 的實(shí)施方案中，碳源為甘油。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源為甘薦汁、甘薦糖漿或玉米糖 漿。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源衍生自可再生的原料，例如C〇2、CO、葡萄糖、薦糖、木糖、 阿拉伯糖、甘油、甘露糖或它們的混合物。在其他的實(shí)施方案中，碳源衍生自可再生的原料， 包括淀粉、纖維素生物質(zhì)、糖蜜和碳水化合物的其他來源，包括由纖維素生物質(zhì)的水解衍生 得到的碳水化合物混合物，或由植物-或天然油處理衍生得到的廢料。
[0072] 如本文所用，術(shù)語"生物質(zhì)"是指可W衍生得到碳源的任何生物材料。在一些實(shí)施 方案中，適于生物轉(zhuǎn)化的生物質(zhì)被加工成碳源。在其他的實(shí)施方案中，生物質(zhì)不需要進(jìn)一步 加工成碳源。碳源可W轉(zhuǎn)化為包含脂肪胺的組合物。示例性的生物質(zhì)來源為植物物質(zhì)或蔬 菜，例如谷物、甘薦或柳枝稷。另一種示例性的生物質(zhì)來源為代謝廢物，例如動(dòng)物物質(zhì)(例如 牛糞便）。其他的示例性生物質(zhì)來源包括藻類和其他海生植物。此外，生物質(zhì)還包括由工業(yè)、 農(nóng)業(yè)、林業(yè)和家庭得到的廢物，包括但不限于甘油、發(fā)酵廢物、未干的巧草、稻草、木材、污 物、垃圾、纖維素城市廢物和食物剩余物(例如肥皂、油和脂肪酸）。此外，術(shù)語"生物質(zhì)"還指 碳源，例如碳水化合物(例如單糖、二糖或多糖）。
[0073] 如本文所用，對(duì)產(chǎn)物(例如脂肪酸及其組合物和共混物)而言的術(shù)語"分離的"是指 由細(xì)胞成分、細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基、或者化學(xué)或合成的前體分離得到的產(chǎn)物。通過本文所述的 方法生產(chǎn)的脂肪胺在發(fā)酵液及細(xì)胞質(zhì)中相對(duì)而言可W是不可混合的。因此，所述的脂肪胺 可W在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外收集于有機(jī)相中。
[0074] 如本文所用，術(shù)語動(dòng)詞性的"純化"、形容詞性的"純化的"或名詞性的"純化"是指 通過例如分離或隔離將分子從其環(huán)境中移出或分離。"基本上純化的"分子為至少大約60% 游離于(例如至少大約70%游離于、至少大約75%游離于、至少大約85%游離于、至少大約 90%游離于、至少大約95%游離于、至少大約97游離于、至少大約99%游離于)它們所關(guān)聯(lián) 的其他組分。如本文所用，運(yùn)些術(shù)語還指從樣品中去除污染物。例如污染物的去除可W使樣 品中脂肪胺衍生的化合物(包括脂肪胺及其組合物和共混物)的百分率增加。例如當(dāng)在重組 宿主細(xì)胞中生產(chǎn)脂肪胺相關(guān)的化合物時(shí)，可W通過去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和/或其他宿主細(xì) 胞材料來純化脂肪胺相關(guān)的化合物。純化后，樣品中脂肪胺的百分率增加。術(shù)語動(dòng)詞性的 "純化"、形容詞性的"純化的"或名詞性的"純化"是相對(duì)的術(shù)語，其不需要絕對(duì)的純度。因 此，例如當(dāng)在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)脂肪胺相關(guān)的化合物時(shí)，脂肪胺化合物基本與其他細(xì)胞 成分(例如核酸、多膚、脂質(zhì)、碳水化合物或其他碳氨化合物)分離。
[0075] 如本文所用，術(shù)語"衰減"是指減弱、降低或減少。例如可W通過修飾多膚使該多膚 衰減，從而降低其活性(例如通過修飾編碼多膚的核巧酸序列）。
[0076] 術(shù)語"生產(chǎn)脂肪醒的生物合成酶"或"脂肪醒生成酶"在本文中可交換是會(huì)用，并且 是指具有生成脂肪醒或脂肪醒前體的酶活性的多膚、蛋白質(zhì)或酶。此類酶的實(shí)例包括但不 限于簇酸還原酶(CAR)(例如Ca巧)和/或硫醋酶(TE)(例如TesA, 'tesA);酷基-ACP還原酶 (AARK例如得自細(xì)長聚球藻PCC7942);酷基-CoA還原酶(例如Acrl);憐酸泛酷琉基乙胺基 轉(zhuǎn)移酶(PPTase)等。
[0077] 由脂肪醒前體形成脂肪胺
[0078] 本發(fā)明公開設(shè)及脂肪胺的微生物生產(chǎn)。如本文所示，微生物有機(jī)體可W經(jīng)過遺傳 改造而表達(dá)多種生物合成酶，從而在體內(nèi)生產(chǎn)脂肪胺。更具體而言，微生物有機(jī)體可W經(jīng)過 遺傳改造而表達(dá)將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的代謝途徑。所述的途徑表達(dá)至少一種生物合成 酶，其具有將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的氨基轉(zhuǎn)移酶（例如得自大腸桿菌的腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶 (YgjG)或GABA氨基轉(zhuǎn)移酶(PuuE))、胺脫氨酶(例如脫氮副球菌的甲基胺脫氨酶或假單胞菌 屬菌種的quinohemo蛋白質(zhì)）或胺氧化酶活性。轉(zhuǎn)氨酶與氨基轉(zhuǎn)移酶實(shí)施相同的反應(yīng)，并且 運(yùn)些名稱有時(shí)可交換使用。例如GABA氨基轉(zhuǎn)移酶還稱為4-氨基下酸轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)實(shí)施方 案中，氨基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶、胺脫氨酶或胺氧化酶為外源生物合成酶或者在細(xì)胞中是外源表 達(dá)的。備選地，可W通過將用于脂肪胺生產(chǎn)的改造途徑(表達(dá)具有將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的 氨基轉(zhuǎn)移酶、胺脫氨酶或胺氧化酶活性的生物合成酶)與用于脂肪醒生產(chǎn)的改造途徑(表達(dá) 生產(chǎn)脂肪醒的外源生物合成酶)結(jié)合來生產(chǎn)脂肪胺?？蒞通過多個(gè)過程和改造的途徑(例如 用于脂肪醒生產(chǎn)(參見美國專利N〇.8,097,439,該文獻(xiàn)W引用方式并入本文)的改造的簇酸 還原酶(CAR)途徑，用于脂肪醇生產(chǎn)（參見美國專利N〇.8,097,439,上文）的改造的CAR和硫 醋酶(TE)途徑，用于脂肪醒或脂肪醇生產(chǎn)(參見美國申請(qǐng)公開No.20130035513,該文獻(xiàn)W引 用方式并入本文）的改造的憐酸泛酷琉基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)和CAR途徑，用于脂肪醒生 產(chǎn)（參見美國專利No.8,268,599,該文獻(xiàn)W引用方式并入本文)或用于燒控生產(chǎn)（參見美國 專利No.8,323,924,該文獻(xiàn)W引用方式并入本文）的改造的酷基-ACP還原酶(AAR)途徑)在 體內(nèi)生成此類脂肪醒前體。合適的TE的實(shí)例為'TesA(即，得自大腸桿菌的截短的硫醋酶，其 具有被除去的細(xì)胞周質(zhì)前導(dǎo)序列（因此帶有撇號(hào)），使得其保留在細(xì)胞質(zhì)中）；合適的CAR的 實(shí)例為化巧;合適的AAR的實(shí)例為得自細(xì)長聚球藻P(X7942的酶(參見表6，如下）。
[0079] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于脂肪醒生產(chǎn)的改造途徑和用于脂肪胺生產(chǎn)的改造途徑的 共表達(dá)、及具有氨基轉(zhuǎn)移酶、胺脫氨酶或胺氧化酶活性的生物合成酶的表達(dá)、并且補(bǔ)充合適 的氮源(例如谷氨酸鹽、氨或過氧化氨)允許醒的前體轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的胺(腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶參 見表1;酶反應(yīng)的實(shí)例參見表2、3和4)。用于氨基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的氮供者(例如谷氨酸鹽）的可 利用性可W通過過表達(dá)谷氨酸鹽脫氨酶可任選地增強(qiáng)，從而增加谷氨酸鹽生物合成的速 率。天然大腸桿菌谷氨酸鹽脫氨酶利用NADPH作為氧化還原輔助因子，因此，使用能夠代替 地利用NADH的谷氨酸鹽脫氨酶(例如得自擬桿菌屬菌種的谷氨酸鹽脫氨酶，包括但不限于 多形類桿菌（B.thetaiotaomicron)、脆弱類桿菌（B.fragilis)、吉氏類桿菌 (B.distasonis)、卵形類桿菌（B . ovatus )、普通類桿菌（B . vulgatus)和單形擬桿菌 (B.化iformis))來替代所述的酶可W增加細(xì)胞中NADPH的可利用性。運(yùn)可W為依賴于NADPH 的其他生物合成過程(例如脂肪酸生物合成)提供增加的NADPH供應(yīng)。
[0080] 下表1(下文）描繪了用于多種生物合成酶的EC號(hào)和名稱，其中所述的酶可用于胺 的生產(chǎn)，包括氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶。酶學(xué)委員會(huì)或分類號(hào)巧C號(hào))是根據(jù)它們所催化的化學(xué)反 應(yīng)而用于酶的數(shù)字分類方案。EC號(hào)不是在技術(shù)上說明酶，而是它們說明酶催化的反應(yīng)。例如 如果不同的酶(例如得自不同的有機(jī)體)催化相同的反應(yīng)，則它們得到相同的EC號(hào)。此外，不 同的蛋白質(zhì)折疊可W催化相同的反應(yīng)，由于趨同進(jìn)化，因此它們被分配給相同的EC號(hào)（即， 它們被稱為非同源的同工酶或NISE)。如表1所示，腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶的酶活性分類在EC號(hào) 2.6.1.82下。表1中所示的所有酶均參與了得到胺的化學(xué)反應(yīng)，并且由于它們的EC號(hào)均落入 EC 2.6.1下，因此分類為氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶(還參見表7,下文）。下表2(下文)示出了可W 由脂肪醒前體生產(chǎn)脂肪胺的多種不同的生物合成酶。例如氨基轉(zhuǎn)移酶或轉(zhuǎn)氨酶、胺氧化酶 和胺脫氨酶催化多種反應(yīng)，其中脂肪醒前體被轉(zhuǎn)化成脂肪胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，改造的代 謝途徑包括用于在體內(nèi)生產(chǎn)脂肪醒的氨基轉(zhuǎn)移酶或轉(zhuǎn)氨酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改造的 代謝途徑包括用于在體內(nèi)生產(chǎn)脂肪醒的胺氧化酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改造的代謝途徑 包括用于在體內(nèi)生產(chǎn)脂肪醒的胺脫氨酶。下表3(下文)示出了通過腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶催化的 反應(yīng)，即，將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺。
[0081 ] 表1:在EC 2.6.1下與胺生產(chǎn)有關(guān)的酶
[0084]
[0085]
[0086]
[0087]
[008引
[0089]為了說明本發(fā)明公開，重組宿主細(xì)胞經(jīng)改造而表達(dá)硫醋酶(TE)(其催化酷基-ACP 或酷基-CoA轉(zhuǎn)化成游離脂肪酸)和簇酸還原酶(CAR)(其將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醒）。重組 宿主細(xì)胞經(jīng)過進(jìn)一步改造而表達(dá)腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶(YgjG),從而將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺(試 驗(yàn)結(jié)果參見實(shí)施例1;由化iG實(shí)施的酶反應(yīng)參見表3(上文）；氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶的機(jī)制參見 表5(下文））。在此，由大腸桿菌克隆ygjG基因，并將其連接至表達(dá)載體中，從而生成表達(dá)質(zhì) 粒。通過克隆并整合Ca巧和tesA基因而生成第二表達(dá)質(zhì)粒。然后，使用運(yùn)巧巾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 并將其在具有碳源的發(fā)酵肉湯中培養(yǎng)。證實(shí)脂肪胺的生產(chǎn)，而對(duì)照細(xì)胞不生產(chǎn)脂肪胺(參見 實(shí)施例1)。任何合適的氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶都可W用于生產(chǎn)脂肪胺，只要該酶的活性可W將 脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺即可。如果所述的細(xì)胞天然生產(chǎn)脂肪醒，則如實(shí)施例1所示，將該細(xì)胞 改造成表達(dá)外源腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶(YgjG),從而將天然存在的脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺。
[0090] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，可W使用胺脫氨酶來代替氨基轉(zhuǎn)移酶，而將脂肪醒轉(zhuǎn)化成 脂肪胺（由胺脫氨酶實(shí)施的酶反應(yīng)參見表4(下文）；和酶的實(shí)例參見表7(下文））。如果氮源 是氨而不是氨基酸，則上述情況是可用的?？蒞用于將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的胺脫氨酶的 實(shí)例落入EC號(hào)EC 1.4.9; EC 1.4.98和EC 1.4.99之下（參見表7,下文）。例如丙氨酸脫氨酶、 谷氨酸脫氨酶、1^-賴氨酸-6-脫氨酶和甲基胺脫氨酶為可W用于將脂肪醒轉(zhuǎn)化成脂肪胺的 胺脫氨酶的實(shí)例(參加表7,下文）。
[0091] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，可W使用胺氧化酶來代替氨基轉(zhuǎn)移酶，而將脂肪醒轉(zhuǎn)化成 脂肪胺。
[0096] 下表6和7(下文)描繪了多種酶的活性W及它們相應(yīng)的酶分類化C)號(hào)。[0097] 表6:酶的活性
[0092] 夫4:眩脫気酪的巧脈
[0093]
[0094]
[0095]



[0103]
[0104] 表7:氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶化C 2.6. I)和胺脫氨酶化C I. 4.9，EC I. 4.98，EC 1.4.99)的實(shí)例
[0105]
[Wiuu」 1化工1^^|日工：円；]旺/町巴'|| J口リ^口ク^1?J
[0107]本發(fā)明公開的微生物有機(jī)體發(fā)揮微生物宿主細(xì)胞的作用，并且包含一個(gè)或多個(gè)多 核巧酸序列，該多核巧酸序列包含編碼本發(fā)明公開的至少一種外源生物合成酶的開放閱讀 框。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪胺組合物是在有效表達(dá)脂肪胺的條件下在碳源存在下通過培 養(yǎng)的宿主細(xì)胞生產(chǎn)的，其中所述的宿主細(xì)胞表達(dá)外源生物合成酶（例如氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨 酶、胺脫氨酶或胺氧化酶）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪胺組合物是在有效表達(dá)脂肪胺的條 件下在碳源存在下通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞生產(chǎn)的，其中所述的宿主細(xì)胞表達(dá)一種或多種外源生 物合成酶（例如氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶、胺脫氨酶或胺氧化酶組合一種或多種醒生成酶例如 CAR(例如化巧)和/或TE(例如TesA,'tesA)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪胺組合物是在有效 表達(dá)脂肪胺的條件下在碳源存在下通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞生產(chǎn)的，其中所述的宿主細(xì)胞表達(dá)一 種或多種外源生物合成酶(例如氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶、胺脫氨酶或胺氧化酶組合一種或多種 醒生成酶例如酷基-ACP還原酶(AARK例如得自細(xì)長聚球藻PCC7942))。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，脂肪胺組合物是在有效表達(dá)脂肪胺的條件下在碳源存在下通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞生產(chǎn)的， 其中所述的宿主細(xì)胞表達(dá)一種或多種外源生物合成酶(例如氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶、胺脫氨酶 或胺氧化酶組合一種或多種醒生成酶(例如酷基-CoA還原酶(例如Acrl))。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，脂肪胺組合物是在有效表達(dá)脂肪胺的條件下在碳源存在下通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞生產(chǎn) 的，其中所述的宿主細(xì)胞表達(dá)一種或多種外源生物合成酶(例如氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶、胺脫 氨酶或胺氧化酶組合一種或多種醒生成酶例如憐酸泛酷琉基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)。
[0108] 生物合成酶的表達(dá)導(dǎo)致W脂肪胺和/或脂肪胺組合物或其共混物的升高的產(chǎn)率生 產(chǎn)脂肪胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶多膚在宿主細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致脂肪 胺或其組合物的高的產(chǎn)率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶多膚組合一種或 多種醒生成酶在宿主細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致脂肪胺及其組合物的高的產(chǎn)率。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，胺氧化酶組合一種或多種醒生成酶在宿主細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致脂肪胺及其組合物的高的 產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，生物合成酶在細(xì)胞中是外源表達(dá)的。
[0109] 本發(fā)明公開的宿主細(xì)胞或微生物有機(jī)體可W包括宿主菌株或宿主細(xì)胞，其經(jīng)過進(jìn) 一步的遺傳改造而包含改變，從而測試特定的突變或操縱對(duì)酶活性（即，重組細(xì)胞或微生物 有機(jī)體)的效力。根據(jù)起始宿主細(xì)胞中存在的天然酶途徑的類型，多種可任選的遺傳操縱和 改變?cè)谝环N宿主細(xì)胞和另一種宿主細(xì)胞之間可交換使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主菌株可 W用于測試氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶多膚組合醒生成多膚的表達(dá)。為了測試特定的可變因 素，宿主菌株可W包含多種遺傳改變，包括但不限于培養(yǎng)條件，包括發(fā)酵成分、碳源(例如原 料）、溫度、壓力、降低的培養(yǎng)物污染條件和氧的水平。
[0110] 在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主菌株包含可任選的fa祀和fhuA刪除。酷基-CoA脫氨酶 (FadE)是對(duì)代謝脂肪酸而言重要的酶。其在脂肪酸的利用(0-氧化）中催化第二步，該步驟 是將脂肪酸(酷基-CoA)的長鏈斷裂成酷基-CoA分子的過程。更具體而言，在細(xì)菌中脂肪酸 降解的0-氧化循環(huán)的第二步是將酷基-CoA氧化成2-締酷基-CoA,該步驟由化祀催化。當(dāng)大 腸桿菌缺乏化祀時(shí)，其不能在脂肪酸作為碳源上生長，但是可W在醋酸鹽上生長。無法利用 任何鏈長的脂肪酸符合所報(bào)告的fa祀菌株的表現(xiàn)型，即，化祀功能被破壞的fa祀突變體菌 株。fa祀基因可W可任選地被敲除或衰減，從而確保在脂肪胺途徑中可W作為中間體的酷 基-CoA可W在細(xì)胞中累積，使得所有酷基-CoA均可W有效地轉(zhuǎn)化成脂肪胺。但是，fa祀衰減 在糖作為碳源時(shí)是可任選的，運(yùn)是因?yàn)樵谶\(yùn)種條件下，F(xiàn)a祀的表達(dá)可能被抑制，并因此， FadE可W僅W少量存在，而不能有效地與用于酷基-CoA底物的醋合酶競爭。FadE由于降解 物阻抑而被抑制。大腸桿菌和其他微生物優(yōu)選消耗糖超過脂肪酸，因此當(dāng)巧巾碳源均可利用 時(shí)，糖首先通過阻抑fad調(diào)節(jié)子而被消耗（參見D.Clark,J Bacteriol. (1981)148(2) :521-6))。此外，糖的缺乏會(huì)誘導(dǎo)化祀表達(dá)?？峄?CoA中間體可W不再屬于0氧化途徑，運(yùn)是因?yàn)?被fad調(diào)節(jié)子(包括化祀)表達(dá)的蛋白質(zhì)受到上調(diào)，并將有效地與酷基-CoA競爭。因此，在某 些環(huán)境下可W有利的是fadE基因被敲除或衰減。由于許多碳源是碳水化合物基，所W可任 選地衰減化祀。基因化uA編碼TonA蛋白質(zhì)，其在大腸桿菌的外膜中是能量偶聯(lián)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 和受體(V.Braun(2009) J Bacteriol. 191(11): 3431-3436)。其刪除是可任選的?？?uA 的刪 除允許細(xì)胞更加抵抗于隧菌體的攻擊，運(yùn)在某些發(fā)酵條件下是有利的。因此，理想的是在發(fā) 酵運(yùn)行過程中可能遭受潛在污染的宿主細(xì)胞中刪除扣uA。
[0111] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主菌株(上文)還包含W下一種或多種基因的可任選的過 表達(dá)，包括f adR、f abA、f abD、f abG、f a地、f abV和/或f abF。此類基因的實(shí)例是得自大腸桿菌 的fadR，得自鼠傷寒沙口氏菌(Salmonella typhimurium)的fabA(NP_460041)，得自鼠傷寒 沙口氏菌的f abD (NP_460164)，得自鼠傷寒沙口氏菌的化bG (NP_460165)，得自鼠傷寒沙口 氏菌的fabH(NP_460163)，得自霍亂弧菌的fabV(YP_001217283)，W及得自丙酬下醇梭菌 (〔1〇3付1(1;[11111曰。61:0131115^1;[州111)的化6。(肥_350156)。運(yùn)些基因（編碼脂肪酸生物合成中的 酶和調(diào)節(jié)因子)的一種或多種的可任選的表達(dá)在多種培養(yǎng)條件下可W起到增加脂肪酸衍生 化合物的效價(jià)的作用。
[0112] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，大腸桿菌菌株用作脂肪胺生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。相似地，運(yùn)些宿 主細(xì)胞可W提供一種或多種生物合成基因（即，編碼脂肪酸生物合成的酶和調(diào)節(jié)因子)的可 任選的過表達(dá)，其中所述的基因在多種培養(yǎng)條件下可W增加脂肪酸衍生化合物(例如脂肪 胺）的效價(jià)，所述的基因包括但不限于化(11?^曰64^曰60、化66^曰地、化13￥和/或'曰6。。遺傳改 變的實(shí)例包括得自大腸桿菌的fadR，得自鼠傷寒沙口氏菌的化bA(NP_460041)，得自鼠傷寒 沙口氏菌的f abD (NP_460164)，得自鼠傷寒沙口氏菌的化bG (NP_460165)，得自鼠傷寒沙口 氏菌的fabH(NP_460163)，得自霍亂弧菌的fabV(YP_001217283)，W及得自丙酬下醇梭菌的 fabF(NP_350156)〇
[0113] 在一些實(shí)施方案中，可W用于表達(dá)生物合成酶(例如氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶組合 醒生成酶，例如CAR和/或TE和/或AAR和/或PP化Se)的宿主細(xì)胞或微生物有機(jī)體可W進(jìn)一步 表達(dá)包含某些酶活性的基因，其中所述的酶活性可W增加一種或多種特定脂肪酸衍生物的 生產(chǎn)，例如脂肪醋、脂肪醇、脂肪胺、脂肪醒、雙功能脂肪酸衍生物、二酸等。在一個(gè)實(shí)施方案 中，宿主細(xì)胞具有用于脂肪酸生產(chǎn)的硫醋酶活性化.C. 3.1 .2.*或E.C. 3. 1.2. 14或 E.C.3.1.1.5)，脂肪酸的生產(chǎn)可W通過使所述的基因過表達(dá)而增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 宿主細(xì)胞具有用于脂肪醋生產(chǎn)的醋合酶活性化.C. 2.3.1.75)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主 細(xì)胞具有用于脂肪醇生產(chǎn)的酷基-ACP還原酶(AARKE. C. 1.2.1.80)活性和/或醇脫氨酶活 性化.C. 1.1.1.1.)和/或脂肪醇酷基-CoA還原酶(FARKE.C. 1.1.1 .*)活性和/或簇酸還原 酶(CARKEC 1.2.99.6)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有用于脂肪醒生產(chǎn)的酷基-ACP還原酶(AARKE.C. 1.2.1.80)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有用于燒控和締 控生產(chǎn)的酷基-ACP還原酶(AARKE. C. 1.2.1.80)活性和脫幾基酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，宿主細(xì)胞具有用于脂肪醇生產(chǎn)的酷基-CoA還原酶化.C. 1.2.1.50)活性，酷基-CoA合酶 (Fa 加）化.(：.2.3.1.86)活性，和硫醋酶化.(：.3.1.2.*或6.(：.3.1.2.14或6.(：.3.1.1.5)活 性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有用于脂肪醋生產(chǎn)的醋合酶活性化.C. 2.3.1.75)，酷 基-CoA合酶（FadD)化.C. 2.3.1.86)活性，和硫醋酶化.C. 3.1.2 . *或E . C. 3.1.2.14或 E.C.3.1.1.5)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有用于酬生產(chǎn)的OleA活性。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有用于內(nèi)締控的生產(chǎn)的OleBCD活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì) 胞具有用于脂肪醇生產(chǎn)的酷基-ACP還原酶(AAR)化.C. 1.2.1.80)活性和醇脫氨酶活性 (E.C.1.1.1.1.)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有用于制備端控的硫醋酶 化.C. 3.1.2. *或E. C. 3.1.2.14或E. C. 3.1.1.5)活性和脫簇酶活性。酶活性在微生物有機(jī)體 和微生物細(xì)胞中的表達(dá)由美國專利號(hào)8，097,439;8,110，093;8,110,670 ;8,183,028 ;8， 268,599;8,283，143;8,232,924;8,372,610;和8,530,221所教導(dǎo)，運(yùn)些文獻(xiàn)^引用方式并 入本文。
[0114] 在其他的實(shí)施方案中，用于表達(dá)生物合成酶(例如氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶組合醒 生成酶，例如CAR和/或TE和/或AAR和/或PP化Se)的宿主細(xì)胞或微生物有機(jī)體將包含受到上 調(diào)或過表達(dá)從而生產(chǎn)一種或多種特定的脂肪酸衍生物(例如脂肪胺)的某些天然酶活性。在 一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有用于脂肪酸生產(chǎn)的天然硫醋酶（E.C. 3. 1.2.*或 E. C. 3.1.2.14或E. C. 3.1.1.5)活性，脂肪酸的生產(chǎn)可W通過是硫醋酶基因過表達(dá)來增加。
[0115] 本發(fā)明公開包括表達(dá)編碼生物合成酶（例如氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶組合醒生成 酶，例如CAR和/或TES和/或AAR和/或PP化Se)的基因的宿主菌株或微生物有機(jī)體。在一個(gè)實(shí) 施方案中，至少一種生物合成酶在宿主細(xì)胞中是外源表達(dá)的。例如宿主細(xì)胞可W表達(dá)外源 氨基轉(zhuǎn)移酶，從而生產(chǎn)脂肪胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種生物合成酶在宿主細(xì)胞中 是外源表達(dá)的。例如宿主細(xì)胞可W表達(dá)外源氨基轉(zhuǎn)移酶和外源簇酸還原酶(CAR),從而生產(chǎn) 脂肪胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種生物合成酶在宿主細(xì)胞中是外源表達(dá)的，組合在 宿主細(xì)胞中過表達(dá)的一種或多種生物合成酶。例如宿主細(xì)胞可W表達(dá)外源氨基轉(zhuǎn)移酶和外 源簇酸還原酶(CAR),組合外源和/或過表達(dá)的硫醋酶，從而生產(chǎn)脂肪胺。硫醋酶可W是外源 表達(dá)的硫醋酶。備選地，硫醋酶可W是天然硫醋酶，該硫醋酶通過特定的強(qiáng)啟動(dòng)子或本領(lǐng)域 那些技術(shù)人員公知的其他分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)胞中過表達(dá)或轉(zhuǎn)錄上調(diào)。重組宿主細(xì)胞生產(chǎn) 脂肪胺及其組合物和共混物。脂肪胺通常由培養(yǎng)物培養(yǎng)基回收，和/或由宿主細(xì)胞分離。在 一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪胺由培養(yǎng)物培養(yǎng)基(細(xì)胞外）回收。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪胺由宿 主細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)）分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪胺由培養(yǎng)物培養(yǎng)基回收并由宿主細(xì)胞分 離?？蒞使用本領(lǐng)域已知的方法來分析由宿主細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪胺組合物，例如GC-FID，從而 確定特定脂肪胺的分布，W及脂肪胺組合物的成分的鏈長和飽和度。
[0116] 發(fā)揮微生物有機(jī)體(例如微生物細(xì)胞)功能的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于埃希 氏菌屬、芽抱桿菌屬、乳桿菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、曲霉菌屬、木霉屬、 脈抱菌屬、鑲刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、根毛霉菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、毛霉菌屬、毀絲菌 屬、青霉屬、毛平革菌、側(cè)耳屬、栓菌屬、金抱子菌屬、酵母菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、裂殖酵母屬、 耶氏酵母屬或鏈霉菌屬。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。在其他的實(shí) 施方案中，宿主細(xì)胞為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì) 胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌B細(xì)胞、大腸桿菌C細(xì)胞、大腸桿菌K細(xì)胞或大腸 桿菌W細(xì)胞。在其他的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為遲緩芽胞桿菌(Bacillus Ien化S)細(xì)胞、短小 芽抱桿菌(BaciIlus brevis)細(xì)胞、嗜熱脂肪芽胞桿菌(BaciIlus StearothermophiIus)細(xì) 胞、地衣芽胞桿菌（Bacillus Iichenoformis)細(xì)胞、嗜堿芽抱桿菌（Bacillus alkalophiIus)細(xì)胞、凝固芽胞桿菌（Bacillus coagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽胞桿菌（Bacillus C ir CU Ians)細(xì)胞、短小芽抱桿菌（Baci Ilus pumi Iis)細(xì)胞、蘇云金芽抱桿菌（Baci Ilus 化111'；[雌1611313)細(xì)胞、克勞氏芽抱桿菌(83(3；[11118(313113；[；0細(xì)胞、巨大芽胞桿菌(83(3；[11118 megaterium)細(xì)胞、枯草芽胞桿菌（Baci Ilus subtil is)細(xì)胞或解淀粉芽抱桿菌（Baci Ilus amyIoliquefaciens) O
[0117] 在其他的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為康氏木霉(Trichoderma koningii)細(xì)胞、綠色 木霉（Trichoderma viride)細(xì)胞、里氏木霉（Trichoderma reesei)細(xì)胞、長枝木霉 (Trichoderma 1〇11容化^(3111過切111)細(xì)胞、泡盛曲霉（六3口6萬容;[11113過師過11101'；0細(xì)胞、煙曲霉 (Aspergillus fumigates)細(xì)胞、臭曲霉（Aspergillus foetidus)細(xì)胞、構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidulans)細(xì)胞、黑曲霉（AspergiIlus niger)細(xì)胞、米曲霉（AspergiIlus Oirzae)細(xì)胞、特異腐質(zhì)霉（HumiCOIa insolens)細(xì)胞、疏棉狀嗜熱絲抱菌（HumiCOIa Ianuginose)細(xì)胞、紅球菌（加 odococcus opacus)細(xì)胞、米赫根毛霉（加 izomucor miehei) 細(xì)胞或米黑毛霉(Mucor michei)細(xì)胞。在其他的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為變鉛青鏈霉菌 (Streptomyces Iividans)細(xì)胞或贏灰鏈霉菌（Streptomyces murinus)細(xì)胞D在其他的實(shí) 施方案中，宿主細(xì)胞為放線菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
[0118] 在其他的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為得自真核植物、藻類、藍(lán)細(xì)菌、綠色硫細(xì)菌、綠色 非硫菌、紫色硫細(xì)菌、紫色非硫細(xì)菌、極端微生物、酵母菌、真菌、它們的改造的有機(jī)體或合 成的有機(jī)體的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為光依賴的或者固定碳。在一些實(shí)施方案 中，宿主細(xì)胞具有自養(yǎng)活性。
[0119] 在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有光合自養(yǎng)活性，例如在光存在下。在一些實(shí)施方 案中，宿主細(xì)胞在光缺乏下是異養(yǎng)的或兼養(yǎng)的。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為得自擬南 芥、柳枝稷（Panicum virgatum)、奇崗（Miscanthus giganteus)、玉米（Zea mays)、布朗葡 萄藻（Botryococcuse braunii)、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)、鹽生杜氏藻 (Dunaliela salina)、聚球藻的菌種PCC 7002、聚球藻的菌種PCC 7942、集胞藻屬的菌種 PCC 6803、長日籃熱藍(lán)藻（Thermosynechococcus elongates)BP-I、綠硫細(xì)菌（Chlorobium tepidum)、嗜熱光合綠曲菌（ChlorojIexus auranticus)、酒色著色菌（Chromatiumm vinos um)、深紅紅螺菌（Rhodospirill um rubrum)、芙膜紅細(xì)菌（Rhodobacter capsulatus)、沼澤紅假單胞菌（加 odopseudomonas palusris)、永達(dá)爾梭菌（Clostridium 1 jungdahlii )、熱纖梭菌（Clostridium thermocelIum)、產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)、畢赤酵母（Pichia pastoris)、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、焚光假單胞菌（Pseudomonas f Iuorescens)或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單 胞菌（Zymomonas mobiIis) D
[0120] 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，微生物細(xì)胞得自藍(lán)細(xì)菌，包括但不限于原綠球藻、聚球 藻、集胞藻屬、藍(lán)桿藻和念珠藻。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物細(xì)胞得自特定的藍(lán)細(xì)菌物種， 包括但不限于細(xì)長聚球藻PCC7942、集胞藻屬的菌種PCC6803和聚球藻的菌種PCC7001。
[0121 ]制備重組宿主細(xì)胞和培養(yǎng)物的方法
[0122] 本領(lǐng)域公知的多種方法可W用于改造宿主細(xì)胞，從而生產(chǎn)脂肪胺和/或脂肪胺組 合物或共纔物。所述的方法可^包括載體的用途，優(yōu)選為表達(dá)載體，包括編碼生物合成酶 (例如單獨(dú)的氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶，或者組合酸生成酶，例如CA巧日/或TE和/或AA巧日/或 PPTase)的核酸，如本文所述。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將理解的是多種病毒和非病毒載體可 W用于本文所述的方法中。
[0123] 在本發(fā)明公開的一些實(shí)施方案中，在特定組合物中的脂肪胺的較高的效價(jià)是由重 組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的特定類型的脂肪胺或脂肪胺的組合相對(duì)于由相應(yīng)的野生型宿主 細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物生產(chǎn)的相同的脂肪胺或脂肪胺的組合的效價(jià)而言更高的效價(jià)。在一些實(shí) 施方案中，生物合成多膚(例如單獨(dú)的氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氨酶，或者組合醒生成酶的多膚， 例如CAR和/或TE和/或AAR和/或PPTase)通過重組載體提供給宿主細(xì)胞，其中所述的重組載 體可W包括與特定的多核巧酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子，其中所述的特定的多核巧酸序 列編碼特定的生物合成多膚。在某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)節(jié)的、細(xì)胞器特異性的、 組織特異性的、可誘導(dǎo)型的、構(gòu)成型的或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。重組載體通常包含選自W下的 至少一個(gè)序列：與多核巧酸序列可操作地綴合的表達(dá)控制序列；與多核巧酸序列可操作地 綴合的選擇標(biāo)記;與多核巧酸序列可操作地綴合的標(biāo)記序列；與多核巧酸序列可操作地綴 合的純化部分;與多核巧酸序列可操作地綴合的分泌序列；W及與多核巧酸序列可操作地 綴合的祀向序列。多核巧酸序列可W整合至重組宿主細(xì)胞的染色體中，引入至停留在重組 宿主細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)中，或者上述二者，其中所述的多核巧酸序列包含 編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框和可操作地連接的調(diào)節(jié)序列。
[0124] 表達(dá)載體包括本文所述的適用于多核巧酸序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式的多核 巧酸序列。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解的是表達(dá)載體的設(shè)計(jì)取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主 細(xì)胞的選擇、所需多膚的表達(dá)水平等之類的因素。本文所述的表達(dá)載體可W被引入至宿主 細(xì)胞中，從而生產(chǎn)由本文所述的多核巧酸序列編碼的多膚，包括融合多膚。編碼多膚的基因 在原核生物(例如大腸桿菌）中的表達(dá)最通常地是使用包含構(gòu)成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體 實(shí)施的，其中所述的啟動(dòng)子指導(dǎo)了融合或非融合多膚的表達(dá)。用于原核和真核細(xì)胞的合適 的表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的（例如參見Sambrook et al., "Molecular Cloning = A Laboratory Manualsecond edition,Cold Spring Harbor Laboratory, (1989))。在某 些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的多核巧酸序列與由隧菌體T5衍生得到的啟動(dòng)子可操作地連 接。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。在運(yùn)種實(shí)施方案中，表達(dá)載體為酵母表達(dá)載 體。多種載體可W通過用于將外來核酸(例如DNA)引入至宿主細(xì)胞中的本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù) 引入至原核或真核細(xì)胞中。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可W在Sambrook等人(上 文)例如中找到。
[0125] 為了細(xì)菌細(xì)胞穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染，已知的是根據(jù)所使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化技術(shù)，僅一小 部分細(xì)胞將被吸收并復(fù)制表達(dá)載體。為了識(shí)別和選擇運(yùn)些轉(zhuǎn)化子，可W將編碼可選擇標(biāo)記 (例如抗生素抗性)的基因與目的基因一起引入至宿主細(xì)胞中?？蛇x擇標(biāo)記包括賦予藥品抗 性的那些，例如但不限于氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素。編碼可選擇標(biāo)記的核酸 可W在與編碼本文所述的多膚相同的載體上引入至宿主細(xì)胞中，或者可W在分開的載體上 引入。被引入的核酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可W通過在合適的選擇藥品存在下的生長來識(shí)別。 [01%]重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物和發(fā)酵
[0127]如本文所用，術(shù)語"發(fā)酵"廣義而言是指宿主細(xì)胞將有機(jī)材料轉(zhuǎn)化為目標(biāo)物質(zhì)，例 如通過在包括碳源的培養(yǎng)基中增殖重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，使重組宿主細(xì)胞將碳源轉(zhuǎn)化為 脂肪胺及其衍生物。如本文所用，術(shù)語"允許生產(chǎn)的條件"是指允許宿主細(xì)胞生產(chǎn)所需產(chǎn)物 (例如脂肪胺或脂肪胺組合物或共混物)的任何條件。類似地，術(shù)語"其中載體的多核巧酸被 表達(dá)的條件"是指允許宿主細(xì)胞合成多膚的任何條件。合適的條件包括例如發(fā)酵條件。發(fā)酵 條件可W包括許多參數(shù)，包括但不限于溫度范圍、通風(fēng)水平、供料速率和培養(yǎng)基組成。運(yùn)些 條件(單獨(dú)及組合)均允許宿主細(xì)胞生長。發(fā)酵可W是需氧的、厭氧的或它們的變體(例如微 需氧的）。示例性的培養(yǎng)物培養(yǎng)基包括培養(yǎng)液或凝膠。通常，培養(yǎng)基包括可W被宿主細(xì)胞直 接代謝的碳源。此外，培養(yǎng)基中可W使用酶，從而有利于碳源的動(dòng)員（例如淀粉或纖維素解 聚成可發(fā)酵的糖)和隨后的代謝。
[0128] 就小規(guī)模的生產(chǎn)而言，改造的宿主細(xì)胞可^^例如大約10化^20化^30化^40化 L、500化、1血、5血、1 OmL、15mL、25mL、50mL、75血、100血、500血、1L、2L、化或 1OL的批次生長； 發(fā)酵;并誘導(dǎo)表達(dá)所需的多核巧酸序列，例如單獨(dú)的編碼氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或 胺氧化酶多膚的多核巧酸序列，或者組合編碼CAR和/或TE和/或AAR和/或PPtase多膚的醒 生成多核巧酸序列。就大規(guī)模的生產(chǎn)而言，改造的宿主細(xì)胞可W W大約IOU 10化、IO(K)U 10，00化、100，000L、1，000，00化或更大體積的批次生產(chǎn);發(fā)酵;并誘導(dǎo)表達(dá)所需的多核巧酸 序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所述的脂肪胺和脂肪胺衍生物組合物可W在重組宿 主細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞外環(huán)境中找到，并且可W容易地從培養(yǎng)物培養(yǎng)基中分離。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，本文所述的脂肪胺和脂肪胺衍生物組合物可W在培養(yǎng)物中生長的重組宿主細(xì)胞 的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中找到。脂肪胺及其衍生物可W由重組宿主細(xì)胞分泌、運(yùn)送至細(xì)胞外環(huán)境中 或者主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞外環(huán)境中?？蒞使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法由 重組宿主細(xì)胞分離脂肪胺組合物。
[01巧]篩選重組宿主細(xì)胞
[0130] 在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施方案中，氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺氧化酶多 膚的活性是通過培養(yǎng)包含一種或多種氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺氧化酶多膚序列 (可任選地組合一種或多種醒生成多膚）的重組宿主細(xì)胞，然后篩選W識(shí)別由重組宿主細(xì)胞 生產(chǎn)的（例如)脂肪胺組合物的特征(例如脂肪胺及其組合物和共混物的效價(jià)、產(chǎn)率和生產(chǎn) 率)來確定的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺氧化酶多膚的活 性是通過培養(yǎng)包含一種或多種氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺氧化酶多核巧酸序列的 重組宿主細(xì)胞，然后篩選W識(shí)別由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的（例如）脂肪胺組合物的特征（例如 脂肪胺及其組合物和共混物的效價(jià)、產(chǎn)率和生產(chǎn)率)來確定的?？蒞使用本領(lǐng)域已知的常規(guī) 方法，針對(duì)氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺氧化酶多膚它們的片段在細(xì)胞中的活性和/ 或胺衍生的化合物的改進(jìn)/增加的生產(chǎn)來測試氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺氧化酶 多膚及它們的片段。例如在允許所述的多膚發(fā)揮功能并實(shí)施其酶活性的條件下，將氨基轉(zhuǎn) 移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺氧化酶多膚或它們的片段在體內(nèi)與底物接觸（例如通過CAR 和/或TE和/或AAR和/或PP化Se在細(xì)胞中共表達(dá)來生產(chǎn)脂肪醒）?？蒞測量底物水平的降低 或者脂肪胺或脂肪胺組合物水平的升高，從而確定氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺氧 化酶的活性。備選地，在仍允許所述的多膚發(fā)揮功能并實(shí)施其酶活性的條件下，向表達(dá)氨基 轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺氧化酶多膚或者它們的片段的細(xì)胞供入脂肪醒底物。然后， 測量脂肪胺或脂肪胺組合物的水平的升高，從而確定氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氨酶或胺 氧化酶的活性。
[0131] 由重組宿主細(xì)胞衍生的產(chǎn)物
[0132] 如本文所用，。現(xiàn)代碳級(jí)份"或fM具有與化tional Institute of Sl:andards and Technology(NIST)S化ndard Reference Materials(SRMs 4990B和4990C，其分別稱為草酸 標(biāo)準(zhǔn)品冊(cè)X巧日冊(cè)XlI)定義的相同的含義?；径x是指0.95乘W14C/12C同位素比冊(cè)Xl (參 見AD1950)。運(yùn)大致相當(dāng)于衰變校正過的工業(yè)革命前的木材。對(duì)于當(dāng)前的活生物圈（植物材 料），fM為大約1.1。
[0133] 包括生物學(xué)方法生產(chǎn)的有機(jī)化合物，特別是使用本文的生物合成途徑生產(chǎn)的脂肪 胺組合物的生物產(chǎn)物(例如根據(jù)本發(fā)明公開生產(chǎn)的脂肪胺組合物)是使用可再生來源生產(chǎn) 的，因此是新的物質(zhì)的組合物?；陔p重碳同位素指紋法（dual carbon-isotopic finge巧rinting)或1化定年法可W將運(yùn)些新的生物產(chǎn)物與衍生于石油化學(xué)碳的有機(jī)化合物 區(qū)別開。此外，可W通過雙重碳同位素指紋法(例如參見美國專利號(hào)7，169,588)來確定生物 來源碳的具體來源(例如葡萄糖與甘油等）。在商業(yè)中，區(qū)別生物產(chǎn)物與石油基有機(jī)化合物 的能力在追蹤運(yùn)些材料方面是有益的。例如，包括生物學(xué)基的和石油基的碳同位素譜二者 的有機(jī)化合物或化學(xué)品可W區(qū)別于僅由石油基材料制成的有機(jī)化合物和化學(xué)品。因此，在 商業(yè)中，可W基于本文生產(chǎn)的生物產(chǎn)物的獨(dú)特的碳同位素譜來追蹤或跟蹤它們。通過比較 各樣品中穩(wěn)定碳同位素比（UC/1 2C)，可W將生物產(chǎn)物與石油基有機(jī)化合物區(qū)分開。給定的 生物產(chǎn)物中Uc/i2C比是大氣二氧化碳中該二氧化碳被固定時(shí)的Uc/i 2C比的結(jié)果。它還反映 了準(zhǔn)確的代謝途徑。此外，還存在區(qū)域性差異。石油、C3植物（闊葉植物）、C4植物(草本植物） W及海洋碳酸鹽類在i3C/i2CW及相應(yīng)的Si3C值中全部表現(xiàn)出顯著差異。C4和C3植物都表現(xiàn) 出一定范圍的i 3C/i2C同位素比，但是對(duì)于C4植物而言，通常的值是大約-7至大約-13/密耳， 而對(duì)于C3植物而言，是大約-19至大約-27/密耳（例如參見Stuiver et al. ( 1977) Radiocarbon 19:355)。煤和石油通常落在后面的范圍內(nèi)。
[0134] 別3〔(〇/〇。）二[(13〔/120 樣品-(13〔/120 標(biāo)準(zhǔn)品]/(13C/12 口標(biāo)準(zhǔn)品 Xiooo
[0135] 已經(jīng)與IAEA、USGS、NIST和其它選定的國際同位素實(shí)驗(yàn)室合作開發(fā)了一系列備選 RM。與PDB的每單位密耳偏差的標(biāo)記為SI3Cd通過高精度的穩(wěn)定比率質(zhì)譜（IRMS)在質(zhì)量44、45 W及46的分子離子上對(duì)C〇2進(jìn)行測量。本發(fā)明所述的組合物包括脂肪胺組合物和通過本文 所述的任何方法生產(chǎn)的產(chǎn)物。具體而言，脂肪胺組合物或產(chǎn)物具有的Si 3C可W為大約-28或 更大、大約-27或更大、-20或更大、-18或更大、-15或更大、-13或更大、-10或更大或-8或更 大。例如脂肪胺組合物或產(chǎn)物具有的Si 3C可W為大約-30至大約-15、大約-27至大約-19、大 約-25至大約-21、大約-15至大約-5、大約-13至大約-7或大約-13至大約-10。在其它的情況 下，脂肪胺組合物和產(chǎn)物具有的81化可^為大約-10、-11、-12或-12.3。此外，還可^通過比 較每種化合物中1化的量，將根據(jù)本發(fā)明公開所生產(chǎn)的脂肪胺組合物和產(chǎn)物區(qū)別于石油基有 機(jī)化合物。因?yàn)?化具有5730年的核半衰期，所W包括"較老的"碳的石油基燃料可W區(qū)別于 包括"較新的"碳的脂肪胺組合物和生物產(chǎn)物（參見例如Currie ,"Source Apportionment of Atmospheric Particles"，Characterization of Environmental Particles, J.Buffle and H.P.van Leeuwen，Eds .，Iof Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series(Lewis Publishers, Inc.)3-74,(1992))〇
[0136] 放射性碳定年法的基本假設(shè)是大氣中1化濃度的恒定性導(dǎo)致活有機(jī)體中1化的恒定 性。然而，由于1950年W來的大氣核試驗(yàn)W及1850年W來的化石燃料的燃燒，1化已經(jīng)獲得了 次要的地球化學(xué)時(shí)間特征（geochemical time characteristic)。1化在大氣C〇2中W及由此 在活生物圈中的濃度在20世紀(jì)60年代中期核試驗(yàn)的高峰時(shí)幾乎翻倍。此后，其逐漸地返回 至大約1.2x10-12的穩(wěn)態(tài)宇宙發(fā)生（大氣)基線同位素率(1化/1化），并且大致的馳豫"半衰 期"（relaxation "half-life")為7至10年。后者所述的運(yùn)種半衰期不必按照字面理解;而是 必須使用詳細(xì)的大氣核輸入/衰變函數(shù)來追蹤核時(shí)代開始W來的大氣和生物圈1化的變化。 后者所述的運(yùn)種生物圈1化時(shí)間特征支持每年定年法測定近代生物圈的碳的承諾?？蒞通過 加速器質(zhì)譜(AMS)測量1也結(jié)果現(xiàn)代碳的比例"（fM)的單位給出。本文所述的脂肪胺組合 物和產(chǎn)物包括可WfM 1化為至少大約1的生物產(chǎn)物。例如本發(fā)明公開的生物產(chǎn)物可W具有至 少大約1.01的fM 1化、大約1至大約1.5的fM i4C、大約1.04至大約1.18的fM i4C、或者大約 1.111 至大約 1.124 的 fM 14c。
[0137] 已知1化的另一種量度為現(xiàn)代碳的百分率(pMC)。對(duì)于使用1化年代的考古學(xué)家或地 質(zhì)學(xué)家而言，AD 1950等于"舊的零年"。其還表示l(K)pMC。在1963年熱核武器的頂峰時(shí)，大氣 中的"炸彈碳"達(dá)到正常水平的幾乎兩倍。其在大氣中的分布自其出現(xiàn)W來是近似的，對(duì)于 自從AD 1950生活的植物和動(dòng)物表現(xiàn)出大于10化MC的值。隨著時(shí)間的流逝，該值逐漸降低， 當(dāng)今的值接近107.5pMC。運(yùn)意味著諸如玉米之類的新生物質(zhì)材料將給出接近107.5pMC的1化 標(biāo)記。石油基化合物將具有為零的pMC值?；寂c現(xiàn)代碳的組合導(dǎo)致現(xiàn)代pMC含量被稀釋。 通過假定107.5pMC代表現(xiàn)代生物質(zhì)材料的1化含量并且化MC代表石油基產(chǎn)物的1化含量，貝U 該材料的測量PMC值將反映兩種類型的成分的比例。例如100%來源于現(xiàn)代大豆的材料將給 出接近107.5pMC的放射性碳標(biāo)記。如果使用石油基產(chǎn)物將該材料稀釋50%，則它將給出約 54pMC的放射性碳標(biāo)記。通過指定"100%"等于107.5pMC并且指定為"0%"等于化MC而衍生 得到基于生物學(xué)的碳含量。例如測量為99pMC的樣品將給出93%的等同的生物學(xué)基的碳含 量。該值被稱為基于生物學(xué)的平均碳結(jié)果并且假定在所分析的材料中的所有成分均起源于 現(xiàn)代的生物材料或石油基材料。包括本文所述的一種或多種脂肪胺的生物產(chǎn)物可W具有至 少大約50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100的9]\?：。在其它的情況下，本文所述的 脂肪醋可W具有大約50至大約100、大約60至大約100、大約70至大約100、大約80至大約 100、大約85至大約100、大約87至大約98、或者大約90至大約95的pMC。在其它的情況下，本 文所述的脂肪胺組合物可W具有大約90、91、92、93、94或94.2的口1(：。
[0138] 脂肪胺組合物
[0139] 脂肪胺的結(jié)構(gòu)是基于一個(gè)或多個(gè)C8至C24脂肪族烷基基團(tuán)（R = C8-C24)，W及一個(gè) 或多個(gè)胺(N)或季錠。脂肪族烷基鏈?zhǔn)菑?qiáng)烈疏水性的，而胺是親水性的。因此，脂肪胺作為一 個(gè)分子(包含疏水性實(shí)體和親水性實(shí)體)具有兩性本性。當(dāng)脂肪胺溶解于水或其他溶劑中 時(shí)，由于分子的一部分被溶劑排斥，所W脂肪胺形成微團(tuán)。如此，脂肪胺是陽離子表面活性 化合物（即，通過化合物的親水性部分表征的表面活性劑），其通過物理鍵或化學(xué)鍵強(qiáng)烈地 附著在表面上，由此修飾表面性質(zhì)。脂肪胺的表面活性為乳化、潤濕、起泡和增稠。此外，月旨 肪胺具有吸附性，包括軟化、附著、潤滑、腐蝕抑制、抗靜電性和疏水作用；W及反應(yīng)性，包括 離子交換、脫色和絮凝作用。
[0140] 本發(fā)明公開考慮了用于許多工業(yè)應(yīng)用（包括作為化學(xué)中間體、處理助劑W及許多 配制物中的功能成分）的脂肪胺及其衍生物的生產(chǎn)。脂肪胺的實(shí)例包括在所述的宿主細(xì)胞 中生產(chǎn)的W及由本文所述的脂肪醒前體中衍生的那些。本文生產(chǎn)的脂肪胺和/或脂肪胺組 合物或共混物可W單獨(dú)使用，或者在合適的組合或共混物中使用。本發(fā)明公開的脂肪胺在 工業(yè)應(yīng)用中具有用途，包括但不限于去污劑(清潔劑、增稠劑、纖維軟化劑）；洗碟劑;發(fā)泡劑 和潤濕劑;破乳劑(藥物、紙、石油）；乳化劑(溶劑、溶劑清潔劑、娃樹脂、油、蠟光劑、皮革處 理、甘油=醋）；表面活性劑;洗發(fā)劑和護(hù)發(fā)素;在織物和塑料工業(yè)(織物、聚合物、電子器件、 靜電噴涂、紙）中的抗靜電劑;燃料添加劑；潤滑劑和潤滑添加劑(滑脂增稠劑、機(jī)油）；涂料 增稠劑;礦物處理;紙的制造;石油的生產(chǎn)和精煉(石油添加劑、油田化學(xué)品）；漸青乳化劑； 腐蝕抑制劑(酸、水處理、金屬加工、石油）；汽油和燃油添加劑;浮選劑;環(huán)氧樹脂固化劑；W 及農(nóng)業(yè)化學(xué)品和殺蟲劑。在一些方面中，本發(fā)明公開設(shè)及生產(chǎn)包含脂肪胺的脂肪胺組合物 的方法，其中所述的脂肪胺是由碳鏈的混合物或者范圍為大約C8至大約C24的特定鏈長制 成的。在一個(gè)特定的方面中，本發(fā)明公開設(shè)及生產(chǎn)脂肪胺組合物的方法，其中所述的脂肪胺 組合物包含脂肪伯胺(RN出）。在另一個(gè)方面中，還考慮了脂肪仲胺化NH)和/或脂肪叔胺(S 烷基(R3N)、二烷基甲基(RsNC出），和/或烷基二甲基(RN(C出)2))。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明公 開涵蓋了伯胺的生產(chǎn)，其中所述的伯胺可W成為用于工業(yè)產(chǎn)品的一級(jí)構(gòu)件，并且提供用于 多種化學(xué)衍生物(例如多胺、乙氧化胺、乙氧化二胺、丙氧化胺、胺鹽、胺的氧化物、酷胺、乙 氧化酷胺和臘)的來源材料。在相關(guān)的方面中，所述的方法包括適用于制備脂肪胺和脂肪胺 組合物的遺傳改造的生產(chǎn)宿主，其中所述的脂肪胺和脂肪胺組合物包括但不限于適用于生 產(chǎn)化學(xué)衍生物及其組合物的伯胺，包括但不限于多胺、乙氧化胺、乙氧化二胺、丙氧化胺、胺 鹽、胺的氧化物、酷胺、乙氧化酷胺和臘。
[0141] 通常，本發(fā)明公開的脂肪胺或脂肪胺組合物由宿主細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中分離得 到。在一些實(shí)施方案中，脂肪胺或脂肪胺組合物是由宿主細(xì)胞部分或全部自發(fā)分泌的。在備 選的實(shí)施方案中，脂肪胺或脂肪胺組合物可任選地在一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的幫助下被轉(zhuǎn)運(yùn) 至細(xì)胞外環(huán)境中。在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺或脂肪胺組合物被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外環(huán)境中。
[0142] 所述的方法可W生產(chǎn)脂肪胺，包括C8-C24脂肪胺。在一些實(shí)施方案中，脂肪胺包括 08、〔9、(：10、(：11、(：12、(：13、(：14、(：15、(：16、(：17、(：18、(：19、〔20、〔21、〔22、〔23和/或〔24脂肪胺。 在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺組合物包括C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、 C17和C18脂肪胺中的一種或多種。在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺組合物包括C12、C14、C16和 C18脂肪胺;C12、C14和C16脂肪胺;C14、C16和C18脂肪胺;或者C12和C14脂肪胺。脂肪胺的R 基團(tuán)可W是直鏈或支鏈的。支鏈可W具有多于一個(gè)分支點(diǎn)，并且可W包括環(huán)狀分支。在一些 實(shí)施方案中，支化的脂肪胺為C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、 020、〔21^22、〔23或〔24支化的脂肪胺。支化的或非支化的脂肪胺的1?基團(tuán)可^是飽和的或 不飽和的。如果是不飽和的，貝化基團(tuán)可W具有一個(gè)或多于一個(gè)的不飽和點(diǎn)。在一些實(shí)施方 案中，不飽和的脂肪胺為單不飽和脂肪胺。在某些實(shí)施方案中，不飽和脂肪胺為C6:1、C7:1、 C8:1、C9: UClO: UCll :1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20:1、 C21:1、C22:1、C23 :1或C24:1不飽和脂肪胺。在某些實(shí)施方案中，不飽和脂肪胺為ClO : 1、 C12:1、C14:1、C16:1或C18:1不飽和脂肪胺。在其他的實(shí)施方案中，不飽和脂肪胺為在CO -7 位置處不飽和的。在某些實(shí)施方案中，不飽和脂肪胺具有Cis雙鍵。
[0143] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪胺為伯胺，包括但不限于辛基胺、癸基胺、十二燒 基胺、十四烷基胺、十六烷基胺、十八烷基胺、硬脂酷胺和油基胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，月旨 肪胺為仲胺，例如1-十二燒胺（月桂基胺）、1-十六烷基胺(棟桐酷基胺）、1-十八烷基胺(硬 脂酷胺)等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪胺為叔胺，例如1-十八締-9-基胺（油基胺)等。脂肪 胺的其他實(shí)例為烷基二甲基胺，包括但不限于辛基二甲基胺、癸基二甲基胺、十二烷基二甲 基胺、十四烷基二甲基胺、十六烷基二甲基胺、十八烷基二甲基胺和油基二甲基胺。脂肪胺 的其他實(shí)例為二烷基甲基胺，包括但不限于二辛基甲基胺、二癸基甲基胺、二(十二烷基）甲 基胺、二（十四烷基）甲基胺、二（十六烷基）甲基胺、和二(十八烷基）甲基胺。本發(fā)明公開進(jìn) 一步考慮了通過本文所述的重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪胺，該脂肪胺可用于化學(xué)衍生物，例 如脂肪酷胺（例如硬脂酷胺、油酷胺、芥酸酷胺）；季錠鹽（例如四甲基氯化錠、四甲基漠化 錠、四乙基漠化錠、四丙基漠化錠）；和乙氧基化物(例如月桂基胺、硬脂酷胺、油基胺、十八 烷基胺）。
[0144] 在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺包括直鏈脂肪胺。在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺包括 支鏈脂肪胺。在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺包括環(huán)狀部分。在一些實(shí)施方案中，脂肪胺為不 飽和脂肪胺。在其他的實(shí)施方案中，脂肪胺為但不飽和脂肪胺。在其他的實(shí)施方案中，脂肪 胺為飽和脂肪胺。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明公開的特征在通過任一種所述的方法或任一種 本文所述的微生物有機(jī)體生產(chǎn)的脂肪胺，或者表面活性劑，其包含由任一種所述的方法或 任一種本文所述的微生物有機(jī)體生產(chǎn)的脂肪胺。在一些實(shí)施方案中，脂肪胺具有的Si 3C為大 約-15.4或更高。在某些實(shí)施方案中，脂肪胺具有的Si3C為大約-15.4至大約-10.9,或大約-13.92至大約-13.84。在一些實(shí)施方案中，脂肪胺具有的fM^C為至少大約1.003。在某些實(shí)施 方案中，脂肪胺具有的fM^C為至少大約1. Ol，或者至少大約1.5。在一些實(shí)施方案中，脂肪胺 具有的fM^C為大約1.111至大約1.124。 實(shí)施例
[0145] W下具體的實(shí)施例意圖說明本發(fā)明公開，并且不應(yīng)該解釋為限定權(quán)利要求書的范 圍。
[0146] 實(shí)施例1:
[0147] 通過硫醋酶（'tesA)和簇酸還原酶(CarB)與腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶(ygjG)共表達(dá)，并補(bǔ) 充氮源(谷氨酸鹽），在體內(nèi)生成脂肪醒前體和相應(yīng)的脂肪胺。將脂肪醒前體轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的 胺。
[0148] 使用W下引物，通過PCR由大腸桿菌MG1655菌株克隆ygjG基因：
[0149] 正向引物：
[01 加]' 5-AGGAGGAATAACATATGAACAGGTTACCTTCGAGCGCATCGGC-3 '
[0151] 反向引物：
[0152] ' 5-CCCAAGCTTCGAATTCTTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCATGGCC-3 '
[0153] 然后，將ygjG基因連接至表達(dá)載體pACYC(即，高拷貝表達(dá)載體）中，從而生成質(zhì)粒 pACYC-ygjG。生成第二質(zhì)粒，并命名為pCL1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05(即，低拷貝質(zhì)粒）， 其包含恥垢分枝桿菌Ca巧基因和得自大腸桿菌的硫醋酶基因（'tesA)的變體。將巧巾質(zhì)粒共 轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌株中，該菌株不生產(chǎn)脂肪胺化VD2.1，包含得自大腸桿菌MG1655菌株的A fa祀A tonA fabB-A329V PT5-entD)，從而得到菌株F16-YG。還使用分別用作對(duì)照的各種質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，得到對(duì)照菌株F16(p化1920-CarB-18-cTesA2-13C05)和對(duì)照菌株YG (pACYC-ygjG)。
[0154] 在32°C下，使細(xì)胞在補(bǔ)充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis- tris，pH 7.0的M9基本培養(yǎng)基中生長，并使用ImM異丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧（IPTG) 在ODsoo~1.0誘導(dǎo)。（IPTG引發(fā)Iac操縱子轉(zhuǎn)錄，并在所述的基因處于Iac操縱子控制下的情 況下用于誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。）在誘導(dǎo)時(shí)，還加入5g/L k谷氨酸鹽作為氮源。使包含pACYC-ygjG的菌株在抗生素簇節(jié)青霉素存在下生長，并使包含P化1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05的 菌株在奇霉素存在下生長，從而選擇各自得質(zhì)粒。在過夜生長后，向3種菌株的培養(yǎng)物補(bǔ)充 另外的lOg/L葡萄糖和5g/L心谷氨酸鹽。在誘導(dǎo)后的24小時(shí)，將ImL培養(yǎng)物的等分物冷凍。
[0155] 為了制備用于分析的樣品，將0.5mL乙酸乙醋加入至各培養(yǎng)物的等分物中。然后將 樣品在最大速度下滿流處理15分鐘，并離屯、5分鐘。使用Gas Chromatograph Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法:燒控I無分流CTC)下分析有 機(jī)相。其中yg jG、a巧和' tesA被外源表達(dá)的F16-YG菌株在7.6分鐘時(shí)形成獨(dú)特的峰（圖1中間 面板），該峰在YG或F16的陰性對(duì)照中未觀察到（圖1頂部和底部面板）。通過NIST 05化學(xué)化 合物文庫識(shí)別由F16-YG培養(yǎng)物得到的樣品中在7.6分鐘時(shí)的獨(dú)特的峰為1-十二燒胺。購自 Sigma/Al化ich的分析參照標(biāo)準(zhǔn)品（P;roduct#325163)與F16-YG樣品連續(xù)2次運(yùn)行，通過其停 留時(shí)間（圖2)和其離子碎片圖案（圖3)證明所述的化合物的特征為1-十二燒胺，其中所述的 離子碎片圖案顯示在m/z = 142,156和170,和分子離子為185下的特征碎片。
[0156] 實(shí)施例2:
[0157] 通過酷基-ACP還原酶(AAR)與腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶(ygjG)共表達(dá)，并補(bǔ)充氮源(谷氨酸 鹽），可W在體內(nèi)生成脂肪醒前體和相應(yīng)的脂肪胺。將脂肪醒前體轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的胺。
[0158] 使用W下引物，通過PCR由大腸桿菌MG1655菌株克隆ygjG基因：
[0159] 正向引物：
[0160] ' 5-AGGAGGAATAACATATGAACAGGTTACCTTCGAGCGCATCGGC-3 '
[0161] 反向引物：
[0162] ' 5-CCCAAGCTTCGAATTCTTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCATGGCC-3 '
[0163] 然后，可W將ygjG基因連接至表達(dá)載體pACYC中，從而生成質(zhì)粒pACYC-ygjG。生成 第二質(zhì)粒，并命名為P化1920-aar，其為包含得自細(xì)長聚球藻PCC7942(aar)的AAR基因的pCL 基的質(zhì)粒。將巧巾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌株中，該菌株不生產(chǎn)脂肪胺(上文），從而得到菌 株F17-YG。還使用分別用作對(duì)照的各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，得到對(duì)照菌株F17(pCL1920-aar)和對(duì)照菌株YG(pACYC-ygjG)。
[0164] 在 32°C 下，使細(xì)胞在補(bǔ)充 3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0NX-100,0.1Mbis-tris，pH 7.0的M9基本培養(yǎng)基中生長，并使用ImM異丙基0-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧（IPTG) 在ODs日日~1.0誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，還加入5g/L k谷氨酸鹽作為氮源。使包含pACYC-ygjG的菌株 在抗生素簇節(jié)青霉素(0.05mg/mL)存在下生長，并使包含pCL1920-aar的菌株在O.lmg/mL奇 霉素存在下生長，從而選擇各自質(zhì)粒。在過夜生長后，向巧巾菌株的培養(yǎng)物補(bǔ)充另外的lOg/L 葡萄糖和5g/L心谷氨酸鹽。在誘導(dǎo)后的24小時(shí)，可W將ImL培養(yǎng)物的等分物冷凍。
[0165] 為了制備用于分析的樣品，可W將0.5mL乙酸乙醋加入至各培養(yǎng)物的等分物中。然 后可W將樣品在最大速度下滿流處理大約15分鐘，并根據(jù)需要離屯、大約5分鐘?？蒞使用 Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法： 燒控1無分流CTC)下分析有機(jī)相。預(yù)計(jì)其中ygjG和aar被外源表達(dá)的F17-YG菌株產(chǎn)生一個(gè)或 多個(gè)獨(dú)特的峰，運(yùn)些峰代表了類似于實(shí)施例1中觀察到的脂肪胺(上文），并且運(yùn)些峰在YG或 F17的陰性對(duì)照中未觀察到?？蒞通過NIST 05化學(xué)化合物文庫識(shí)別由F17-YG培養(yǎng)物得到的 樣品中任何獨(dú)特的峰為1-十二燒胺。為了比較，可W將購自Sigma/Al化ich的分析參照標(biāo)準(zhǔn) 品（Product#325163)與F17-YG樣品連續(xù)2次運(yùn)行，從而通過停留時(shí)間和離子碎片圖案證明 所生產(chǎn)的化合物。
[0166] 實(shí)施例3:
[0167] 通過硫醋酶(TesA)和簇酸還原酶(化巧)與GABA氨基轉(zhuǎn)移酶(PimE)共表達(dá)，并補(bǔ)充 氮源(谷氨酸鹽），可W在體內(nèi)生成脂肪醒前體和相應(yīng)的脂肪胺。脂肪醒前體可W轉(zhuǎn)化成相 應(yīng)的胺?？蒞使用合適的正向引物和反向引物，通過PCR由大腸桿菌菌株克隆PimE基因（類 似于實(shí)施例1和2中的教導(dǎo)，上文）。然后，可W將PimE基因連接至表達(dá)載體（例如pACYC，上 文）中，從而生成質(zhì)粒pACYC-puuE。生成第二質(zhì)粒，并命名為P化1920-CarB-18-cTesA2-13C05，其為包含恥垢分枝桿菌Ca巧基因和得自大腸桿菌的硫醋酶基因（' tesA)的變體的第 二表達(dá)載體(參見實(shí)施例1，上文）。可W將巧巾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌株中，該菌株不生產(chǎn) 脂肪胺(上文），從而得到菌株F18-YG。還可W使用分別用作對(duì)照的各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞， 得到對(duì)照菌株F18(p 化 1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05)和對(duì)照菌株P(guān)U(pACYC-pimE)。
[016引在32°C下，可W使細(xì)胞在補(bǔ)充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis-化is,pH 7.0的M9基本培養(yǎng)基中生長，并使用ImM異丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧 (IPTG)在ODsgg~1.0誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，還可W加入5g/L k谷氨酸鹽作為氮源?？蒞使包含 pACYC-puuE的菌株在抗生素簇節(jié)青霉素 (0.05mg/mL)存在下生長，并可W使包含P化1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05的菌株在O.lmg/mL奇霉素存在下生長，從而選擇各自質(zhì)粒。在過夜 生長后，可W向巧巾菌株的培養(yǎng)物補(bǔ)充另外的lOg/L葡萄糖和5g/L心谷氨酸鹽。在誘導(dǎo)后的 24小時(shí)，可W將ImL培養(yǎng)物的等分物冷凍。
[0169] 為了制備用于分析的樣品，可W將0.5mL乙酸乙醋加入至各培養(yǎng)物的等分物中。然 后可W將樣品在最大速度下滿流處理大約15分鐘，并根據(jù)需要離屯、5分鐘?？蒞使用Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法：燒控 1 無分流CTC)下分析有機(jī)相。預(yù)計(jì)其中PimE，Ca巧和/或' tesA被外源表達(dá)的F18-PU菌株產(chǎn)生 一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的峰，運(yùn)些峰在PU或F18的陰性對(duì)照中未觀察到?？蒞通過NIST 05化學(xué)化 合物文庫識(shí)別由F18-PU培養(yǎng)物得到的樣品中所預(yù)計(jì)的獨(dú)特的峰?？蒞將購自Sigma/ Aldrich的分析參照標(biāo)準(zhǔn)品（P;roduct#325163)與F18-PU樣品連續(xù)2次運(yùn)行，從而證明新型脂 肪胺化合物的特性。
[0170] 實(shí)施例4:
[0171] 通過AAR與GABA氨基轉(zhuǎn)移酶(PimE)共表達(dá)，并補(bǔ)充氮源(谷氨酸鹽），可W在體內(nèi)生 成脂肪醒前體和相應(yīng)的脂肪胺。脂肪醒前體可W轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的胺。
[0172] 可W使用合適的正向引物和反向引物，通過PCR由大腸桿菌菌株克隆PimE基因（類 似于實(shí)施例1中的教導(dǎo)，上文）?？蒞將PimE基因連接至表達(dá)載體(例如pACYC，上文）中，從而 生成質(zhì)粒pACYC-pimE?？蒞生成第二質(zhì)粒，并命名為P化1920-aar，其為包含由細(xì)長聚球藻 PCC7942(aar)得到的AAR基因的另一種表達(dá)載體。可W將巧巾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌株 中，該菌株不生產(chǎn)脂肪胺(上文），從而得到菌株F19-PU。還可W使用分別用作對(duì)照的各種質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，得到對(duì)照菌株F19(p化1920-aar)和對(duì)照菌株P(guān)U(pACYC-pimE)。
[0173] 在32°C下，可W使細(xì)胞在補(bǔ)充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis-化is,pH 7.0的M9基本培養(yǎng)基中生長，并使用ImM異丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧 (IPTG)在ODsgg~1.0誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，還可W加入5g/L k谷氨酸鹽作為氮源?？蒞使包含 pACYC-puuE的菌株在抗生素簇節(jié)青霉素 (0.05mg/mL)存在下生長，并可W使包含P化1920-aar的菌株在O.lmg/mL奇霉素存在下生長，從而選擇各種質(zhì)粒。在過夜生長后，可W向巧中菌 株的培養(yǎng)物補(bǔ)充另外的lOg/L葡萄糖和5g/L心谷氨酸鹽。在誘導(dǎo)后的24小時(shí)，可W將ImL培 養(yǎng)物的等分物冷凍。
[0174] 為了制備用于分析的樣品，可W將0.5mL乙酸乙醋加入至各培養(yǎng)物的等分物中。然 后可W將樣品在最大速度下滿流處理大約15分鐘，并根據(jù)需要離屯、大約5分鐘。可W使用 Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法： 燒控1無分流CTC)下分析有機(jī)相。預(yù)計(jì)其中PimE和/或aar被外源表達(dá)的F19-PU菌株產(chǎn)生一 個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的峰，運(yùn)些峰在PU或F19的陰性對(duì)照中未觀察到。可W通過NIST 05化學(xué)化合 物文庫識(shí)別由F19-PU培養(yǎng)物得到的樣品中所預(yù)計(jì)的獨(dú)特的峰?？蒞將購自Sigma/Al化ich 的分析參照標(biāo)準(zhǔn)品（Product#325163)與F19-PU樣品連續(xù)2次運(yùn)行，從而證明新型脂肪胺化 合物的特性。
[0175] 實(shí)施例5:
[0176] 通過硫醋酶(TesA)和簇酸還原酶(CarB)與胺脫氨酶(例如脫氮副球菌的甲基胺脫 氨酶或假單胞菌屬菌種的quinohemo蛋白質(zhì)胺脫氨酶)共表達(dá)，并補(bǔ)充氮源(氨），可W在體 內(nèi)生成脂肪醒前體和相應(yīng)的脂肪胺。脂肪醒前體可W轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的胺。
[0177] 可W使用合適的正向引物和反向引物，通過PCR克隆由脫氮副球菌或假單胞菌屬 的菌種得到的胺脫氨酶(AD)基因（類似于實(shí)施例1中的教導(dǎo)，上文）。然后，可W將AD基因連 接至表達(dá)載體(例如pACYC，上文）中，從而生成質(zhì)粒pACYC-AD。可W生成第二質(zhì)粒，并命名為 P化1920-化巧-18-cTesA2-13C05,其為包含恥垢分枝桿菌Ca巧基因和得自大腸桿菌的硫醋 酶基因（'tesA)的變體的另一種表達(dá)載體(參見實(shí)施例1，上文）?？蒞將巧巾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至大 腸桿菌菌株中，該菌株不生產(chǎn)脂肪胺(上文），從而得到菌株F20-AD。還可W使用分別用作對(duì) 照的各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，得到對(duì)照菌株F20(pCL1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05)和對(duì)照 菌株 AD(pACYC-AD)。
[0178] 在32°C下，可W使細(xì)胞在補(bǔ)充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis-化is,pH 7.0的M9基本培養(yǎng)基中生長，并使用ImM異丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧 (IPTG)在ODsqq~1.0誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，還可W加入大約0.5-lg/L氨作為氮源?？蒞使包含 pACYC-AD的菌株在抗生素簇節(jié)青霉素（0.05mg/mL)存在下生長，并可W使包含P化1920-Ca巧-18-cTesA2-13C05的菌株在O.lmg/mL奇霉素存在下生長，從而選擇各自質(zhì)粒。在過夜 生長后，可W向巧巾菌株的培養(yǎng)物補(bǔ)充另外的lOg/L葡萄糖和大約0.5-lg/L氨。在誘導(dǎo)后的 24小時(shí)，可W將ImL培養(yǎng)物的等分物冷凍。
[0179] 為了制備用于分析的樣品，可W將0.5mL乙酸乙醋加入至各培養(yǎng)物的等分物中。然 后可W將樣品在最大速度下滿流處理大約15分鐘，并根據(jù)需要離屯、5分鐘?？蒞使用Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法：燒控 1 無分流CTC)下分析有機(jī)相。預(yù)計(jì)其中AD，ca巧和/或'tesA被外源表達(dá)的F20-AD菌株產(chǎn)生一 個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的峰，運(yùn)些峰在PU或F20的陰性對(duì)照中未觀察到?？蒞通過NIST 05化學(xué)化合 物文庫識(shí)別由F20-AD培養(yǎng)物得到的樣品中所預(yù)計(jì)的獨(dú)特的峰。可W將購自Sigma/Al化ich 的分析參照標(biāo)準(zhǔn)品（Product#325163)與F20-AD樣品連續(xù)2次運(yùn)行，從而證明新型脂肪胺化 合物的特性。
[0180] 實(shí)施例6:
[0181] 通過AAR與胺脫氨酶（例如脫氮副球菌的甲基胺脫氨酶或假單胞菌屬菌種的 quinohemo蛋白質(zhì)胺脫氨酶)共表達(dá)，并補(bǔ)充氮源(氨），可W在體內(nèi)生成脂肪醒前體和相應(yīng) 的脂肪胺。脂肪醒前體可W轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的胺。
[0182] 可W使用合適的正向引物和反向引物，通過PCR由大腸桿菌菌株克隆胺脫氨酶 (AD)基因（類似于實(shí)施例1中的教導(dǎo)，上文）。可W將AD基因連接至表達(dá)載體(例如pACYC，上 文）中，從而生成質(zhì)粒pACYC-AD?？蒞生成第二質(zhì)粒，并命名為pCL1920-aar，其為包含由細(xì) 長聚球藻P(X7942(aar)得到的AAR基因的另一種載體?？蒞將2種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌 株中，該菌株不生產(chǎn)脂肪胺(上文），從而得到菌株F21-AD。還可W使用分別用作對(duì)照的各種 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，得到對(duì)照菌株F21(p化1920-aar)和對(duì)照菌株AD(pACYC-AD)。
[0183] 在32°C下，可W使細(xì)胞在補(bǔ)充3%(w/v)葡萄糖，0.5%(v/v)TRIT0N X-100,0.1M bis-化is,pH 7.0的M9基本培養(yǎng)基中生長，并使用ImM異丙基e-D-1-硫代半乳糖化喃糖巧 (IPTG)在ODsqq~1.0誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，還可W加入大約0.5-lg/L氨作為氮源。可W使包含 pACYC-AD的菌株在抗生素簇節(jié)青霉素 (0.05mg/mL)存在下生長，并可W使包含pCL1920-aar 的菌株在O.lmg/mL奇霉素存在下生長，從而選擇各自質(zhì)粒。在過夜生長后，可W向3種菌株 的培養(yǎng)物補(bǔ)充另外的lOg/L葡萄糖和大約0.5-lg/L氨。在誘導(dǎo)后的24小時(shí)，可W將ImL培養(yǎng) 物的等分物冷凍。
[0184] 為了制備用于分析的樣品，可W將0.5mL乙酸乙醋加入至各培養(yǎng)物的等分物中。然 后可W將樣品在最大速度下滿流處理大約15分鐘，并根據(jù)需要離屯、大約5分鐘?？蒞使用 Gas Qiromatogra地 Mass Spectrometry(得自Agilent 6890的GCMS)在EI模式（即，方法： 燒控1無分流CTC)下分析有機(jī)相。預(yù)計(jì)其中AD和/或aar被外源表達(dá)的F21-AD菌株產(chǎn)生一個(gè) 或多個(gè)獨(dú)特的峰，運(yùn)些峰在AD或F21的陰性對(duì)照中未觀察到?？蒞通過NIST 05化學(xué)化合物 文庫識(shí)別由F21-AD培養(yǎng)物得到的樣品中所預(yù)計(jì)的獨(dú)特的峰?？蒞將購自Sigma/Aldrich的 分析參照標(biāo)準(zhǔn)品（Product#325163)與F21-AD樣品連續(xù)2次運(yùn)行，從而證明新型脂肪胺化合 物的特性。
[0185] 對(duì)于本領(lǐng)域的任一技術(shù)人員顯而易見的是，在不脫離本發(fā)明公開的精神和范圍的 條件下可W對(duì)上述方面和實(shí)施方案進(jìn)行多處修改和改變。此類修改和改變均在本發(fā)明公開 的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于脂肪胺生產(chǎn)的重組微生物有機(jī)體，其包含用于將脂肪醛轉(zhuǎn)化成脂肪胺的改 造的代謝途徑，其中所述的代謝途徑包含具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氫酶活性的外源生物合成 酶，并且其中所述的微生物有機(jī)體在體內(nèi)生產(chǎn)所述的脂肪胺。2. 權(quán)利要求1所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的脂肪胺被所述的微生物有機(jī)體釋 放至培養(yǎng)物培養(yǎng)基中。3. 權(quán)利要求1所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的外源生物合成酶為腐胺或GABA氨 基轉(zhuǎn)移酶。4. 權(quán)利要求3所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶為YgjG。5. 權(quán)利要求4所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的YgjG是由在所述的微生物有機(jī)體 中表達(dá)的編碼ygjG基因的核酸序列所編碼。6. 權(quán)利要求3所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的GABA氨基轉(zhuǎn)移酶為PuuE。7. 權(quán)利要求6所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的PuuE是由在所述的微生物有機(jī)體 中表達(dá)的編碼puuE基因的核酸序列所編碼。8. 權(quán)利要求1所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的外源生物合成酶為胺脫氫酶。9. 權(quán)利要求8所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的胺脫氫酶為脫氮副球菌的甲基胺 脫氫酶。10. 權(quán)利要求1所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的重組微生物有機(jī)體進(jìn)一步包含用 于將酰基-ACP或?；?CoA轉(zhuǎn)化成脂肪酸的另一種改造的代謝途徑。11. 權(quán)利要求10所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的?；?ACP或所述的?；?CoA通 過具有硫酯酶活性的生物合成酶而轉(zhuǎn)化成脂肪酸。12. 權(quán)利要求11所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的具有硫酯酶活性的生物合成酶 是由在所述的微生物有機(jī)體中表達(dá)的編碼tesA基因的核酸序列所編碼。13. 權(quán)利要求1所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的重組微生物有機(jī)體進(jìn)一步包含用 于將脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醛的另一種改造的代謝途徑。14. 權(quán)利要求13所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的脂肪酸通過具有羧酸還原酶 (CAR)活性的生物合成酶而轉(zhuǎn)化成脂肪醛。15. 權(quán)利要求14所述的重組微生物有機(jī)體，其中具有CAR活性的生物合成酶是由在所述 的微生物有機(jī)體中表達(dá)的編碼carB基因的核酸序列所編碼。16. 權(quán)利要求1所述的重組微生物有機(jī)體，其中所述的重組微生物有機(jī)體為重組微生物 細(xì)胞。17. 權(quán)利要求16所述的重組微生物細(xì)胞，其中所述的重組微生物細(xì)胞為重組細(xì)菌細(xì)胞。18. 權(quán)利要求16所述的重組微生物細(xì)胞，其中所述的重組微生物細(xì)胞選自埃希氏菌屬、 芽孢桿菌屬、藍(lán)藻門、乳桿菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、曲霉菌屬、木霉屬、 脈孢菌屬、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、根毛霉菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、毛霉菌屬、毀絲菌 屬、青霉屬、毛平革菌、側(cè)耳屬、栓菌屬、金孢子菌屬、酵母菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、裂殖酵母屬、 耶氏酵母屬和鏈霉菌屬。19. 權(quán)利要求18所述的重組微生物細(xì)胞，其中所述的埃希氏菌屬為大腸桿菌。20. 權(quán)利要求18所述的重組微生物細(xì)胞，其中所述的藍(lán)藻門選自原綠球藻、聚球藻、集 胞藻屬、藍(lán)桿藻和念珠藻。21. 權(quán)利要求18所述的重組微生物細(xì)胞，其中所述的藍(lán)藻門選自細(xì)長聚球藻PCC7942、 集胞藻屬的菌種PCC6803和聚球藻的菌種PCC7001。22. -種生產(chǎn)脂肪胺的方法，其包括在包含碳源的發(fā)酵肉湯中培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的重 組微生物有機(jī)體。23. -種用于脂肪胺生產(chǎn)的重組細(xì)胞細(xì)胞，其包含： (i) 一種或多種表達(dá)基因，其編碼具有硫酯酶活性的外源生物合成酶； (ii) 一種或多種表達(dá)基因，其編碼具有羧酸還原酶活性的外源生物合成酶；以及 (iii) 一種或多種表達(dá)基因，其編碼具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氫酶活性的外源生物合成 酶，其中所述的重組細(xì)菌細(xì)胞在體內(nèi)生產(chǎn)所述的脂肪胺。24. 權(quán)利要求23所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的脂肪胺被所述的細(xì)菌細(xì)菌釋放至培 養(yǎng)物培養(yǎng)基中。25. 權(quán)利要求23所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的具有硫酯酶活性的外源生物合成酶 將?；?ACP或酰基-CoA轉(zhuǎn)化成脂肪酸。26. 權(quán)利要求25所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的具有羧酸還原酶活性的外源生物合 成酶將所述的脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪醛。27. 權(quán)利要求26所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的具有氨基轉(zhuǎn)移酶或胺脫氫酶活性的 外源生物合成酶將所述的脂肪醛轉(zhuǎn)化成脂肪胺。28. 權(quán)利要求23所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的具有硫酯酶活性的外源生物合成酶 是由編碼tesA基因的核酸序列所編碼。29. 權(quán)利要求23所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的具有羧酸還原酶活性的外源生物合 成酶是由編碼carB基因的核酸序列所編碼。30. 權(quán)利要求23所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的具有氨基轉(zhuǎn)移酶活性的外源生物合 成酶為腐胺或GABA氨基轉(zhuǎn)移酶。31. 權(quán)利要求30所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶為YgjG。32. 權(quán)利要求31所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的YgjG是由編碼ygjG基因的核酸序列 所編碼。33. 權(quán)利要求30所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的GABA氨基轉(zhuǎn)移酶為PuuE。34. 權(quán)利要求33所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的PuuE是由編碼puuE基因的核酸序列 所編碼。35. 權(quán)利要求23所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的具有胺脫氫酶活性的外源生物合成 酶為甲基胺脫氫酶。36. 權(quán)利要求35所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的甲基胺脫氫酶得自脫氮副球菌。37. 權(quán)利要求23所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的重組細(xì)菌細(xì)胞選自埃希氏菌屬、芽孢 桿菌屬、藍(lán)藻門、乳桿菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、曲霉菌屬、木霉屬、脈孢 菌屬、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、根毛霉菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、毛霉菌屬、毀絲菌屬、 青霉屬、毛平革菌、側(cè)耳屬、栓菌屬、金孢子菌屬、酵母菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、裂殖酵母屬、耶 氏酵母屬和鏈霉菌屬。38. 權(quán)利要求37所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的埃希氏菌屬為大腸桿菌。39. 權(quán)利要求37所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的藍(lán)藻門選自原綠球藻、聚球藻、集胞 藻屬、藍(lán)桿藻和念珠藻。40. 權(quán)利要求37所述的重組細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的藍(lán)藻門選自細(xì)長聚球藻PCC7942、集 胞藻屬的菌種PCC6803和聚球藻的菌種PCC7001。41. 一種包含權(quán)利要求23所述的細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。42. -種生產(chǎn)脂肪胺的方法，其包括在包含碳源的發(fā)酵肉湯中培養(yǎng)權(quán)利要求23所述的 細(xì)菌細(xì)胞。43. -種在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)脂肪胺的方法，其包括： (i) 在碳源存在下，在發(fā)酵肉湯中培養(yǎng)權(quán)利要求23所述的細(xì)胞；以及 (ii) 收獲在所述的發(fā)酵肉湯中收集的脂肪胺。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK105874075SQ201480065828
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年12月5日
【發(fā)明人】S·B·德爾卡黛莉, L·G·霍姆
【申請(qǐng)人】Reg生命科學(xué)有限責(zé)任公司