毒之背景噪音峰。
[0104] 由圖3分析可知，本試劑盒對正常人咽拭子樣本、或者CA16、CA6、CA7、CA9、CB2、 CB5、CB13、EC冊19W及EV71感染樣本并無擴增曲線，檢測結果均為陰性，陰性符合率為100%，說明該試劑盒具有良好的特異性W及具有很高的準確性。 陽105] 實施例3 陽106] 本實施例提供一種柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒，其組成同實施例 1的試劑盒相同，檢測步驟和方法也與實施例1相同，本試劑盒的內(nèi)標擴增曲線圖如圖4所 示，說明本實施例提供檢測試劑盒的PNA提取擴增方法不會產(chǎn)生抑制特異性PCR反應之物 質(zhì)，能有效監(jiān)控反應。 陽107] 實施例4
[0108] 本實施例提供的柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒，其組成同實施例1 的試劑盒相同，檢測步驟和方法也與實施例1相同，本試劑盒的標本稀釋擴增曲線圖如圖5 所示，圖中所示Ct值最小為40左右，則該試劑的檢測靈敏度為Ct40,所W通過實驗證明，該 試劑盒可W在樣本濃度極低的情況下檢測。
[0109] 綜上分析可知，本發(fā)明提供的柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒僅能檢 測出CA10-RNA，而不能檢測出其他病原體RNA，并且檢測靈敏度、準確度和穩(wěn)定性高，檢測 靈敏度可達50copie/ml，檢測范圍為5. 00E+01~5. 00E+09copies/ml，為期診斷柯薩奇病 CA10型感染提供可靠的實驗證據(jù)。
【主權項】
1. 一種柯薩奇病毒CA10型熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括以下各組分： RNA提取溶液、RNA洗脫液、RT-PCR增強劑、內(nèi)標、PCR反應液、CA10陽性對照品、CA10陰性 對照品，其中，所述內(nèi)標為插入PUC18T載體的長為128堿基對的人工合成DNA序列的重組 體，濃度為1. 00E+04copies/ml~5. 00E+04copies/ml;128堿基對的序列如下所示： 5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCG CCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3' 。2. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述RNA提取溶液包括如下組分： RNA提取溶液I:十二烷基硫酸鈉，質(zhì)量/體積0.2 %~1.0%、曲拉通，體積/體積 1. 0%~4. 0%，異硫氰酸胍 0· 2mol/L~1.Omol/L、100μg/ml~400μg/ml的磁珠； RNA提取溶液II:4-羥乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L~300mmol/L、pH6. 5±0. 2,氯化鈉 100mmol/L~300mmol/L； RNA提取溶液III:曲拉通，體積/體積0. 1 %~1. 0%、氯化鈉100mmol/L~300mmol/L； RNA提取溶液IV:礦物油。3. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述RNA洗脫液為 Tris-HC10· 8mol/L~1. 2mol/L、EDTA0.lmol/L~1. 0mol/L〇4. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR增強劑為Μη(OAc) 2， 其濃度為 10Ommol/],~500mmol/L。5. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液包括5XPCR反應 緩沖液，〇. 2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，1U/μ1~5U/μ1TthDNA聚合酶，1U/μ1~5U/ μLH-TaqDNA聚合酶，0.2ymol/L~0.4ymol/L用于靶多核苷酸擴增的上游引物以及下 游引物，〇· 2ymol/L~0· 4ymol/L用于革巴多核苷酸檢測的探針，0· 1ymol/L~0· 2μπιο?/ L用于擴增內(nèi)標的上游引物以及下游引物，0· 05ymol/L~0· 2ymol/L用于檢測內(nèi)標的探 針。6. 根據(jù)權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述所述用于靶多核苷酸擴增的 上下游引物及用于靶多核苷酸檢測的探針，其堿基對序列分別為： 上游引物：5'-AGAGCTATTAGCAGTGCTACAAATG-3' ； 下游引物：5'-TCCAGTCTCTAATCGGTGTGAAC-3' ； 探針 1 :5'FAM-TGAATCCGCAGCCAACACCACTCC-BHQ13'。7. 根據(jù)權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于擴增內(nèi)標的上游引物以 及下游引物以及用于檢測內(nèi)標的探針，其堿基對序列分別為： 上游引物：5'-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3' ； 下游引物：5'-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3' ； 探針：5'HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13'。8. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述CA10陽性對照品為CA10病毒 基因體外轉(zhuǎn)錄RNA，其濃度為1. 00~5. 00E+05copies/ml。9. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述CA10陰性對照品為經(jīng)過滅菌 處理的生理鹽水。10. 使用根據(jù)權利要求1-9任一項所述的檢測試劑盒用于檢測樣本中CA10-RNA的方 法，包括如下步驟： (1) 試劑準備； 按照提取試劑1200μ1~lml/人份，CA10-內(nèi)標1μ1/人份的比例，取相應量的RNA提 取溶液I及CA10-內(nèi)標，充分混勻得提取溶液Ι-mix，瞬時離心后備用； 根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，按照PCR反應液49μ1/人份，RT-PCR增強 劑1μ1/人份的比例，取相應量的PCR反應液及RT-PCR增強劑，充分混勻，得PCR-mix，瞬時 離心后備用； (2) RNA提?。捍胖榉ㄌ崛A10-RNA; S01裂解病毒：準備無核酸酶的1. 5mL離心管，每管加入200μ1~lmlRNA提取溶液 1-mix，然后加入100μ1~lml待測樣本，蓋上管蓋，震蕩混勻，瞬時離心后備用； S02磁珠吸附核酸：在步驟S01瞬時離心后備用的溶液中加入50μ1~400μ1RNA提 取溶液II，震蕩混勻，室溫靜置10~30分鐘； S03去除雜質(zhì)：靜止結束后瞬時離心后，將離心管置于磁珠分離器上，2~5分鐘后緩慢 將溶液吸出棄用，保留磁珠備用； S04洗滌：在備用的磁珠內(nèi)加入400μ1~lmlRNA提取溶液III和100μ1~500μ1RNA提取溶液IV，震蕩混勻，瞬時離心后將離心管再次置于分離器上； S05靜止2~5分鐘后，上清液分為兩層，將吸頭插入離心管底部，從底部開始緩慢將液 體完全吸出丟棄，靜置，將管底殘余液體完全吸出丟棄，磁珠保留備用； S06在上述保留備用的磁珠中加入10μ1~100ulRNA洗脫液，將離心管壁上磁珠洗脫 到管底，吸打混勻，室溫靜置5~30分鐘后將離心管再次置于分離器上2~5分鐘，然后將 洗脫下來的RNA吸至新的1. 5ml滅菌離心管中； S07根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，每個0. 2mLPCR反應管加入45μ1PCR-mix，并吸取步驟S06的新的滅菌離心管中已處理的樣本RNA、陰性對照、陽性對照各 5μ1加入PCR-mix中，蓋好管蓋，形成待測樣品； (3) 熒光PCR反應和結果分析： 選擇FAM通道（Reportere:FAM,Quencher:None)檢測CA10 ;選擇HEX或VIC通道 (Reporter:VIC,Quencher:None)檢測內(nèi)標；利用儀器自帶的軟件進行自動分析或者手動 調(diào)芐基線的開始值、結束值以及閾值線值進行分析，然后記錄樣本Ct值結果，根據(jù)各樣本 Ct值大小，判斷檢測結果。
【專利摘要】本發(fā)明實施例公開了一種柯薩奇病毒CA10型熒光定量PCR檢測試劑盒，其包括以下各組分：RNA提取溶液、RNA洗脫液、RT-PCR增強劑、內(nèi)標、PCR反應液、CA10陽性對照品、CA10陰性對照品；本發(fā)明提供的柯薩奇病毒CA10型熒光定量PCR檢測試劑盒僅僅能檢測出CA10-RNA，而不能檢測出其他病原體RNA，并且檢測靈敏度、準確度和穩(wěn)定性高，檢測靈敏度可達50copie/ml，檢測范圍為5.00E+01～5.00E+09copies/ml，為早期診斷柯薩奇病CA10型感染提供可靠的實驗證據(jù)。
【IPC分類】C12Q1/70, C12R1/93, C12Q1/68
【公開號】CN105331748
【申請?zhí)枴緾N201510920462
【發(fā)明人】戴立忠, 丁海, 周雷, 劉佳
【申請人】湖南圣湘生物科技有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年12月11日