甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明以摩爾濃度為0.0005～0.002mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為流動(dòng)相A，以摩爾濃度為0.03～0.05mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為流動(dòng)相B，采用二元梯度洗脫程序，對(duì)甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到雜質(zhì)甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇的含量；采用乙腈和水做為流動(dòng)相，對(duì)甘磷酸膽堿待測樣品進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到雜質(zhì)甘油磷脂酰乙醇胺的含量。本發(fā)明提供的檢測方法可針對(duì)不同的雜質(zhì)建立了不同的色譜條件進(jìn)行檢測，從而得到全部已知雜質(zhì)的含量，避免了僅測定部分雜質(zhì)就判斷甘磷酸膽堿質(zhì)量的片面性，實(shí)現(xiàn)了全面、有效的監(jiān)控甘磷酸膽堿質(zhì)量的目的。
【專利說明】甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，尤其涉及甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 老年癡呆癥是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退化性失調(diào)癥，其主要表現(xiàn)為記憶功能衰減及識(shí)別 能力障礙，同時(shí)伴有各種神經(jīng)癥狀和行為障礙。研究發(fā)現(xiàn)，我國老年癡呆癥發(fā)病率居高不 下，其中65歲老人中明顯癡呆者占2%?5%，而85歲以上的老人中幾乎一半患有不同程 度的老年癡呆癥。隨著世界人口老齡化速度的加快，老年癡呆癥已成為危及老年人生命的 第四大病因，嚴(yán)重影響了老年人的身體健康和生活質(zhì)量。因此，抗癡呆癥藥物的研究與開發(fā) 引起了世界各國醫(yī)藥界的高度重視。
[0003] 研究表明，老年癡呆癥的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的缺乏密切相關(guān)，如果能 夠提高腦內(nèi)乙酰膽堿的水平，就可以改善老年癡呆的癥狀。甘磷酸膽堿能夠穿過血腦屏障， 為乙酰膽堿的合成提供必要的膽堿源，促使乙酰膽堿的合成，增加了腦內(nèi)神經(jīng)突觸間的乙 酰膽堿的含量，從而將海馬區(qū)、腦皮質(zhì)和杏仁體與基底前腦區(qū)相聯(lián)系，延長膽堿能受體的作 用，達(dá)到治療老年癡呆癥的目的。甘磷酸膽堿在治療老年癡呆癥方面療效顯著，副作用少， 并且具有良好的耐受性和安全性，是一種非常具有市場前景的藥物。
[0004] 但是，甘磷酸膽堿在生產(chǎn)及儲(chǔ)存的過程中，由于不同的工藝因素和環(huán)境因素（如 溫度、氧化和光照等）的影響，有可能會(huì)產(chǎn)生一些雜質(zhì)，會(huì)直接影響藥品的質(zhì)量，所以，需要 一種分析方法，能夠?qū)Ω柿姿崮憠A中各種雜質(zhì)的種類及含量進(jìn)行檢測，從而達(dá)到控制甘磷 酸膽堿質(zhì)量的目的。目前還沒有能夠有效檢測甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測方法，本發(fā)明提供的甘磷酸膽堿中 雜質(zhì)的檢測方法能夠有效檢測出甘磷酸膽堿中的雜質(zhì)及其含量，實(shí)現(xiàn)控制甘磷酸膽堿質(zhì)量 的目的。
[0006] 本發(fā)明提供甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測方法，包括以下步驟：
[0007] 將甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸膽堿待測樣品溶 液的第一液相色譜圖；
[0008] 所述第一液相色譜檢測的流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B;所述流動(dòng)相A包括第 一甲酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的摩爾濃度為〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一 甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（1?10) : (99?90);
[0009] 所述流動(dòng)相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的摩爾濃度為 0? 03?0? 05mol/L，所述第二甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) : (65?55);
[0010] 根據(jù)所述第一液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽 堿待測樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇；
[0011] 將甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽堿待測樣品溶 液的第二液相色譜圖，所述第二液相色譜的流動(dòng)相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體積比 為（72 ?78) : (28 ?22);
[0012] 根據(jù)所述第二液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽 堿待測樣品中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰乙醇胺。
[0013] 優(yōu)選的，所述第一液相色譜檢測中的色譜柱為陽離子交換柱；
[0014] 所述第一液相色譜檢測色譜柱的柱溫為20?30°C;
[0015] 優(yōu)選的，所述第一液相色譜檢測中流動(dòng)相A的流速為0. 95?1. 05mL/min;
[0016] 所述流動(dòng)相B的流速為0? 95?1. 05mL/min。
[0017] 優(yōu)選的，所述第一液相色譜檢測采用梯度洗脫程序；
[0018] 所述梯度洗脫程序?yàn)椋?br> [0019] 在< 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（93?97) : (7?3);
[0020] 在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（45?55) : (55?45);
[0021] 在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（35?44) : (65?56);
[0022] 在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（0?5) : (100?95)。
[0023] 優(yōu)選的，所述流動(dòng)相A的pH值為2. 0?4. 0 ;
[0024] 所述流動(dòng)相B的pH值為4. 0?6. 0。
[0025] 優(yōu)選的，所述第二液相色譜檢測中流動(dòng)相的流速為0. 95?1. 05mL/min。
[0026] 優(yōu)選的，所述第二液相色譜檢測中流動(dòng)相的pH值為2. 0?4. 0。
[0027] 優(yōu)選的，所述第二液相色譜檢測中的色譜柱為氨基鍵合硅膠色譜柱；
[0028] 所述第二液相色譜檢測中色譜柱的柱溫為20?40°C。
[0029] 優(yōu)選的，所述第一液相色譜檢測的檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器；
[0030] 所述第一液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的噴霧器溫度為70?90°C;
[0031] 所述第一液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的載氣壓力為〇? 1?〇? 2MPa。
[0032] 優(yōu)選的，所述第二液相色譜檢測的檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器；
[0033] 所述第二液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的噴霧器溫度為70?90°C;
[0034] 所述第二液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的載氣壓力為0? 1?0? 2MPa。
[0035] 本發(fā)明以摩爾濃度為0. 0005?0. 002mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為 流動(dòng)相A，以摩爾濃度為0. 03?0. 05mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為流動(dòng)相B， 采用二元梯度洗脫程序，對(duì)甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸 膽堿中甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇的含量；采用乙腈和水做為流動(dòng)相，對(duì)甘磷酸膽堿 待測樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽堿中甘油磷脂酰乙醇胺的含量。本發(fā) 明提供的檢測方法可針對(duì)不同的雜質(zhì)建立了不同的色譜條件進(jìn)行檢測，從而得到全部已知 雜質(zhì)的含量，避免了僅測定部分雜質(zhì)就判斷甘磷酸膽堿質(zhì)量的片面性，實(shí)現(xiàn)了全面、有效的 監(jiān)控甘磷酸膽堿質(zhì)量的目的，同時(shí)，也提高了甘磷酸膽堿的質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)。
[0036] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的檢測方法能夠有效檢測出全部已知雜質(zhì)的含量，并 且經(jīng)過多次檢測后，同一物質(zhì)的保留時(shí)間基本不變，說明本發(fā)明提供的檢測方法具有良好 的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1得到的甘磷酸膽堿混合溶液第一液相色譜圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0039] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0040]圖4為本發(fā)明實(shí)施例4得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0041] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例5得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0042]圖6為本發(fā)明實(shí)施例6得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0043] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例7得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0044]圖8為本發(fā)明實(shí)施例8得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0045] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例9得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0046]圖10為本發(fā)明實(shí)施例10得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0047] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例11得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0048]圖12為本發(fā)明實(shí)施例12得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0049] 圖13為本發(fā)明實(shí)施例13得到的信噪比為3:1的甘磷酸膽堿待測樣品溶液第一次 進(jìn)樣的第一液相色譜圖；
[0050] 圖14為本發(fā)明實(shí)施例13得到的信噪比為3:1的甘磷酸膽堿待測樣品溶液第二次 進(jìn)樣的第一液相色譜圖；
[0051] 圖15為本發(fā)明實(shí)施例13得到的信噪比為3:1的甘磷酸膽堿待測樣品溶液第三次 進(jìn)樣的第一液相色譜圖；
[0052] 圖16為本發(fā)明實(shí)施例14得到的甘磷酸膽堿混合溶液在柱溫20°C下的第一液相色 譜圖；
[0053] 圖17為本發(fā)明實(shí)施例15得到的甘磷酸膽堿混合溶液在柱溫25°C下的第一液相色 譜圖；
[0054] 圖18為本發(fā)明實(shí)施例16得到的甘磷酸膽堿混合溶液在柱溫30°C下的第一液相色 譜圖；
[0055] 圖19為本發(fā)明實(shí)施例17得到的甘磷酸膽堿混合溶液在流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的流 速為0. 95mL/min時(shí)的第一液相色譜圖；
[0056] 圖20為本發(fā)明實(shí)施例18得到的甘磷酸膽堿混合溶液在流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的流 速為1. 05mL/min時(shí)的第一液相色譜圖；
[0057] 圖21為本發(fā)明實(shí)施例19得到的放置0小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一 液相色譜圖；
[0058] 圖22為本發(fā)明實(shí)施例20得到的放置2小時(shí)后甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液 相色譜圖；
[0059] 圖23為本發(fā)明實(shí)施例21得到的放置4小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一 液相色譜圖；
[0060] 圖24為本發(fā)明實(shí)施例22得到的放置8小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一 液相色譜圖；
[0061] 圖25為本發(fā)明實(shí)施例23得到的甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜 圖；
[0062] 圖26為本發(fā)明實(shí)施例24得到的氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖；
[0063] 圖27為本發(fā)明實(shí)施例25得到的甘油磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相色 譜圖；
[0064]圖28為本發(fā)明實(shí)施例26得到的甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相 色譜圖；
[0065]圖29為本發(fā)明實(shí)施例27得到的輔料標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖； [0066] 圖30為本發(fā)明實(shí)施例28得到的甘磷酸膽堿混合溶液a的第二液相色譜圖； [0067]圖31為本發(fā)明實(shí)施例29得到的空白溶劑的第二液相色譜圖；
[0068]圖32為本發(fā)明實(shí)施例30得到的甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二液相色譜 圖；
[0069]圖33為本發(fā)明比較例1得到的甘磷酸膽堿混合溶液的第二液相色譜圖；
[0070] 圖34為本發(fā)明比較例2得到的甘磷酸膽堿混合溶液的第二液相色譜圖；
[0071] 圖35為本發(fā)明比較例3得到的甘磷酸膽堿混合溶液的第二液相色譜圖；
[0072] 圖36為本發(fā)明比較例4得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0073] 圖37為本發(fā)明比較例5得到的氯化膽堿樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0074] 圖38為本發(fā)明比較例6得到的甘油磷脂酰肌醇樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0075] 圖39為本發(fā)明比較例7得到的甘油磷脂酰乙醇胺樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0076] 圖40為本發(fā)明比較例8得到的輔料樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0077] 圖41為本發(fā)明比較例9得到的甘磷酸膽堿混和樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0078] 圖42為本發(fā)明實(shí)施例31得到的放置0小時(shí)后甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液 相色譜圖；
[0079] 圖43為本發(fā)明實(shí)施例32得到的放置2小時(shí)后甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液 相色譜圖；
[0080] 圖44為本發(fā)明實(shí)施例33得到的放置4小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二 液相色譜圖；
[0081] 圖45為本發(fā)明實(shí)施例34得到的放置6小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二 液相色譜圖；
[0082] 圖46為本發(fā)明實(shí)施例35得到的放置8小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二 液相色譜圖；
[0083] 圖47為本發(fā)明實(shí)施例36得到的放置12小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第 二液相色譜圖；
[0084] 圖48為本發(fā)明實(shí)施例37得到的空白溶劑的第二液相色譜圖；
[0085]圖49為本發(fā)明實(shí)施例38得到的輔料樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0086] 圖50為本發(fā)明實(shí)施例39得到的空白溶劑的第一液相色譜圖；
[0087] 圖51為本發(fā)明實(shí)施例40得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液a的第一液相色譜圖；
[0088] 圖52為本發(fā)明實(shí)施例40得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液a的第一液相色譜圖；
[0089] 圖53為本發(fā)明實(shí)施例40得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液a的第二液相色譜圖； [0090]圖54為本發(fā)明實(shí)施例40得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液a的第二液相色譜圖； [0091]圖55為本發(fā)明實(shí)施例41得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液b的第一液相色譜圖；
[0092]圖56為本發(fā)明實(shí)施例41得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液b的第一液相色譜圖；
[0093] 圖57為本發(fā)明實(shí)施例41得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液b的第二液相色譜圖；
[0094] 圖58為本發(fā)明實(shí)施例41得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液b的第二液相色譜圖；
[0095] 圖59為本發(fā)明實(shí)施例42得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液c的第一液相色譜圖；
[0096] 圖60為本發(fā)明實(shí)施例42得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液c的第一液相色譜圖；
[0097] 圖61為本發(fā)明實(shí)施例42得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液c的第二液相色譜圖；
[0098] 圖62為本發(fā)明實(shí)施例42得到的甘磷酸膽堿待測樣品溶液c的第二液相色譜圖； [0099]圖63為本發(fā)明實(shí)施例43得到的市售甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖； [0100]圖64為本發(fā)明實(shí)施例43得到的市售甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖
[0101] 圖65為本發(fā)明實(shí)施例43得到的市售甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液相色譜圖；
[0102] 圖66為本發(fā)明實(shí)施例43得到的市售甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液相色譜 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0103] 本發(fā)明提供了甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測方法，包括以下步驟：
[0104] 將甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸膽堿待測樣品溶 液的第一液相色譜圖；
[0105] 所述第一液相色譜檢測的流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B;所述流動(dòng)相A包括第 一甲酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的摩爾濃度為〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一 甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（1?10) : (99?90);
[0106] 所述流動(dòng)相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的摩爾濃度為 0? 03?0? 05mol/L，所述第二甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) : (65?55);
[0107] 根據(jù)所述第一液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽 堿待測樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇；
[0108] 將甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽堿待測樣品溶 液的第二液相色譜圖，所述第二液相色譜的流動(dòng)相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體積比 為（72 ?78):(28 ?22);
[0109] 根據(jù)所述第二液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽 堿待測樣品中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰乙醇胺。
[0110] 本發(fā)明將甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸膽堿待測 樣品溶液的第一液相色譜圖。本發(fā)明優(yōu)選將甘磷酸膽堿待測樣品與水混合，得到甘磷酸膽 堿待測樣品溶液。在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為40?60g/ L，更優(yōu)選為50g/L。
[0111] 所述第一液相色譜檢測的進(jìn)樣量優(yōu)選為15?25yL，更優(yōu)選為17?23yL，最優(yōu) 選為20uL。
[0112] 在本發(fā)明中，所述第一液相色譜檢測的色譜柱優(yōu)選為陽離子交換柱，所述色譜柱 的填料優(yōu)選為硅膠，具體的，可以使用資生堂CAPCELLPAKSCX液相色譜柱；所述第一液相 色譜檢測的色譜柱柱溫優(yōu)選為20?30°C，更優(yōu)選為22?37°C，最優(yōu)選為25°C;
[0113] 在本發(fā)明中，所述第一液相色譜檢測的流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B。在本發(fā) 明中，所述流動(dòng)相A包括第一甲酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的濃度為0. 0005? 0. 002mol/L，優(yōu)選為0. 0008?0. 0015mol/L，更優(yōu)選為0.OOlmol/L;所述第一甲酸銨溶液和 乙腈的體積比為（1?10) : (99?90)，優(yōu)選為（1?5) : (99?95)，更優(yōu)選為1 :99 ;所述流 動(dòng)相A的pH值優(yōu)選為2. 0?4. 0,更優(yōu)選為2. 5?3. 5,最優(yōu)選為3. 0 ;本發(fā)明優(yōu)選采用酸 性介質(zhì)對(duì)所述流動(dòng)相A的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述酸性介質(zhì)優(yōu)選為甲酸；本發(fā)明優(yōu)選采用酸性 溶液作為酸性介質(zhì)，本發(fā)明對(duì)所述酸性溶液的濃度和用量沒有特殊的限制，能夠?qū)⑺隽?動(dòng)相A的pH值調(diào)節(jié)至上述范圍即可。
[0114] 在本發(fā)明中，所述流動(dòng)相A的流速優(yōu)選為0. 95?1. 05mL/min，更優(yōu)選為0. 98? L02mL/min,最優(yōu)選為lmL/min〇
[0115] 在本發(fā)明中，所述流動(dòng)相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的 濃度為〇. 03?0. 05mol/L，優(yōu)選為0. 035?0. 045mol/L，更優(yōu)選為0. 04mol/L;所述第二 甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) : (65?55)，優(yōu)選為（38?43) : (62?57)，更優(yōu) 選為40 :60 ;所述流動(dòng)相B的pH值優(yōu)選為4. 0?6. 0,更優(yōu)選為4. 5?5. 5,最優(yōu)選為5. 0 ; 本發(fā)明優(yōu)選采用酸性介質(zhì)對(duì)所述流動(dòng)相B的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述酸性介質(zhì)優(yōu)選為甲酸；本 發(fā)明優(yōu)選采用酸性溶液作為酸性介質(zhì)，本發(fā)明對(duì)所述酸性溶液的濃度和用量沒有特殊的限 制，能夠?qū)⑺隽鲃?dòng)相B的pH值調(diào)節(jié)至上述范圍即可。
[0116] 在本發(fā)明中，所述流動(dòng)相B的流速優(yōu)選為0. 95?1. 05mL/min，更優(yōu)選為0. 98? L02mL/min,最優(yōu)選為lmL/min〇
[0117] 在本發(fā)明中，所述第一液相色譜檢測優(yōu)選采用梯度洗脫程序，所述梯度洗脫程序 優(yōu)選為：
[0118] 在< 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（93?97):(7?3);
[0119] 在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（45?55):(55?45);
[0120] 在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（35?44) : (65?56);
[0121] 在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（0?5) : (100?95)。
[0122] 更優(yōu)選為：
[0123] 在< 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（94?96):(6?4);
[0124] 在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（47?53):(53?47);
[0125] 在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（47?53):(53?47);
[0126] 在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（0?3) : (100?97);
[0127] 最優(yōu)選為：
[0128] 在< 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為95 :5;
[0129] 在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為50 :50;
[0130] 在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為40 :60;
[0131] 在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為0 :100。
[0132] 所述第一液相色譜檢測的檢測器優(yōu)選為蒸發(fā)光散射檢測器，所述第一液相色譜檢 測中蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度優(yōu)選為60?100°C，更優(yōu)選為70?90°C，最優(yōu)選為 80°C;所述第一液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器優(yōu)選氮?dú)庾鳛殪F化氣；所述霧化氣的壓 力優(yōu)選為〇. 1?〇. 2MPa，更優(yōu)選為0. 13?0. 18MPa，最優(yōu)選為0. 15MPa;所述霧化氣的流速 優(yōu)選為2?3L/min，更優(yōu)選為2. 5L/min;所述第一液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的噴 霧器溫度優(yōu)選為70?90°C，更優(yōu)選為80°C;。
[0133] 得到甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖后，本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿 待測樣品溶液的第一液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽堿 待測樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇。本發(fā)明 優(yōu)選對(duì)所述第一雜質(zhì)進(jìn)行定量檢測前，對(duì)所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液第一液相色譜圖中 的色譜峰進(jìn)行定性，即對(duì)出峰位置進(jìn)行定位；
[0134] 本發(fā)明優(yōu)選將所述第一雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到第一雜 質(zhì)的第一液相色譜圖，將所述第一雜質(zhì)的第一液相色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間與所述甘磷 酸膽堿待測樣品溶液第一液相色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)所述甘磷酸膽堿 待測樣品溶液第一液相色譜圖中色譜峰的定性。
[0135] 在本發(fā)明中，所述第一標(biāo)準(zhǔn)曲線為第一雜質(zhì)的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積之 間的線性曲線，所述第一標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)選按照以下方法獲得：
[0136] 配制系列濃度的第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品為第一雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品；
[0137] 將所述系列濃度的第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到系列的第一標(biāo) 準(zhǔn)液相色譜圖；
[0138] 將所述系列的第一標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖中第一雜質(zhì)的色譜峰面積與其對(duì)應(yīng)的第一雜 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度進(jìn)行線性擬合，得到第一標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0139] 在本發(fā)明中，所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液包括甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液、氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品 溶液和甘油磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。在本發(fā)明中，所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液可以是各組分 獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，也可以是各組分的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。本發(fā)明優(yōu)選將甘油的純品溶 于水，配制得到系列濃度的甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。本發(fā)明對(duì)所述甘油純品的來源沒有特殊的 限制，采用甘油純品的市售商品即可。在本發(fā)明中，所述甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選 為1?5mg/mL，更優(yōu)選為2?4mg/mL，最優(yōu)選為3mg/mL。
[0140] 得到所述系列濃度的甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液后，本發(fā)明優(yōu)選將得到的系列濃度的甘油 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第一標(biāo)準(zhǔn)液相色譜 圖。
[0141] 得到所述甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第一標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖后，本發(fā)明優(yōu)選以所述甘 油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第一標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖中的峰面積為縱坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的甘油標(biāo)準(zhǔn)樣 品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到峰面積和質(zhì)量濃度的曲線，將所述曲線進(jìn)行線性擬合，得 到甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線。在本發(fā)明中，所述峰面積優(yōu)選采用積分得到，本發(fā)明 對(duì)所述積分的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的計(jì)分方法即可。本發(fā)明對(duì) 所述線性擬合的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的線性擬合的方法即可。
[0142] 本發(fā)明優(yōu)選按照上述技術(shù)方案，得到所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中除甘油外的其他已 知雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線和甘 油磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同的是，在本發(fā)明中，所述氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣 品溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為〇. 05?0. 45g/L，所述甘油磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的質(zhì)量濃度 優(yōu)選為〇? 05?0? 45g/L。
[0143] 得到所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線后，本發(fā)明根據(jù)所述第一標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液中第一雜質(zhì)的質(zhì)量濃度；根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測樣品 的質(zhì)量、所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的質(zhì)量、與所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液中第一雜 質(zhì)的質(zhì)量濃度，得到所述甘磷酸膽堿待測樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油。 氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇。
[0144] 除了已知的甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇以外，所述第一雜質(zhì)中優(yōu)選還包括 未知雜質(zhì)。所述未知雜質(zhì)包括在酸、堿和光照等條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)。本發(fā)明優(yōu)選將所述甘 磷酸膽堿樣品進(jìn)行第一主成分自身對(duì)照檢測，以得到所述甘磷酸膽堿樣品中未知雜質(zhì)的含 量，包括以下步驟：
[0145] 1)提供甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液；
[0146] 2)將所述步驟1)中的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)色譜儀靈敏度；
[0147] 3)將所述步驟1)中的甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液分別進(jìn)行 第一液相色譜檢測，得到所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì) 照溶液的第一液相色譜圖；
[0148] 4)根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液 的第一液相色譜圖，得到甘磷酸膽堿待測樣品溶液中未知雜質(zhì)的含量。
[0149] 在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的來源與質(zhì)量濃度與上述技術(shù)方案中 甘磷酸膽堿待測樣品溶液的來源和質(zhì)量濃度一致，在此不再贅述。本發(fā)明優(yōu)選將所述甘磷 酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行稀釋，得到甘磷酸膽堿對(duì)照溶液。在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿對(duì) 照溶液與所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的質(zhì)量濃度之比優(yōu)選為1 :1〇〇。
[0150] 得到所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液后，本發(fā)明將所述甘磷 酸膽堿對(duì)照溶液注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10? 25 %，優(yōu)選為20%。在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的進(jìn)樣量優(yōu)選為20yL。
[0151] 靈敏度調(diào)節(jié)完畢后，本發(fā)明將所述步驟1)中的甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷 酸膽堿對(duì)照溶液分別進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液 相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖。在本發(fā)明所述的第一主成分自身對(duì)照 檢測中，所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖的記錄時(shí)間優(yōu)選為主成分色譜峰 保留時(shí)間的2倍；所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖中如有甘油、甘油磷脂 酰肌醇和氯化膽堿雜質(zhì)峰，其峰面積不得大于所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖 中主峰面積的一半，即不得大于所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖中主峰面 積的0. 5% ;其他任一雜質(zhì)峰峰面積不得大于所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖 中主峰面積的1/5,即不得大于所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖中主峰面 積的0. 2% ;各雜質(zhì)峰面積之和不得大于所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖中主 峰面積的兩倍，即不得大于所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖中主峰面積的 2. 0%。
[0152] 本發(fā)明優(yōu)選按照上述獲得甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線的技術(shù)方案，得到甘 磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明根據(jù)得到的甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第 一標(biāo)準(zhǔn)曲線和所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色譜圖中甘磷酸膽堿對(duì)應(yīng)的峰面 積，得到所述甘磷酸膽堿待測樣品中甘磷酸膽堿的含量。
[0153] 得到所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖后， 本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測樣品中甘磷酸膽堿的含量、所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液與所 述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的質(zhì)量濃度之比、所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第一液相色 譜圖中未知雜質(zhì)的峰面積和所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液第一液相色譜圖中甘磷酸膽堿的峰 面積，得到所述甘磷酸膽堿待測樣品中未知雜質(zhì)的含量。
[0154] 本發(fā)明將甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽堿待測 樣品溶液的第二液相色譜圖。本發(fā)明優(yōu)選將甘磷酸膽堿待測樣品與水混合，得到甘磷酸膽 堿待測樣品溶液。在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為40?60g/ L，更優(yōu)選為50g/L。
[0155] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測的進(jìn)樣量優(yōu)選為15?25yL，更優(yōu)選為17? 23iiL，最優(yōu)選為20iiL。
[0156] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測的色譜柱優(yōu)選為氨基鍵合硅膠色譜柱；所述 第二液相色譜檢測的色譜柱柱溫優(yōu)選為20?40°C，更優(yōu)選為30°C。
[0157] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測的流動(dòng)相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體 積比為（72?78) : (28?22)，優(yōu)選為（73?77) : (27?23)，更優(yōu)選為75 :25 ;所述第二液 相色譜檢測中流動(dòng)相的pH值優(yōu)選為2. 0?4. 0,更優(yōu)選為2. 5?3. 5,最優(yōu)選為3. 0 ;本發(fā)明 優(yōu)選采用酸性介質(zhì)對(duì)所述第二液相色譜檢測的流動(dòng)相的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述酸性介質(zhì)優(yōu) 選為冰醋酸；本發(fā)明優(yōu)選采用酸性溶液作為酸性介質(zhì)，本發(fā)明對(duì)所述酸性溶液的濃度和用 量沒有特殊的限制，能夠?qū)⑺龅诙合嗌V檢測中流動(dòng)相的pH值調(diào)節(jié)至上述范圍即可。
[0158] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測中流動(dòng)相的流速優(yōu)選為0. 95?1. 05mL/min， 更優(yōu)選為〇. 98?1. 03mL/min，最優(yōu)選為lmL/min。
[0159] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測的檢測器優(yōu)選為蒸發(fā)光散射檢測器，所述第 二液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度優(yōu)選為60?100°C，更優(yōu)選為70? 90°C，最優(yōu)選為80°C;所述第二液相色譜檢測中的蒸發(fā)光散射檢測器優(yōu)選氮?dú)庾鳛殪F化氣； 所述霧化氣的壓力優(yōu)選為〇. 1?〇. 2MPa，更優(yōu)選為0. 13?0. 18MPa，最優(yōu)選為0. 15MPa;所 述霧化氣的流速優(yōu)選為2?3L/min，更優(yōu)選為2. 5L/min;所述第二液相色譜檢測中蒸發(fā)光 散射檢測器的噴霧器溫度優(yōu)選為70?90°C，更優(yōu)選為80°C;
[0160] 得到甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液相色譜圖后，本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿 待測樣品溶液的第二液相色譜圖與預(yù)定的第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸 膽堿待測樣品溶液中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰乙醇胺。本發(fā)明優(yōu)選 對(duì)所述第二雜質(zhì)進(jìn)行定量檢測前，對(duì)所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液第二液相色譜圖中的色 譜峰進(jìn)行定性，即對(duì)出峰位置進(jìn)行定位；
[0161] 本發(fā)明優(yōu)選將所述第二雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到第二雜 質(zhì)的第二液相色譜圖，將所述第二雜質(zhì)的第二液相色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間與所述甘磷 酸膽堿待測樣品溶液第二液相色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)所述甘磷酸膽堿 待測樣品溶液第二液相色譜圖中色譜峰的定性。
[0162] 在本發(fā)明中，所述第二標(biāo)準(zhǔn)曲線為第二雜質(zhì)的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積之 間的線性曲線，所述第二標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)選按照以下方法獲得：
[0163] 配制系列濃度的第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，所述第二標(biāo)準(zhǔn)樣品為第二雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品；
[0164] 將所述系列濃度的第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到第二標(biāo)準(zhǔn)樣品 溶液的系列第二液相色譜圖；
[0165] 將所述第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖中第二雜質(zhì)的色譜峰面積 與其對(duì)應(yīng)的第二雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度進(jìn)行線性擬合，得到第二標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0166] 在本發(fā)明中，所述第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液包括甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。在本 發(fā)明中，所述甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的來源和質(zhì)量濃度與上述技術(shù)方案中甘油磷 脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的來源和質(zhì)量濃度一致，在此不再贅述。
[0167] 得到所述系列濃度的第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液后，本發(fā)明優(yōu)選將得到的系列濃度甘油磷 脂酰乙醇胺樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到甘油磷脂酰乙醇胺樣品溶液的系列第二 標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖。
[0168] 得到所述甘油磷脂酰乙醇胺的系列第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖后，本發(fā)明優(yōu)選以所述甘 油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖中的峰面積為縱坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng) 的甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到峰面積和質(zhì)量濃度的曲線， 將所述曲線進(jìn)行線性擬合，得到甘油磷脂酰乙醇胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在本發(fā)明中，所述峰面積優(yōu) 選采用積分得到，本發(fā)明對(duì)所述積分的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的 計(jì)分方法即可。本發(fā)明對(duì)所述線性擬合的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的線性擬合的方法即可。
[0169] 得到所述甘油磷脂酰乙醇胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測樣品 溶液的第二液相色譜圖與所述甘油磷脂酰乙醇胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到所述甘磷酸膽堿待測 樣品溶液中甘油磷脂酰乙醇胺的質(zhì)量濃度；根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測樣品的質(zhì)量、所述甘 磷酸膽堿待測樣品溶液的質(zhì)量與所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液中甘油磷脂酰乙醇胺的質(zhì) 量濃度，得到所述甘磷酸膽堿待測樣品中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰 乙醇胺。
[0170] 除了已知雜質(zhì)甘油磷脂酰乙醇胺外，所述第二雜質(zhì)還包括未知雜質(zhì)。所述未知雜 質(zhì)包括在酸、堿和光照等條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)。本發(fā)明優(yōu)選將所述甘磷酸膽堿樣品進(jìn)行第二 主成分自身對(duì)照檢測，以得到所述甘磷酸膽堿樣品中未知雜質(zhì)的含量，包括以下步驟：
[0171] I)提供甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液；
[0172] II)將所述步驟I)中的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)色譜儀靈敏 度；
[0173] III)將所述步驟I)中的甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液分別進(jìn) 行第二液相色譜檢測，得到所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液 相色譜圖；
[0174] IV)根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì)照溶 液的第二液相色譜圖，得到甘磷酸膽堿待測樣品溶液中未知雜質(zhì)的含量。
[0175] 本發(fā)明按照上述技術(shù)方案得到甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液， 并按照上述技術(shù)方案將所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)靈敏度。
[0176] 靈敏度調(diào)節(jié)完畢后，本發(fā)明將所述步驟I)中的甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷 酸膽堿對(duì)照溶液分別進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液 相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液相色譜圖。在所述第二主成分自身對(duì)照檢測中， 所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液相色譜圖中如有甘油磷脂酰乙醇胺雜質(zhì)峰，其峰 面積不得大于所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液相色譜圖主峰面積的〇.5倍，即不得大于 所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液相色譜圖主峰面積的〇. 5%。
[0177] 本發(fā)明優(yōu)選按照上述獲得第二標(biāo)準(zhǔn)曲線的技術(shù)方案，得到甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶 液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明根據(jù)得到的甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線和所述甘 磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液相色譜圖中甘磷酸膽堿對(duì)應(yīng)的峰面積，得到所述甘磷酸膽 堿待測樣品中甘磷酸膽堿的含量。
[0178] 得到所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液相色譜圖后， 本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測樣品中甘磷酸膽堿的含量、所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液與所 述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的質(zhì)量濃度之比、所述甘磷酸膽堿待測樣品溶液的第二液相色 譜圖中未知雜質(zhì)的峰面積和所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液第二液相色譜圖中甘磷酸膽堿的峰 面積，得到所述甘磷酸膽堿待測樣品中未知雜質(zhì)的含量。
[0179] 本發(fā)明提供的檢測方法不僅能檢測出甘磷酸膽堿中已知雜質(zhì)甘油、氯化膽堿、甘 油磷脂酰肌醇和甘油磷脂酰乙醇胺的含量，還能檢測出在酸、堿和光照等條件下可能產(chǎn)生 的未知雜質(zhì)的含量，避免了僅測定部分雜質(zhì)就判斷甘磷酸膽堿質(zhì)量的片面性，實(shí)現(xiàn)了全面、 有效的監(jiān)控甘磷酸膽堿質(zhì)量的目的。
[0180] 為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢 測方法進(jìn)行詳細(xì)描述，但不能將它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0181] 在下述實(shí)施例中，所用乙腈購自MREDATECHNOLOGYINC公司，純度為色譜純，甲酸 銨購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度為分析純，甲酸購自北京化工廠，純度為分析純， 乙酸購自北京化工廠，純度為分析純。
[0182] 實(shí)施例1
[0183] 將甘磷酸膽堿、氯化膽堿、甘油磷脂酰肌醇、空膠囊殼和甘油與水混合，混合均 勻后進(jìn)行過濾，得到甘磷酸膽堿混合溶液A，每lmL甘磷酸膽堿混合溶液中含甘磷酸膽堿 50mg、氯化膽堿0. 25mg、甘油磷脂酰肌醇0. 25mg、空膠囊殼50mg、甘油3mg。
[0184] 取20L所述甘磷酸膽堿混合溶液A，注入島津液相色譜儀，采用Alltech2000ES 型蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測。
[0185] 島津液相色譜儀采用LC-lOATvp型泵，CBM-20A型控制器，CLASS-VP型色譜工作 站；
[0186]Alltech2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度為，噴霧器溫度為80°C，霧化 氣為氮?dú)猓F化氣流速為2. 5L/min，載氣壓力為0? 15MPa;
[0187] 色譜條件為：資生堂CAPCELLPAKSCX色譜柱，色譜柱填料顆粒大小5iim，色譜柱 尺寸為4. 6X250mm;采用二元梯度洗脫程序，如表1所示，表1為本發(fā)明實(shí)施例1采用的二 元梯度洗脫程序。流動(dòng)相A為體積比為99:1的乙腈和摩爾濃度為0. 001m〇l/L甲酸銨溶液， 流速為1.OmL/min，用甲酸調(diào)節(jié)pH值為3. 0 ;流動(dòng)相B為體積比為60:40的乙腈和摩爾濃度 為0. 04mol/L甲酸銨溶液，流速為1.OmL/min，用甲酸調(diào)節(jié)pH值為5. 0 ;
[0188] 表1本發(fā)明實(shí)施例1采用的二元梯度洗脫程序
[0189]

【權(quán)利要求】
1. 甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測方法，包括以下步驟： 將甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測，得到甘磷酸膽堿待測樣品溶液的 第一液相色譜圖； 所述第一液相色譜檢測的流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B ;所述流動(dòng)相A包括第一甲 酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的摩爾濃度為〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一甲酸 銨溶液和乙腈的體積比為（1?10) : (99?90); 所述流動(dòng)相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的摩爾濃度為0. 03? 0.05mol/L，所述第二甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) :(65?55); 根據(jù)所述第一液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽堿待 測樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇； 將甘磷酸膽堿待測樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測，得到甘磷酸膽堿待測樣品溶液 的第二液相色譜圖，所述第二液相色譜的流動(dòng)相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體積比為 (72 ?78) : (28 ?22); 根據(jù)所述第二液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽堿待 測樣品中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰乙醇胺。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述第一液相色譜檢測中的色譜柱 為陽離子交換柱； 所述第一液相色譜檢測色譜柱的柱溫為20?30°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述第一液相色譜檢測中流動(dòng)相A的 流速為 〇? 95 ?1. 05mL/min ; 所述流動(dòng)相B的流速為0. 95?1. 05mL/min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于，所述第一液相色譜檢測 采用梯度洗脫程序； 所述梯度洗脫程序?yàn)椋? 在< 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（93?97) : (7?3); 在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（45?55) : (55?45); 在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（35?44) : (65?56); 在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（0?5) : (100?95)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述流動(dòng)相A的pH值為2. 0?4. 0 ; 所述流動(dòng)相B的pH值為4. 0?6. 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述第二液相色譜檢測中流動(dòng)相的 流速為 〇? 95 ?1. 05mL/min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述第二液相色譜檢測中流動(dòng)相的 pH值為2. 0?4. 0。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述第二液相色譜檢測中的色譜柱 為氨基鍵合硅膠色譜柱； 所述第二液相色譜檢測中色譜柱的柱溫為20?40°C。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述第一液相色譜檢測的檢測器為 蒸發(fā)光散射檢測器； 所述第一液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的噴霧器溫度為70?90°C ; 所述第一液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的載氣壓力為〇. 1?〇. 2MPa。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述第二液相色譜檢測的檢測器為 蒸發(fā)光散射檢測器； 所述第二液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的噴霧器溫度為70?90°C ; 所述第二液相色譜檢測中蒸發(fā)光散射檢測器的載氣壓力為〇. 1?〇. 2MPa。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104458942SQ201410698223
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】傅超婷, 云沖, 劉五生, 李錦云, 朱峰, 王玉娟, 李富志 申請(qǐng)人:海南通用三洋藥業(yè)有限公司