用于酶固定化的改性殼聚糖微球、其制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及殼聚糖微球制備及應用研究領域，尤其涉及一種用于酶固定化的改性 殼聚糖微球、其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素是分布最廣泛的、含量最豐富的、可再生的天然有機物質(zhì)，可以源源不斷地 為人類提供能源。但在自然界中，絕大部分纖維素會被各類微生物分解轉(zhuǎn)化，僅有約11 %的 纖維素原料用于農(nóng)作物產(chǎn)品、飼料、制藥、紡織、造紙和建筑等方面，不僅造成資源的巨大浪 費，而且污染環(huán)境，危害是相當大的。
[0003] 酶對環(huán)境條件要求極為敏感，對酸、堿、熱、金屬離子、部分有機溶劑等都不穩(wěn)定。 一般情況下酶是以溶于水的狀態(tài)作用于底物的，存在反應結(jié)束后難以回收利用、生產(chǎn)成本 較高、終產(chǎn)物分離提純較難等問題。比如，生物質(zhì)經(jīng)纖維素酶處理轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的過程 中，纖維素酶的價格就占到生產(chǎn)總成本的20%左右，限制了酶在生產(chǎn)中的廣泛應用。因此， 游離酶并非工業(yè)催化中一種理想的催化劑，還需要對酶進行修飾和處理，以改善其性能。
[0004] 固定化酶（Immobilized enzyme)是通過物理或化學的方法，將酶結(jié)合于水不溶性 大分子載體上，或?qū)⒚赴裨谄渲校沟妹冈谝欢臻g內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)，酶分子的流動性降 低，但酶可以充分發(fā)揮應有的催化作用，反應結(jié)束后酶可與底物、產(chǎn)物分開，并能重復使用。 目前，酶固定化的方法按傳統(tǒng)可分為4大類，即吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價結(jié)合法。
[0005] 作為固定化酶的重要組成部分，載體材料的結(jié)構和性能直接影響固定化酶的活 性，所以對載體材料的物理和化學性能有一定的要求，如多孔或疏松的結(jié)構、有較大的比表 面積;適當?shù)挠H水性、抗化學或微生物侵蝕及良好的穩(wěn)定性;此外還可通過物理或化學方法 進行改性，使得表面連接必要的反應基團；工業(yè)應用時，載體材料應具有一定的機械強度， 可以承受一定強度的攪拌和壓縮，同時還應具有無毒、來源廣泛、價格低廉等特點。因此，設 計、開發(fā)和制備性能較為優(yōu)越的載體材料已成為近年來固定化酶研究的重點之一。
[0006] 甲殼素是一種僅次于纖維素的來源及其豐富的天然有機化合物，廣泛存在于甲殼 綱動物（蝦、蟹等)的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌(酵母、霉菌）的細胞壁以及某些植物的細胞壁 中。殼聚糖(Chitosan，簡稱CTS)是甲殼素的N-脫乙?；a(chǎn)物，是一種二元線性共聚物，化學 名稱是β-2_氨基-2-脫氧-(1，4)-D葡聚糖，相對分子質(zhì)量在幾十萬到上百萬左右。殼聚糖不 溶于水、堿、稀的硫酸和磷酸，但可溶于部分稀的無機酸（如鹽酸）和大多數(shù)有機酸（如醋 酸）。殼聚糖有多糖結(jié)構和氨基功能基團，具有諸多優(yōu)點，如吸濕性、通透性、抗菌性、良好的 生物相容性、無毒無害、對環(huán)境無污染等，可以作為固定化酶載體。因此，采用殼聚糖改善傳 統(tǒng)的固定化方法、開發(fā)新型的固定化技術和注重天然高分子載體材料的改性成為了酶固定 化研究的主要趨勢。
[0007] 然而，對于殼聚糖作為載體固定化酶的應用，存在著必須離心操作，樣品不得不稀 釋及載體回收損失大等問題。因此，尋求更好的固定化酶載體成為了人們研究的熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種用于酶固定化的改性殼聚糖微球、其制 備方法及應用，能夠提供一種固定化酶的良好載體，并能夠制備具有良好穩(wěn)定性和重復利 用性的固定化纖維素酶。
[0009] 為了達到上述技術目的，本發(fā)明提供一種用于酶固定化的改性殼聚糖微球的制備 方法，包括：
[0010] (1)在〇. 5g殼聚糖粉末中加入質(zhì)量分數(shù)為5 %的乙酸溶液，待殼聚糖粉末充分溶解 后，加入液體石蠟，攪拌10分鐘；
[0011] (2)將步驟(1)的所得物升溫至50°C，滴加乳化劑Span80，乳化10分鐘；
[0012 ] (3)在步驟⑵的所得物中加入〇. 5~2. OmL的甲醛溶液，攪拌反應1.5小時；
[0013] (4)將步驟⑶的所得物升溫至70°C，滴加質(zhì)量分數(shù)為10 %的NaOH溶液，在溶液pH 值保持為堿性條件下，緩慢滴加1. 〇~2.5mL的環(huán)氧氯丙烷，反應5小時；
[0014] (5)將步驟(4)的所得物過濾，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無水乙醇洗滌、水 洗滌，直至洗滌液的pH值達到中性；
[0015] (6)在50mg步驟(5)的所得物中加入50mL反應溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，浸泡 過夜后；
[0016] (7)在步驟(6)的所得物中加入250mg乙二胺及催化劑，在氮氣保護下于90°C下攪 拌反應12小時，得到改性殼聚糖微球；
[0017] (8)將步驟(7)的所得物用lmol/L的鹽酸加熱處理9小時，接著依次進行堿洗、酸洗 和水洗，直至洗滌液的pH值達到中性，再干燥至恒重，得到用于酶固定化的改性殼聚糖微球 (NCTS-EDA)〇
[0018] 較佳地，步驟⑶中甲醛的用量為1. OmL。
[0019] 較佳地，步驟(4)中環(huán)氧氯丙烷的用量為2.OmL。
[0020] 較佳地，各步驟中攪拌反應的攪拌速率為250r/min。
[0021] 本發(fā)明還提供一種用于酶固定化的改性殼聚糖微球，由上述方法制備。
[0022] 本發(fā)明還提供一種纖維素酶固定化的方法，包括：
[0023] (1)將10mg權利要求5所述的改性殼聚糖微球用pH值為4 · 0~7 · 0的10mL的磷酸緩 沖液溶脹24小時后分離；
[0024] (2)在步驟(1)的所得物中加入1 OmL的5 %戊二醛溶液，于25°C下振蕩活化5小時并 過濾，用蒸餾水洗去多余的戊二醛；
[0025] (3)在步驟(2)的所得物中加入2.0~2.5mg酶液，于25~30°C下恒溫振蕩固定2~6 小時后，過濾，濾渣用磷酸緩沖液進行反復沖洗后得固定化酶。
[0026]較佳地，步驟(3)中固定時間為4小時。
[0027]較佳地，步驟(1)中磷酸緩沖液的pH值為7.0。
[0028]較佳地，步驟(3)中固定溫度為30°C。
[0029]本發(fā)明還提供一種由上述纖維素酶固定化方法得到的固定化酶。
[0030] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，有以下優(yōu)點：
[0031] (1)本發(fā)明提供的改性殼聚糖微球安全無毒，具有良好的機械性能，耐熱性好，分 子中存在大量氨基，易改性，是極具利用價值的固定化酶的良好載體；
[0032] (2)本發(fā)明提供的酶固定化方法延續(xù)了傳統(tǒng)共價結(jié)合法固定化酶的優(yōu)點，且酶活 力回收率較高，具有較高的應用價值；
[0033] (3)本發(fā)明制備出的固定化纖維素酶具有良好的穩(wěn)定性和重復利用性，由于改性 殼聚糖微球載體呈微球狀態(tài)，使得產(chǎn)物與酶易于分離回收。
【附圖說明】
[0034]圖1為纖維素酶標準曲線；
[0035] 圖2為吸光值與葡萄糖濃度的關系(標準曲線）；
[0036] 圖3為時間對纖維素酶固定化的影響；
[0037]圖4為pH值對纖維素酶固定化的影響；
[0038] 圖5為給酶量對纖維素酶固定化的影響；
[0039] 圖6為溫度對纖維素酶固定化的影響；
[0040] 圖7為pH對游離酶和固定化酶相對活力的影響；
[0041 ]圖8為溫度對游離酶和固定化酶相對活力的影響；
[0042]圖9為50°C下游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性；
[0043]圖10為70°C下游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性；
[0044] 圖11為固定化酶和游離酶的L i ncwa ver-Burk曲線；
[0045] 圖12為游離酶和固定化酶的貯藏穩(wěn)定性；
[0046] 圖13為固定化纖維素酶的重復使用性能。
【具體實施方式】
[0047] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0048] 實施例1
[0049] (1)稱取0.58殼聚糖粉末于10〇1^三頸瓶中，加入3〇1^質(zhì)量分數(shù)為5%的乙酸溶液， 室溫下攪拌，待殼聚糖充分溶解后，加入30mL液體石蠟，攪拌10分鐘；
[0050] (2)將步驟（1)的所得物升溫至50°C，滴加2-3滴乳化劑Span80，乳化10分鐘，使其 形成細小的殼聚糖液滴；
[0051] (3)在步驟⑵的所得物中加入l.OmL的甲醛溶液，攪拌反應1.5小時；
[0052] (4)將步驟(3)的所得物升溫至70°C，滴加5-6滴質(zhì)量分數(shù)為10 %的NaOH溶液，使溶 液的pH值保持為堿性，緩慢滴加2. OmL的環(huán)氧氯丙烷，反應5小時；
[0053] (5)將步驟(4)的所得物過濾，用蒸餾水洗