一種快速鑒別小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的hrm檢測方法及引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及一種快速鑒別小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒 病毒的HRM檢測方法及引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 小鼠腦脊髓炎病毒（Theiler'Smurineenc巧halomyelitisvirus,TMEV)屬于微 RNA病毒科，屯、病毒屬（仍ri/ioKir化?)。核酸為負(fù)鏈單股RNA，基因組大小約SlOObp。小鼠 腦脊髓炎病毒在小鼠群中廣泛存在，感染率達(dá)8%~35%。該病毒多數(shù)呈隱性感染，主要侵害 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腦脊髓炎，臨床表現(xiàn)為后肢麻搏，偶爾波及前肢。近年研究發(fā)現(xiàn)，大 鼠也可W自然感染TMEV病毒，大鼠乳鼠腦內(nèi)接種TMEV病毒可W導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生后肢擁痕、被 毛蓬亂和體重減輕等癥狀。TMEV不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身造成危害，還對(duì)科學(xué)研究工作造成潛 在干擾，是國標(biāo)中SPF級(jí)小鼠需要排除的病原體。
[0003] 目前，TMEV感染診斷方法主要是免疫學(xué)檢測方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)、 免疫酶試驗(yàn)（IEA)和免疫巧光試驗(yàn)（IFA)等，但是運(yùn)些方法中不能應(yīng)用于免疫功能低下或 免疫缺陷動(dòng)物如SCID小鼠、裸小鼠和裸大鼠等的檢測，因?yàn)樗鼈儾荒墚a(chǎn)生正常的抗體反 應(yīng)，此外，抗體檢測方法不適用于病毒早期感染的診斷?？乖瓩z測方面常規(guī)病毒分離鑒定方 法既復(fù)雜又繁瑣，不利于日常檢測。普通RT-PCR方法具有快速、簡便、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，已 成為TMEV病毒感染診斷的重要手段。
[0004] 大鼠泰勒病毒（Rattheilovirus，RTV)，也稱為大鼠疑似泰勒病毒 (Theiler's-Ukevirusofrats)或大鼠腦脊髓炎病毒（Ratence曲alomyelitisvirus), 是近些年新發(fā)現(xiàn)一種感染大鼠的屯、病毒屬病毒。RTV的理化特征與TMEV相似，而且RTV與 TMEV之間有抗原交叉反應(yīng)。最近研究報(bào)道表明RTV是目前大鼠流行的病毒之一，感染率為 0.6%~54. 4%。國外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)和國內(nèi)一些CR0公司都把RTV列為日常健康監(jiān)測中的一 個(gè)常規(guī)檢測項(xiàng)目。目前RTV的檢測方法主要是化ISA方法，但是一些檢測機(jī)構(gòu)采用TMEV作 為包被抗原進(jìn)行大鼠RTV檢測，因此不能鑒別是TMEV感染還是RTV感染。PCR檢測也是RTV 診斷的一種有效方法。
[0005] 綜上所述，TMEV和RTV主要包括免疫學(xué)檢測方法和核酸檢測方法。免疫學(xué)方法主 要是檢測血清中是否存TMEV和RTV的特異性抗體，具體是用ELISA、IFA和MFIA等方法進(jìn) 行檢測，然而運(yùn)種方法必須是建立在已經(jīng)發(fā)生病毒感染并產(chǎn)生抗體的基礎(chǔ)上，而且鑒于上 述兩種病毒之間有抗原交叉性，其特異性難W保證，因此不能進(jìn)行鑒別。核酸檢測方法具有 快速、靈敏、特異、直觀等特點(diǎn)，消除了常規(guī)免疫學(xué)檢測方法中非特異性因素的干擾及敏感 性問題，可W對(duì)TMEV和RTV進(jìn)行鑒別診斷。常用的核酸檢測方法主要包括普通PCR方法和 巧光定量PCR檢測方法。普通PCR方法需要開蓋對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，操作方法不夠 簡化，而且容易產(chǎn)生氣溶膠污染，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。巧光定量PCR檢測方法需要設(shè)計(jì)巧光標(biāo) 記探針，價(jià)格比較昂貴，限制了該方法的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述存在的問題，本發(fā)明建立了一種快速鑒別小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠 泰勒病毒的HRM檢測方法及引物。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種快速鑒別小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM檢測方法的引物，其核巧酸序 列如下所示： 上游引物P1:ATTTGAAAGCAATGGTTAGC(沈QIDN0:1); 下游引物P2:GATCGAGAGGATGTTCATCTAA(沈QIDN0:2)。
[0008] -種快速鑒別小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM檢測試劑盒，所述試劑盒 含有上述引物。
[0009] -種快速鑒別小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM檢測方法，包括W下步 驟： 1) 從樣品中提取病毒核酸； 2) W核酸為模板，用上述引物對(duì)P1和P2W及巧光飽和染料，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲 得擴(kuò)增產(chǎn)物； 3) 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定病毒類型。
[0010] 優(yōu)選的，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下： 模版RNA 1~5μ1 PrimeScript1stepEnzymeMix 0.8μ1 上游引物PI(l〇ymol/L) 1μ1 下游引物P2 (10ymol/L) 1μ1 2X1StepBuffer 10μ1 LCgreen染料 1μ1 加RNAfree(1地2〇 補(bǔ)足至 20μ1。
[0011] 優(yōu)選的，擴(kuò)增反應(yīng)程序如下： 50°C反轉(zhuǎn)錄 30min;94°C預(yù)變性 3min;94°C變性 20sec、55°C退火 20sec、72°C延伸 20sec，循環(huán)40次；72°C終延伸5min;HRM分析設(shè)定的烙解速率為0. 3°C/sec。
[0012] 一種快速鑒別小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM檢測方法，包括W下步 驟： 1) 從樣品中提取病毒核酸； 2) 將樣品核酸反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，WcDNA為模板，用上述引物對(duì)P1和P2W及巧光飽和 染料，進(jìn)行二次擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； 3) 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定病毒類型。
[0013] 優(yōu)選的，二次擴(kuò)增反應(yīng)體系如下： cDNA 2μ1 PremixExTaq 10μ1 上游引物PI (l〇ymol/L) 1μ1 下游引物P2 (10ymol/L) 1μ1 LCgreen染料 1μ1 加RNAfree(1地2〇 補(bǔ)足至 20μ1。
[0014] 優(yōu)選的，二次擴(kuò)增反應(yīng)程序如下： 94°C預(yù)變性 3min;94°C變性 20sec、55°C退火 20sec、72°C延伸 20sec，循環(huán) 40 次；72°C終延伸5min;HRM分析設(shè)定的烙解速率為0. 3°C/sec。
[0015] 優(yōu)選的，步驟3)中HRM分析的具體分析方法為：w小鼠腦脊髓炎病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品 作為陽性對(duì)照，若待檢測樣本的曲線和小鼠腦脊髓炎病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品曲線相似，則判定為 小鼠腦脊髓炎病毒；W大鼠泰勒病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照，若待檢測樣本的曲線和大 鼠泰勒病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品曲線相似，則判定為大鼠泰勒病毒。
[0016] 優(yōu)選的，步驟3)中HRM分析的具體分析方法為：W小鼠腦脊髓炎病毒陽性標(biāo)準(zhǔn) 品作為陽性對(duì)照，若待檢測樣本的曲線和小鼠腦脊髓炎病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品曲線相似，同時(shí) 其Tm值為80. 27 + 0. 78°C，則判定為小鼠腦脊髓炎病毒；W大鼠泰勒病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品作 為陽性對(duì)照，若待檢測樣本的曲線和大鼠泰勒病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品曲線相似，同時(shí)其Tm值為 83. 30 + 1. 32°C，則判定為大鼠泰勒病毒。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是： (1)本發(fā)明首次建立了一種快速鑒別小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM檢測方 法W及引物，該方法操作簡單：只需PCR反應(yīng)之前加入巧光飽和染料即可；檢測速度快且高 通量，全部操作過程只需3小時(shí)，根據(jù)儀器配制一次可完成72/100或96/384孔板的PCR產(chǎn) 物檢測；費(fèi)用低，不需要特異性探針，每個(gè)樣品的飽和染料成本為1.6元；準(zhǔn)確性高、特異性 好，重復(fù)性好，可W準(zhǔn)確、快速、高通量地進(jìn)行分析，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
[0018] (2)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物特異性好，只能特異性擴(kuò)增出小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠 泰勒病毒，與其他大小鼠病毒如小鼠肝炎病毒（MHV)、大鼠冠狀病毒（RCV)、小鼠諾如病毒 (MNV)、呼腸孤病毒III型（Reo-3)、仙臺(tái)病毒（SV)、小鼠肺炎病毒（PVM)、漢坦病毒（HV)、 淋己細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)、小鼠細(xì)小病毒MVM株（MVM)、小鼠細(xì)小病毒MPV株 (MPV)、大鼠細(xì)小病毒KRV株（KRV)、大鼠細(xì)小病毒H-1株（H-1)、鼠痘病毒（Ect)、小鼠腺病 毒（Mad)、多瘤病毒（Poly)、小鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV)無交叉反應(yīng)。
[0019] (3)本發(fā)明方法靈敏度高，可W檢測到1.OXlOicopies/μ1的TMEV和RTV質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)品。
[0020] (4)本方法不需要進(jìn)行PCR產(chǎn)物的分離，真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作，避免污染；同時(shí)對(duì) PCR產(chǎn)物無損害，檢測后還可W進(jìn)行后續(xù)分析，如測序和凝膠電泳等。
【附圖說明】
[0021] 圖1是TMEV和RTV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品PCR的電泳圖，泳道1、2、3為TMEV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，泳 道4、5、6為RTV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，泳道7、8為陰性對(duì)照，泳道Μ為化2000DNAMarker; 圖2是TMEV和RTV模擬峰型化烙解曲線圖； 圖3是T