用于酶固定化的磁性殼聚糖微球、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及殼聚糖微球制備及應(yīng)用研究領(lǐng)域，尤其涉及一種用于酶固定化的磁性 殼聚糖微球、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是分布最廣泛的、含量最豐富的、可再生的天然有機(jī)物質(zhì)，可以源源不斷地 為人類提供能源。但在自然界中，絕大部分纖維素會(huì)被各類微生物分解轉(zhuǎn)化，僅有約11 %的 纖維素原料用于農(nóng)作物產(chǎn)品、飼料、制藥、紡織、造紙和建筑等方面，不僅造成資源的巨大浪 費(fèi)，而且污染環(huán)境，危害是相當(dāng)大的。
[0003] 酶對(duì)環(huán)境條件要求極為敏感，對(duì)酸、堿、熱、金屬離子、部分有機(jī)溶劑等都不穩(wěn)定。 一般情況下酶是以溶于水的狀態(tài)作用于底物的，存在反應(yīng)結(jié)束后難以回收利用、生產(chǎn)成本 較高、終產(chǎn)物分離提純較難等問(wèn)題。比如，生物質(zhì)經(jīng)纖維素酶處理轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的過(guò)程 中，纖維素酶的價(jià)格就占到生產(chǎn)總成本的20%左右，限制了酶在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。因此， 游離酶并非工業(yè)催化中一種理想的催化劑，還需要對(duì)酶進(jìn)行修飾和處理，以改善其性能。
[0004] 固定化酶（Immobilized enzyme)是通過(guò)物理或化學(xué)的方法，將酶結(jié)合于水不溶性 大分子載體上，或?qū)⒚赴裨谄渲校沟妹冈谝欢臻g內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)，酶分子的流動(dòng)性降 低，但酶可以充分發(fā)揮應(yīng)有的催化作用，反應(yīng)結(jié)束后酶可與底物、產(chǎn)物分開(kāi)，并能重復(fù)使用。 目前，酶固定化的方法按傳統(tǒng)可分為4大類，即吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法。
[0005] 作為固定化酶的重要組成部分，載體材料的結(jié)構(gòu)和性能直接影響固定化酶的活 性，所以對(duì)載體材料的物理和化學(xué)性能有一定的要求，如多孔或疏松的結(jié)構(gòu)、有較大的比表 面積;適當(dāng)?shù)挠H水性、抗化學(xué)或微生物侵蝕及良好的穩(wěn)定性;此外還可通過(guò)物理或化學(xué)方法 進(jìn)行改性，使得表面連接必要的反應(yīng)基團(tuán)；工業(yè)應(yīng)用時(shí)，載體材料應(yīng)具有一定的機(jī)械強(qiáng)度， 可以承受一定強(qiáng)度的攪拌和壓縮，同時(shí)還應(yīng)具有無(wú)毒、來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉等特點(diǎn)。因此，設(shè) 計(jì)、開(kāi)發(fā)和制備性能較為優(yōu)越的載體材料已成為近年來(lái)固定化酶研究的重點(diǎn)之一。
[0006] 甲殼素是一種僅次于纖維素的來(lái)源及其豐富的天然有機(jī)化合物，廣泛存在于甲殼 綱動(dòng)物(蝦、蟹等）的甲殼、昆蟲(chóng)的甲殼、真菌(酵母、霉菌）的細(xì)胞壁以及某些植物的細(xì)胞壁 中。殼聚糖(Chitosan，簡(jiǎn)稱CTS)是甲殼素的N-脫乙?；a(chǎn)物，是一種二元線性共聚物，化學(xué) 名稱是β-2_氨基-2-脫氧-(1，4)-D葡聚糖，相對(duì)分子質(zhì)量在幾十萬(wàn)到上百萬(wàn)左右。殼聚糖不 溶于水、堿、稀的硫酸和磷酸，但可溶于部分稀的無(wú)機(jī)酸（如鹽酸）和大多數(shù)有機(jī)酸（如醋 酸）。殼聚糖有多糖結(jié)構(gòu)和氨基功能基團(tuán)，具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如吸濕性、通透性、抗菌性、良好的 生物相容性、無(wú)毒無(wú)害、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等，可以作為固定化酶載體。因此，采用殼聚糖改善傳 統(tǒng)的固定化方法、開(kāi)發(fā)新型的固定化技術(shù)和注重天然高分子載體材料的改性成為了酶固定 化研究的主要趨勢(shì)。
[0007] 然而，對(duì)于殼聚糖作為載體固定化酶的應(yīng)用，存在著必須離心操作，樣品不得不稀 釋及載體回收損失大等問(wèn)題。因此，尋求更好的固定化酶載體成為了人們研究的熱點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于酶固定化的磁性殼聚糖微球、其制 備方法及應(yīng)用，能夠提供固定化酶的良好載體，并制備具有良好穩(wěn)定性和重復(fù)利用性的固 定化纖維素酶。
[0009] 為了達(dá)到上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供一種用于酶固定化的磁性殼聚糖微球的制備 方法，包括：
[0010] (1)在0.5g殼聚糖粉末和0.125g納米四氧化三鐵中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的乙酸溶 液，待殼聚糖粉末充分溶解后，加入液體石蠟，250r/min轉(zhuǎn)速下攪拌10分鐘；
[0011] (2)將步驟(1)的所得物升溫至50°C，滴加乳化劑Span80，乳化10分鐘；
[0012] ⑶在步驟⑵的所得物中加入l.OmL的甲醛溶液，攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)；
[0013] (4)將步驟⑶的所得物升溫至70°C，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的NaOH溶液，在溶液pH 值保持為堿性條件下，緩慢滴加2. OmL的環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5小時(shí)；
[0014] (5)將步驟(4)的所得物過(guò)濾，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌、水 洗滌，直至洗滌液的pH值達(dá)到中性，再干燥至恒重，得到用于酶固定化的磁性殼聚糖微球 (MCTS)〇
[0015] 本發(fā)明還提供一種用于酶固定化的磁性殼聚糖微球，由上述方法制備。
[0016] 本發(fā)明還提供一種纖維素酶固定化的方法，包括：
[0017] (1)將l〇mg權(quán)利要求2所述的磁性殼聚糖微球用pH值為4.0~7.0的10mL的磷酸緩 沖液溶脹24小時(shí)后分離；
[0018] (2)在步驟(1)的所得物中加入1 OmL的5 %戊二醛溶液，于25°C下振蕩活化5小時(shí)并 過(guò)濾，用蒸餾水洗去多余的戊二醛；
[0019] (3)在步驟⑵的所得物中加入1.5mg酶液，于25~30°C下恒溫振蕩固定2~6小時(shí) 后，過(guò)濾，濾渣用磷酸緩沖液進(jìn)行反復(fù)沖洗后得固定化酶。
[0020]較佳地，步驟(3)中固定時(shí)間為5小時(shí)。
[0021 ]較佳地，步驟(1)中磷酸緩沖液的pH值為7.0。
[0022]較佳地，步驟(3)中固定溫度為30°C。
[0023]本發(fā)明還提供一種由上述纖維素酶固定化方法得到的固定化酶。
[0024] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0025] (1)本發(fā)明提供的磁性殼聚糖微球安全無(wú)毒，具有良好的機(jī)械性能，耐熱性好，分 子中存在大量氨基，易改性，是極具利用價(jià)值的固定化酶的良好載體；
[0026] (2)本發(fā)明提供的酶固定化方法延續(xù)了傳統(tǒng)共價(jià)結(jié)合法固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，且酶活 力回收率較高，具有較高的應(yīng)用價(jià)值；
[0027] (3)本發(fā)明制備出的固定化纖維素酶具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，由于磁性 殼聚糖微球載體呈微球狀態(tài)，使得產(chǎn)物與酶易于分離回收。
【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為Fe3〇4的磁化曲線；
[0029]圖2為磁性殼聚糖、2，4，6-改性磁性殼聚糖微球的磁化曲線；
[0030] 圖3為磁性殼聚糖微球(MCTS)、2,4,6-三氨基嘧啶（TAP)和改性磁性殼聚糖微球 (MCTS-TAP)的熱重分析圖；
[0031] 圖4為吸光值與葡萄糖濃度的關(guān)系(標(biāo)準(zhǔn)曲線）；
[0032]圖5為時(shí)間對(duì)纖維素酶固定化的影響；
[0033]圖6為pH值對(duì)纖維素酶固定化的影響；
[0034] 圖7為給酶量對(duì)纖維素酶固定化的影響；
[0035] 圖8為溫度對(duì)纖維素酶固定化的影響；
[0036] 圖9為pH對(duì)游離酶和固定化酶相對(duì)活力的影響；
[0037]圖10為溫度對(duì)游離酶和固定化酶相對(duì)活力的影響；
[0038]圖11為50°C下游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性；
[0039]圖12為70°C下游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性；
[0040] 圖13為固定化酶和游離酶的L i ncwa ver-Burk曲線；
[0041] 圖14為游離酶和固定化酶的貯藏穩(wěn)定性；
[0042] 圖15為固定化纖維素酶的重復(fù)使用性能。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] (1)稱取0.5g殼聚糖粉末和0.125g納米四氧化三鐵于100mL三頸瓶中，加入30mL質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為4 %的乙酸溶液，室溫下攪拌，待殼聚糖充分溶解后，加入30ml液體石蠟，250r/min 轉(zhuǎn)速下攪拌10分鐘；
[0046] (2)將步驟(1)的所得物升溫至50°C，滴加2-3滴乳化劑Span80，乳化10分鐘；
[0047] (3)在步驟⑵的所得物中加入l.OmL的甲醛溶液，攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)；
[0048] (4)將步驟(3)的所得物升溫至70°C，滴加5-6滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的NaOH溶液，使溶 液的pH值保持為堿性，緩慢滴加2. OmL的環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5小時(shí)；
[0049] (5)將步驟(4)的所得物過(guò)濾，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌、水 洗滌，直至洗滌液的pH值達(dá)到中性，再置于50°C的真空干燥器中恒重后得到用于酶固定化 的磁性殼聚糖微球(MCTS)。
[0050] 實(shí)驗(yàn) 1-1
[0051] 用十萬(wàn)分之一的精密電子天平準(zhǔn)確稱重，用雙面膠將包好的樣品貼在石英樣品桿 端，固定在VSM的振動(dòng)頭上，測(cè)試樣品的靜磁參數(shù)隨磁場(chǎng)的變化。測(cè)試條件：環(huán)境溫度為 298K，測(cè)試角度0.00°。
[0052]圖1及圖2分別為Fe3〇4、磁性殼聚糖、2，4，6-改性磁性殼聚糖微球的磁化曲線。 Fe3〇4、MCTS和 MCTS-TAP 的飽和磁化強(qiáng)度分別為 56 · 8emu/g、9 · 76emu/g 和6 · 63emu/g。兩種磁 性微球的飽和磁力強(qiáng)度均小于Fe3〇4的強(qiáng)度，因?yàn)樵诤铣纱判詺ぞ厶俏⑶驎r(shí)，