一種磷酸二膽堿化殼聚糖鹽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗菌高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磷酸二膽堿化殼聚糖鹽及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 致病性細(xì)菌、真菌等微生物嚴(yán)重威脅著人類的身體健康和生命安全，人們一直致 力于研制安全高效的抗菌劑，用于有效地抑制病菌的生長，防止病菌的傳播和感染?？咕鷦?可分為無機抗菌劑、有機抗菌劑、天然抗菌劑和合成高分子抗菌劑4大體系。傳統(tǒng)的抗菌 劑，如抗生素等，存在諸如對人體有毒，在自然條件下不易降解而影響環(huán)境安全，病菌產(chǎn)生 耐藥性等缺點，極大地限制了其廣泛應(yīng)用，尤其是在醫(yī)療衛(wèi)生和健康護理領(lǐng)域。因此研制開 發(fā)一種對人體無毒且環(huán)境友好的高效抗菌劑勢在必行。
[0003] 抗菌高分子材料具有長效、廣譜抗菌作用，不會誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生耐藥性，且成本較 低，近年來受到廣泛關(guān)注。目前研究較多的主要有聚季銨鹽、聚鹵胺、聚胍、聚季膦鹽、殼聚 糖及其衍生物等多種陽離子型高分子抗菌劑。大量研究致力于通過優(yōu)化高分子的結(jié)構(gòu)，包 括分子量、陽離子基團種類、親疏水性等，來增強高分子抗菌劑的殺菌活性，同時維持其生 物安全性，即提高抗菌高分子材料的殺菌選擇性。
[0004] 殼聚糖是甲殼素的部分或全部脫乙?；a(chǎn)物，其基本結(jié)構(gòu)單元是氨基葡萄糖殘 基，具有無毒、可生物降解、生物相容和抗菌性等許多優(yōu)點。但殼聚糖在pH > 6. 0的水中溶 解性差，限制其抗菌應(yīng)用，尤其是在生理環(huán)境條件下的使用。季銨化是增強殼聚糖水溶性和 抗菌性的常用改性方法，可以是將殼聚糖骨架上的氨基修飾為季銨鹽，如N，N，N-三甲基殼 聚糖（TMC)，或在殼聚糖骨架之外引入季銨基團，如N-[ (2-羥丙基-3-三甲基氨基）丙基] 殼聚糖（HTCC);還可對殼聚糖季銨鹽進一步化學(xué)修飾改善其抗菌性。但殼聚糖季銨化在提 高其水溶性和抗菌性的同時往往也會增大其細(xì)胞毒性，限制了其在醫(yī)療衛(wèi)生和健康護理產(chǎn) 品中的使用。采用細(xì)胞膜仿生技術(shù)構(gòu)建的帶正電荷的殼聚糖仿生衍生物有望克服現(xiàn)有技術(shù) 的不足，獲得在生理環(huán)境下具有良好生物相容性的抗菌材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種磷酸二膽堿化殼聚 糖鹽。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供磷酸二膽堿化殼聚糖鹽的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽的分子結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0009]
[0010] 式I;
[0011] 其中，x/n = 0~0. 2,即殼聚糖的脫乙酰度為80%~100%;磷酸二膽堿基團的取 代度為y/n，不小于25 %;更優(yōu)選為y/n = 25 %~75% ;n為結(jié)構(gòu)式中重復(fù)單元數(shù)；R (反離 子R)優(yōu)選為鹵素離子、硝酸根、醋酸根或果酸根離子等。
[0012] 所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽的制備方法，包括如下步驟：
[0013] 將殼聚糖改性得到的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖（CsTr)溶于反應(yīng)介質(zhì)；加入雙取 代膽堿膦酸酯，其中6-0-三苯基甲醚化殼聚糖（CsTr)中的氨基與膦酸酯的摩爾比為1 : (2~10)，（0~40) °C攪拌反應(yīng)4~24h ;旋干溶劑，加入甲酸，室溫攪拌0. 5~6h ;旋干甲 酸，用生理鹽水和去離子水透析，冷凍干燥，得到磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽。
[0014] 所述的殼聚糖改性得到的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖（CsTr)按照文獻 "S. J. Nishmura, 0· Kohgo, K. Kurita, Macromolecules 24 (1991) 4745-4748. " 中的制備方法 制備得到；
[0015] 所述的反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)選為二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每 IOOmL二甲基乙酰胺中含有1~IOg的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖，其中三乙胺、四氯化碳與 6-0-三苯基甲醚化殼聚糖的氨基摩爾比例優(yōu)選為6 :4 :1 ;
[0016] 所述的每IOOmL二甲基乙酰胺中優(yōu)選含有1~2g的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖；
[0017] 所述的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖（CsTr)中的氨基與膦酸酯的摩爾比優(yōu)選為1 : (3 ~8);
[0018] 所述的攪拌反應(yīng)的條件優(yōu)選為0~40°C攪拌反應(yīng)12~24h ;
[0019] 所述的室溫攪拌的時間優(yōu)選為2~6h ;
[0020] 所述的雙取代膽堿膦酸酯由氯化膽堿和對苯氧基膦酸酯按摩爾比2 :1在二甲亞 砜/吡啶混合溶劑中反應(yīng)2小時制得；
[0021] 本發(fā)明所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽在制備抗菌藥物或抗菌材料中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0023] 本發(fā)明所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽在生理環(huán)境條件下具有顯著的廣譜抗菌效 果，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，且對正常細(xì)胞無毒，不產(chǎn)生溶血，在醫(yī)療及健康護 理領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0024] 圖1是磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽的1H NMR譜圖。
[0025] 圖2是磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽的31P NMR譜圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0027] 實施例1磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽合成
[0028] 取200mg由殼聚糖（x/n = 0)改性得到的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖（CsTr)溶于 IOmL無水二甲基乙酰胺，同時加入0. 42mL的三乙胺和0. 19mL的四氯化碳；緩慢加入0. 46g 雙取代膽堿膦酸酯，其中CsTr中的氨基與膦酸酯的摩爾比為1 :3, (TC攪拌反應(yīng)12小時；旋 干溶劑，加入甲酸，室溫攪拌2小時；旋干甲酸，用生理鹽水和去離子水透析，冷凍干燥，得 到磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽。其中磷酸二膽堿基團的取代度為25%，核磁氫譜（ 1H NMR) 如圖1所示；31P NMR譜圖如圖2所示。
[0029] 實施例2磷酸二膽堿化殼聚糖醋酸鹽的制備。
[0030] 取300mg由殼聚糖（x/n = 0. 1)改性得到的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖（CsTr) 溶于30mL無水二甲基乙酰胺，同時加入0. 63mL的三乙胺和0. 29mL的四氯化碳；緩慢加入 1.84g雙取代膽堿膦酸酯，其中CsTr中的氨基與膦酸酯的摩爾比為I :8,40°C攪拌反應(yīng)24 小時；旋干溶劑，加入甲酸，室溫攪拌6小時；旋干甲酸，用醋酸鈉水溶液和去離子水透析3 天，冷凍干燥，得到磷酸二膽堿化殼聚糖醋酸鹽。其中磷酸二膽堿基團的取代度為75 %。 [0031 ] 實施例3磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽的抑菌性能評價
[0032] 以大腸桿菌（Escherichia coli)(市售）（革蘭氏陰性菌）和金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(市售）（革蘭氏陽性菌）為細(xì)菌模型，采用兩倍稀釋法測定實施 例1制備的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽（取代度=25% )在37°C，pH = 7條件下的最低 抑菌濃度（MIC)。結(jié)果是：磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽對大腸桿菌的MIC = 15 μ g/mL，對金 黃色葡萄球菌的MIC = 20 μ g/mL。磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽表現(xiàn)出良好的抗菌性。
[0033] 實施例4磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽的細(xì)胞相容性評價
[0034] 以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3(賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司）為細(xì)胞模型， 與不同濃度的實施例1制備的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽（取代度=25% )共孕育24小 時，采用MTT法測定其增殖率。結(jié)果表明：濃度小于等于2000 μ g/mL的磷酸二膽堿化殼聚 糖鹽酸鹽（取代度=25% )共培養(yǎng)的NIH/3T3增殖率都大于75%，即磷酸二膽堿化殼聚糖 鹽酸鹽（取代度=25% )的IC5。值大于2000 μ g/mL，表明其具有良好的細(xì)胞相容性。
[0035] 實施例5磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽的溶血率評價
[0036] 取新鮮兔紅細(xì)胞（RBCs)(新西蘭大白兔，由廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供）lmL， 用 9mL HEPES(10mM HEPES，150mM NaCl，pH 7)稀釋，1000 g離心 5min后用移液槍棄上清液， 重復(fù)2次，棄去上清液后再加入29mL HEPES配置成3. 3 % V/V的RBCs溶液。取1塊96孔 板，每孔移入90 μ L RBCs溶液，加入10 μ L系列濃度（最大濃度：2000 μ g/mL)的實施例1 制備的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽（取代度=25% )，HEPES溶液作為陰性對照組，1% v/ V Triton X-100溶液作為陽性對照組，37°C IOOrpm下孵育lh。將96孔板置于孔板離心機 中以1000 rpm離心10min后每孔取出10 μ L上清液加入每孔含有90 μ L HEPES的新96孔 板，酶標(biāo)儀以405nm讀數(shù)。溶血率計算公式如下：
[0038] 式中A為實驗組吸光度值，A。為陰性對照組吸光度值，A1。。為陽性對照組吸光度值。
[0039] 結(jié)果表明：濃度小于等于2000 μ g/mL的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽（取代度= 25% )的溶血率均小于2%，表明其具有良好的血液相容性。
[0040] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種磷酸二膽堿化殼聚糖鹽，其特征在于：其分子結(jié)構(gòu)如式I所示：其中，x/n = 〇~〇. 2,即殼聚糖的脫乙酰度為80%~100%;磷酸二膽堿基團的取代度 為y/n，不小于25% ;n為結(jié)構(gòu)式中重復(fù)單元數(shù)；R為鹵素離子、硝酸根、醋酸根或果酸根離 子。2. 權(quán)利要求1所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽的制備方法，其特征在于包括如下步驟： 將殼聚糖改性得到的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖溶于反應(yīng)介質(zhì)；加入雙取代膽堿膦酸 酯，攪拌反應(yīng)；旋干溶劑，加入甲酸，室溫攪拌；旋干甲酸，用生理鹽水和去離子水透析，冷 凍干燥，得到磷酸二膽堿化殼聚糖鹽酸鹽。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽的制備方法，其特征在于： 所述的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖中的氨基與膦酸酯的摩爾比為1 : (2~10)。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽的制備方法，其特征在于： 所述的攪拌反應(yīng)的條件為〇~40°C攪拌反應(yīng)4~24h。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽的制備方法，其特征在于： 所述的室溫攪拌的時間為0. 5~6h。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽的制備方法，其特征在于： 所述的反應(yīng)介質(zhì)為二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每l〇〇mL二甲 基乙酰胺中含有1~l〇g的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖，其中三乙胺、四氯化碳與6-0-三苯 基甲醚化殼聚糖的氨基摩爾比例為6 :4 :1。7. 權(quán)利要求1所述的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽在制備抗菌藥物或抗菌材料中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種磷酸二膽堿化殼聚糖鹽及其應(yīng)用，屬于抗菌高分子材料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的磷酸二膽堿化殼聚糖鹽在生理環(huán)境條件下具有顯著的廣譜抗菌效果，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，且對正常細(xì)胞無毒，不產(chǎn)生溶血，在醫(yī)療及健康護理領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值；可應(yīng)用于制備抗菌藥物或抗菌材料。
【IPC分類】A61P31/04, C08B37/00
【公開號】CN105384835
【申請?zhí)枴緾N201510769660
【發(fā)明人】曾戎, 曹兆羽, 屠美, 趙劍豪
【申請人】暨南大學(xué)
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年11月11日