一種酶促反應(yīng)制備2,3-環(huán)氧蒎烷的方法
【專利說明】一種酶促反應(yīng)制備2,3-環(huán)氧蒎烷的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于綠色合成領(lǐng)域，具體涉及一種酶促反應(yīng)制備2,3_環(huán)氧蒎烷的方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 2,3_環(huán)氧蒎烷是一種重要的有機合成中間體，用于合成一系列香料如香芹醇、龍 腦烯醛及生物活性物質(zhì)如保幼激素類似物、昆蟲驅(qū)避劑等。其作為重要的精細(xì)化工品的中 間體，被人們廣泛的研究，目前針對2,3_環(huán)氧蒎烷的合成方法主要是通過烯烴環(huán)氧化方法 制備，以α_蒎烯為反應(yīng)物，分子篩或介孔分子作催化劑，過氧化氫或過氧乙酸作氧化劑的化 學(xué)方法進(jìn)行合成，但這些方法存在手性識別能力差，導(dǎo)致選擇性不夠高，環(huán)境污染問題等， 近年來使用過渡金屬配合物催化體系研究較多，雖然合成方法開始向綠色化學(xué)轉(zhuǎn)化，但是， 這些反應(yīng)仍然在有機溶劑體系中進(jìn)行，使用的催化劑制備過程很復(fù)雜，且有些使用的是有 機物作為氧化劑，會對環(huán)境造成污染，不符合綠色化學(xué)的要求。
[0003] 從綠色發(fā)展的角度來看，模擬生物酶催化是一個高效的方法，氯過氧化物酶(CP0) 是從海洋真菌Caldariomyces fumago中提取出來的一種血紅素過氧化物酶(42kDa) <ΧΡ0具 有極為廣泛的氧化活性，兼具血紅素過氧化物酶(單電子及兩電子過氧化、有機鹵化）、過氧 化氫酶(過氧化氫歧化、一元醇氧化）以及細(xì)胞色素 Ρ450 (脫烷基化、烯鍵環(huán)氧化、磺化氧化 等)等多種酶的催化特征，目前被認(rèn)為是過氧化物酶家族中應(yīng)用最廣泛的酶。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種酶促反應(yīng)制備2,3_環(huán)氧 蒎烷的方法，該方法選擇性高，無污染。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] 包括以下步驟:取降冰片烯、雙氧水和氯過氧化物酶溶液加入磷酸緩沖溶液，混合 形成反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)體系中，降冰片烯、Η 202、氯過氧化物酶和磷酸緩沖溶液的摩 #KS(0.005~0.015)umol:(10~20)umol :(12~30)X10-6umol:(2~3)mL〇
[0007] 進(jìn)一步地，所述雙氧水的濃度為0. lmol/L。
[0008] 進(jìn)一步地，所述氯過氧化物酶溶液的濃度為0.6~1.5umol/L。
[0009] 進(jìn)一步地，磷酸緩沖溶液的濃度為0. lmol/L。
[0010] 進(jìn)一步地，磷酸緩沖溶液的pH值為3.5~6。
[0011] 進(jìn)一步地，在反應(yīng)體系中還添加有濃度為0.8g/mL的離子液體共溶劑，其中，離子 液體共溶劑的體積占磷酸緩沖溶液體積的〇. 1~3%。
[0012] 進(jìn)一步地，離子液體采用咪唑類離子液體或季銨鹽類離子液體。
[0013] 進(jìn)一步地，雙氧水是間歇式加入，間歇時間是30min。
[0014] 進(jìn)一步地，反應(yīng)溫度為0~60°C。
[0015] 進(jìn)一步地，反應(yīng)時間為1~6h。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0017] 本發(fā)明通過CP0作為催化劑，雙氧水作為氧化劑，催化高級烯烴一一降冰片烯進(jìn)行 環(huán)氧化反應(yīng)合成2，3_環(huán)氧蒎烷，CP0用量極少，反應(yīng)時間為3h時，降冰片烯的轉(zhuǎn)化率可達(dá) 100%，2,3_環(huán)氧蒎烷產(chǎn)率可達(dá)到86.46%。該方法操作簡單、快速高效、酶及氧化劑用量極 少、反應(yīng)溫度較低、產(chǎn)率較高、選擇性高、綠色環(huán)保。本發(fā)明采用酶促反應(yīng)制備2,3_環(huán)氧蒎 烷，克服了現(xiàn)有方法在有機溶劑中進(jìn)行的問題。
[0018] 進(jìn)一步地，本發(fā)明中還引入離子液體作為共溶劑，與有機溶劑作為共溶劑相比，本 發(fā)明有效增加底物的溶解度，從而提高底物轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)率及選擇性；而且離子液體綠色環(huán) 保。 【【附圖說明】】
[0019] 圖1是本發(fā)明不同離子液體對降冰片烯環(huán)氧化的影響；
[0020] 圖2是本發(fā)明離子液體濃度對降冰片烯環(huán)氧化的影響。 【【具體實施方式】】
[0021 ]本發(fā)明制備方法的技術(shù)方案包括以下步驟:純緩沖液體系及添加少量離子液體、 季銨鹽與有機溶劑體系。
[0022] 1)緩沖溶液的配制
[0023] O.lmol · L-1磷酸鹽緩沖液：稱量6.8046g KH2P〇4定容于500mL的容量瓶，配成 0.1111〇1.1/11〇12?04溶液；稱量11.411(^1(2邢04定容于50011^的容量瓶，配成0.1111〇1·!/ iHPCk溶液，用K2HP〇4對KH2P〇4溶液調(diào)節(jié)成pH = 5.8的緩沖液，再用0. lmol · L-1鹽酸將其調(diào) 節(jié)成所需的不同pH的緩沖液。
[0024] 2)酶催化反應(yīng)
[0025] (1)將2mmol/L的底物2 · 5~7 · 5uL(降冰片烯），0 · lmol/L的H2O2IOO~200uL，0 · 6~ 1.5umol/L的CP0 20uL，加入2~3mL的0. lmol/L磷酸緩沖溶液(pH = 3.5~6)混合得到反應(yīng) 體系，通過計算，降冰片烯、H2〇2、氯過氧化物酶和磷酸緩沖溶液的比例為(0.005~0.015) 〇1:(10~20)11111〇1 :(12~30)\10-611111〇1:(2~3)1111^反應(yīng)溫度為0~60°(3，反應(yīng)1~611。反應(yīng) 以加入雙氧水引發(fā)，加入方式采用每隔30min分批加入上述反應(yīng)體系，反應(yīng)過程使用氣相色 譜監(jiān)測，在一定的時間間隔內(nèi)取出反應(yīng)液，用乙酸乙酯稀釋，一定量的MgS0 4干燥水分，加入 內(nèi)標(biāo)物正辛烷，用濾膜過濾后進(jìn)行色譜分析，底物的轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)物的產(chǎn)率利用實驗前做好 的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析。
[0026] (2)本發(fā)明還可以在配制（1)的反應(yīng)體系過程中，先加入濃度為0.8g/mL的離子液 體共溶劑(〇. 8g的離子液體溶于10mL水配制的共溶劑），其中離子液體共溶劑的體積與磷酸 緩沖溶液體積比Vws^/VpbsiO. 1~3% ;通過添加有機溶劑來與添加離子液體進(jìn)行對比，其 中有機溶劑可以采用正己烷、甲醇、1，4_二氧六環(huán)、乙腈，且其與氯過氧化物酶的體積摩爾 比為(40~60)uL:12X10- 6umol;然后再加入0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH = 3.5~6)混合，其 它底物、雙氧水和CP0等用量及步驟同上述(1)。
[0027] 3)酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定
[0028] 降冰片稀的CP0催化環(huán)氧化反應(yīng)符合Michaelis-Menten動力學(xué)特征，選擇不同的 底物濃度[S](底物濃度范圍：0.050-0.50mol · I/1)在一定時間內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù) lineweaver-burk雙倒數(shù)法求出米氏常數(shù)Km和最大速率Vmax:以及轉(zhuǎn)化數(shù)，添加離子液體的 情況也一樣，離子液體濃度為其最佳濃度。
[0029]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。 [0036]在緩沖溶液體系中，考察了氧化劑H202的添加方式(一次性加入與間歇式）、不同pH 的磷酸鹽緩沖液化11 = 3.5、4、4.5、5、5.5、6)、反應(yīng)溫度〇 = 0~70°〇等因素對2,3-環(huán)氧蒎 烷產(chǎn)率的影響。
[0037] 實施例1
[0038]由于當(dāng)雙氧水的濃度過高時，會破壞CP0血紅素的結(jié)構(gòu)，對2,3_環(huán)氧蒎烷產(chǎn)率的影 響很大，考察H2〇2(濃度為O.lmol · I/1)分別采用一次性加入與間歇式的添加方式使得總加 入量為150uL，2mmol/L的底物（降冰片烯）5uL，20uL 0.6umol/L的CP0,加入一定量的 0. lmol/L pH= 5.5磷酸緩沖溶液混合使反應(yīng)體系總體積為3mL，反應(yīng)在35°C進(jìn)行，反應(yīng)時間 為6h。實驗結(jié)果表明，每隔30min添加20~30uL的H 2〇2的效果最好，2，3-環(huán)氧蒎烷產(chǎn)率與選擇 性最尚。
[0039] 實施例2
[0040] 考察了不同？!1的磷酸鹽緩沖液，？!1=3.5、4、4.5、5、5.5、6對2,3-環(huán)氧蒎烷產(chǎn)率的 影響，其中H2〇2采取間歇式加入，其它條件同實施例1不變，產(chǎn)率隨pH增大先增大后降低，在 緩沖溶液pH為5.5時，2，3-環(huán)氧蒎烷的產(chǎn)率達(dá)最高值為45.07 %，由于在酸度很高時，降冰片 烯環(huán)氧化生成的環(huán)氧化物容易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)或者是進(jìn)一步的氧化反應(yīng)，生成醇或者相應(yīng)的 酮，從而使產(chǎn)率降低，而在接近中性條件時，CP0會失活。
[0041 ] 實施例3
[0042] 考察了反應(yīng)溫度T = 0~70°C對2，3-環(huán)氧蒎烷的影響，磷酸緩沖溶液pH為5.5，其他 條件同實施例1，在30°C時降冰片烯的轉(zhuǎn)化率達(dá)到62.57 %，溫度繼續(xù)升高時產(chǎn)率下降，因為 溫度升高時2，3-環(huán)氧蒎烷的水解程度增大，在40°C與60°C之間變化不大，而溫度達(dá)70°C時， 使得CP0失活導(dǎo)致產(chǎn)率急劇下降。
[0043] 實施例4
[0044] 為了提高