靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位點的方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位點的方法及其應用，本發(fā)明通過構(gòu)建的TALEN質(zhì)粒、小鼠同源重組模板質(zhì)粒和大鼠同源重組模板質(zhì)粒，并將該相應的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入小鼠或大鼠細胞中，能獲得的穩(wěn)定細胞株，用于表達各種外源基因。獲得的穩(wěn)定細胞株可以穩(wěn)定傳代，遺傳背景清晰，準確的表現(xiàn)外源基因的生物學功能。
【專利說明】靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位點的方法及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種整合外源DNA序列的方法和應用，特別是涉及一種靶向整合外源DNA序列到大鼠或小鼠Rosa26位點的方法及其應用 。
【背景技術(shù)】
[0002]TALEN (Transcription Activator-like Effector Nuclease)技術(shù)是一種薪新的分子生物學工具。利用TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關(guān)系，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，再通過添加內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，TALEN蛋白可以革巴向切割基因組DNA【Cermak T, Doyle EL, Christian M, etal., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-basedconstructs forDNA targeting.Nucleic Acids Res.2011.39(12):e82.】。在同源模板存在的情況下(Donor質(zhì)粒)，細胞會發(fā)生同源重組，從而高效精確地對基因組進行編輯【Zu Y, Tong X，Wang Z, et al.TALEN-mediated precise genome modification byhomologous recombination in zebrafish.Nat Methods.2013.10(4):329-31.】。TALEN技術(shù)可以廣泛的應用于基因組編輯的各個方面:細胞水平的基因敲除，定點點突變，結(jié)構(gòu)域缺失，定點整合等等，在疾病治療領(lǐng)域具有廣泛的應用前景【Sun N, Zhao H.Transcriptionactivator-like effector nucleases(TALENs):a highly efficient and versatile toolfor genome editing.Biotechnol Bioeng.2013.110(7):1811-21.】。
[0003]目前TALEN技術(shù)主要的缺陷是效率相對較低，一般在5%_20%，無法直接獲取100%編輯的細胞，只能通過挑選陽性的單克隆細胞，擴增成為穩(wěn)定株。
[0004]另外，當前在大鼠和小鼠細胞中構(gòu)建定點整合穩(wěn)定株還是基本采用如下的傳統(tǒng)穩(wěn)定株篩選方式:
[0005]I)線性化質(zhì)粒篩選單克隆穩(wěn)定株
[0006]2)慢病毒感染細胞篩選混合穩(wěn)定株
[0007]這兩種常用的方法都有嚴重的缺陷:質(zhì)粒篩選穩(wěn)定株的周期長，效率低，整合位點不確定，需要一直使用抗生素維持，容易導致非正常的細胞表型；慢病毒篩選穩(wěn)定株周期較短，但是整合位點不確定且集中與一些高表達的熱點區(qū)域，需要一直使用抗生素維持，同時慢病毒載體攜帶的病毒基因?qū)毎Ｉ砉δ苡绊懢薮蟆＿@些缺點使這兩種方式篩選到的穩(wěn)定細胞株不能有效的代表外源整合基因的生物學功能，造成一些實驗上的假象，使實驗結(jié)論沒有說服力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位點的方法及其應用。本發(fā)明利用TALEN技術(shù)解決了上述傳統(tǒng)方法的缺陷。同時本發(fā)明還實現(xiàn)了使用同一對TALEN質(zhì)粒同時對小鼠和大鼠細胞Rosa26位點實現(xiàn)切割，配合各自的同源重組模板，實現(xiàn)對小鼠和大鼠細胞Rosa26位點基因定點整合任意外源DNA序列。
[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一方面，提供一種用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN識別Rosa26位點，該TALEN識別Rosa26位點的上游識別序列如SEQID N0.1所示，下游識別序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]其中，SEQ ID N0.1-2是一對同時存在于大鼠和小鼠Rosa26保守位點的序列。
[0011]本發(fā)明的第二方面，提供一種一對用于識別上述位點的TALEN質(zhì)粒，該一對TALEN質(zhì)粒是上游TALEN質(zhì)粒和下游TALEN質(zhì)粒，其中，上游TALEN質(zhì)粒含有SEQ ID N0.3所示的堿基序列，下游TALEN質(zhì)粒含有SEQ ID N0.4所示的堿基序列。
[0012]所述上游TALEN質(zhì)粒優(yōu)選為含有SEQ ID N0.3所示的堿基序列的HY-TALEN-Rosa26-U質(zhì)粒(表達載體)，下游TALEN質(zhì)粒優(yōu)選為含有SEQ ID N0.4所示的堿基序列的HY-TALEN-Rosa26_D質(zhì)粒(表達載體)。
[0013]本發(fā)明的第三方面，提供一種用于靶向整合外源DNA序列到小鼠的TALEN識別Rosa26位點的小鼠同源重組模板質(zhì)粒,該質(zhì)粒含有SEQ ID N0.5所示的堿基序列。
[0014]所述小鼠同源重組模板質(zhì)粒，優(yōu)選為含有SEQ ID N0.5所示的堿基序列的HY-HR-mRosa26質(zhì)粒(HY-HR同源重組載體)。
[0015]本發(fā)明的第四方面，提供一種用于靶向整合外源DNA序列到大鼠的TALEN識別Rosa26位點的大鼠同源重組模板質(zhì)粒,該質(zhì)粒含有SEQ ID N0.6所示的堿基序列。
[0016]所述大鼠同源重組模板質(zhì)粒，優(yōu)選為含有SEQ ID N0.6所示的堿基序列的HY-HR-rRosa26質(zhì)粒(HY-HR同源重組載體)。
[0017]本發(fā)明的第五方面，提供一種定點整合穩(wěn)定細胞株構(gòu)建方法，該細胞株構(gòu)建方法使用一對上述的TALEN質(zhì)粒和小鼠同源重組模板質(zhì)粒，或使用一對上述的TALEN質(zhì)粒和大鼠同源重組模板質(zhì)粒。
[0018]本發(fā)明的第六方面，提供一種用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN識別Rosa26位點的試劑盒，包括:上述的TALEN質(zhì)粒、小鼠同源重組模板質(zhì)粒和大鼠同源重組模板質(zhì)粒。
[0019]本發(fā)明的第七方面，提供一種用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN識別Rosa26位點的試劑盒在藥物篩選和動物模型制備中的應用，如利用上述的TALEN質(zhì)粒、小鼠同源重組模板質(zhì)粒和大鼠同源重組模板質(zhì)粒等進行藥物篩選和動物模型的制備。
[0020]通過本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒(TALEN質(zhì)粒、小鼠同源重組模板質(zhì)粒和大鼠同源重組模板質(zhì)粒)，并將該相應的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入小鼠或大鼠細胞中，能獲得的穩(wěn)定細胞株，而且該細胞株具有以下有益效果:
[0021]I)遺傳背景清晰，定點整合到Rosa26位點；
[0022]2)外源表達穩(wěn)定，不受到細胞其它基因的干擾；
[0023]3)對細胞本身基因的表達無影響；
[0024]4)無需抗生素篩選培養(yǎng)；
[0025]5)穩(wěn)定細胞株篩選成功率高；
[0026]6)篩選周期縮短。
[0027]利用本發(fā)明可以高效快速精確地構(gòu)建大鼠和小鼠的穩(wěn)定細胞株，用于表達各種外源基因。獲得的穩(wěn)定細胞株可以穩(wěn)定傳代，遺傳背景清晰，準確的表現(xiàn)外源基因的生物學功倉泛。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]下面結(jié)合附圖與【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明:
[0029]圖1是大鼠和小鼠Rosa26位點的序列圖；
[0030]圖2是HY-TALEN表達載體的示意圖；
[0031]圖3是HY-HR同源重組模板載體的示意圖；
[0032]圖4是小鼠B16F0細胞Rosa26定點整合穩(wěn)定株的熒光圖；其中，a為小鼠B16F0細胞熒光顯微鏡明場照片，b為小鼠B16F0細胞熒光顯微鏡照片；
[0033]圖5是小鼠NIH-3T3細胞Rosa26定點整合穩(wěn)定株的熒光圖；其中，a為小鼠NIH-3T3細胞熒光顯微鏡明場照片，b為小鼠NIH-3T3細胞熒光顯微鏡照片；
[0034]圖6是大鼠C6細胞Rosa26定點整合穩(wěn)定株的熒光圖；其中，a為小鼠C6細胞熒光顯微鏡明場照片，b為小鼠C6細胞熒光顯微鏡照片；
[0035]圖7是大鼠208F細胞Rosa26定點整合穩(wěn)定株的熒光圖；其中，a為小鼠208F細胞熒光顯微鏡明場照片，b為小鼠208F細胞熒光顯微鏡照片；
[0036]圖8是小鼠B16F0細胞Rosa26定點整合穩(wěn)定株P(guān)CR鑒定電泳圖；
[0037]圖9是大鼠C6細胞Rosa26定點整合穩(wěn)定株P(guān)CR鑒定電泳圖。
【具體實施方式】
[0038]以下涉及的化學試劑和生物制品，如未特別說明都為商業(yè)化產(chǎn)品。另外，其他未注明的實驗操作按照常規(guī)分子生物學操作方法進行。
[0039]實施例1
[0040]一、大鼠和小鼠的TALEN識別Rosa26位點
[0041 ] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，一個能用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN識別Rosa26位點，該TALEN識別Rosa26位點的上游、下游識別序列分別如下所示:
[0042]上游識別序列:5’-agccaataatcaaatt-3’(如 SEQ ID N0.1 所不)
[0043]下游識別序列:5’-agttccttggtaacatt-3’ (如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0044]其中，詳細信息可如圖1所示。
[0045]二、識別上述位點的一對TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建
[0046]1、TALEN識別Rosa26位點的上游和下游TALEN序列合成及酶切
[0047]化學合成以下的上游和下游TALEN序列(⑶S編碼區(qū))，這兩個序列的兩端帶BsmBI位點。對于合成后的序列，使用BsmB I酶進行酶切，膠回收2.9kb片段，分別得到片段一和片段二。
[0048]上游TALEN 序列(如 SEQ ID N0.3 所示):
[0049]5， -ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGTGGACTTGAGGACACTCGGTTATTCGCAACAGCAACAGGAGAAAATCAAGCCTAAGGTCAGGAGCACCGTCGCGCAACACCACGAGGCGCTTGTGGGGCATGGCTTCACTCATGCGCATATTGTCGCGCTTTCACAGCACCCTGCGGCGCTTGGGACGGTGGCTGTCAAATACCAAGATATGATTGCGGCCCTGCCCGAAGCCACGCACGAGGCAATTGTAGGGGTCGGTAAACAGTGGTCGGGAGCGCGAGC
【權(quán)利要求】
1.一種用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN識別Rosa26位點，其特征在于:所述TALEN識別Rosa26位點的上游識別序列如SEQ ID N0.1所示，下游識別序列如SEQ ID N0.2 所示。
2.一對用于識別如權(quán)利要求1所述的位點的TALEN質(zhì)粒，其特征在于:所述一對TALEN質(zhì)粒是上游TALEN質(zhì)粒和下游TALEN質(zhì)粒，其中，上游TALEN質(zhì)粒含有SEQ ID N0.3所示的堿基序列，下游TALEN質(zhì)粒含有SEQ ID N0.4所示的堿基序列。
3.如權(quán)利要求2所述的TALEN質(zhì)粒，其特征在于:所述上游TALEN質(zhì)粒為含有SEQIDN0.3所示的堿基序列的HY-TALEN-Rosa26-U質(zhì)粒，下游TALEN質(zhì)粒為含有SEQ ID N0.4所不的喊基序列的HY-TALEN-Rosa26-D質(zhì)粒。
4.一種用于靶向整合外源DNA序列到小鼠的TALEN識別Rosa26位點的小鼠同源重組模板質(zhì)粒，其特征在于:所述質(zhì)粒含有SEQ ID N0.5所示的堿基序列。
5.如權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，其特征在于:所述質(zhì)粒為含有SEQID N0.5所示的堿基序列的HY_HR-mRosa26質(zhì)粒。
6.一種用于靶向整合外源DNA序列到大鼠的TALEN識別Rosa26位點的大鼠同源重組模板質(zhì)粒，其特征在于 :所述質(zhì)粒含有SEQ ID N0.6所示的堿基序列。
7.如權(quán)利要求6所述的質(zhì)粒，其特征在于:所述質(zhì)粒為含有SEQID N0.6所示的堿基序列的HY_HR-rRosa26質(zhì)粒。
8.一種定點整合細胞株構(gòu)建方法，其特征在于:所述細胞株構(gòu)建方法使用含有一對如權(quán)利要求2所述的TALEN質(zhì)粒和如權(quán)利要求4所述的小鼠同源重組模板質(zhì)粒；或使用含有一對如權(quán)利要求2所述的TALEN質(zhì)粒和如權(quán)利要求6所述的大鼠同源重組模板質(zhì)粒。
9.一種用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN識別Rosa26位點的試劑盒，其特征在于，包括:如權(quán)利要求2所述的TALEN質(zhì)粒、如權(quán)利要求4所述的小鼠同源重組模板質(zhì)粒和如權(quán)利要求6所述的大鼠同源重組模板質(zhì)粒。
10.一種如權(quán)利要求9所述的試劑盒的應用，其特征在于:所述試劑盒在藥物篩選和動物模型制備中的應用。
【文檔編號】C12N5/10GK103540587SQ201310455151
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】楊興林, 陳國澤, 彭娟, 潘謳東, 王富杰, 夏清梅, 殷珊 申請人:和元生物技術(shù)(上海)有限公司