對(duì)蝦偷死野田村病毒熒光定量rt-pcr檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋生物病原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種對(duì)郵偷死野田村病毒 (Cove;rtmodalitynodavirus，簡(jiǎn)稱(chēng)CMNV)巧光定量RT-PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)郵偷死?。–overtmo;rtalitydisease,CMD)是由"偷死野田村病毒（Covert modalitynodavi;rus，CMNV)"引起的一種病毒性疾病。CMNV屬于野田村病毒科α野田村 病毒屬（Nodaviridae，Α1地anodavirus)，是一種單鏈RAN病毒，病毒粒子為球形（二十面 體），無(wú)囊膜，直徑約32納米。CMD是近年我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)郵中出現(xiàn)的一種新發(fā)病害。2003年 或更早的時(shí)候，該病在海南、廣西等地高密度養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)郵中出現(xiàn)，2008-2009年在我 國(guó)南方各省市的養(yǎng)殖對(duì)郵中大規(guī)模爆發(fā)，2010年后開(kāi)始傳播到我國(guó)山東、河北和天津等地。 分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，凡納濱對(duì)郵、中國(guó)對(duì)郵、日本對(duì)郵、斑節(jié)對(duì)郵、脊尾白郵、羅氏沼郵 和Ξ痛梭子蟹中均能檢出CMNV陽(yáng)性，運(yùn)說(shuō)明CMNV不僅能夠感染目前我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)郵的主要 經(jīng)濟(jì)種類(lèi)，還能感染其他甲殼類(lèi)動(dòng)物，由此可見(jiàn)CMNV宿主范圍可能非常廣泛。
[0003] 截至2015年該病害在我國(guó)的大部分對(duì)郵養(yǎng)殖地區(qū)仍危害嚴(yán)重，所W研究并建立 該病原的定量檢測(cè)預(yù)警技術(shù)，加強(qiáng)郵苗種和成郵檢疫W及養(yǎng)殖水體環(huán)境的監(jiān)測(cè)，對(duì)預(yù)防病 毒感染，有效切斷病毒傳播，保障我國(guó)對(duì)郵養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展就顯得尤為迫切和重要。 目前，有關(guān)CMNV的檢測(cè)方法主要有四種，第一種是電鏡觀察法，第二種是病理切片法，第Ξ 種是核酸探針雜交法，第四種是逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)法。前Ξ種檢測(cè)方法操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間較 長(zhǎng)，一般在實(shí)驗(yàn)室確診中使用，并且其檢測(cè)靈敏度較低，只能用于發(fā)病對(duì)郵或即將發(fā)病的對(duì) 郵進(jìn)行檢測(cè)，CMNV尚未引發(fā)感染或在感染的極早期很難用運(yùn)兩種方法檢測(cè)；CMNV的逆轉(zhuǎn)錄 PCR檢測(cè)法，雖然克服了前幾種方法的缺點(diǎn)，但由于常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)無(wú)法對(duì)病毒核酸 進(jìn)行定量分析，運(yùn)在一定程度上也限制了逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。
[0004] 進(jìn)行對(duì)郵偷死野田村病毒早期檢測(cè)并采取預(yù)防措施是水產(chǎn)養(yǎng)殖中降低偷死野田 村病毒流行風(fēng)險(xiǎn)、減少發(fā)病造成巨額經(jīng)濟(jì)損失的有效手段，所W建立定量、快速和高靈敏的 檢查方法對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐來(lái)說(shuō)就顯得尤為迫切和必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠定量、快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)對(duì)郵偷死野田村病毒的方法， W克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，使CMNV的檢測(cè)更準(zhǔn)確、靈敏、快速、安全和方便。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的是一種基于化qMan探針的實(shí)時(shí)巧光定量逆轉(zhuǎn) 錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增技術(shù)來(lái)檢測(cè)CMNV。
[0007] 本發(fā)明所述的化qMan探針實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)CMNV的方法，技術(shù)方案如 下：
[000引 （1)引物設(shè)計(jì)
[0009] 發(fā)明人通過(guò)構(gòu)建CMNV病毒全基因組cDNA文庫(kù)克隆獲得了CMNV的RNA聚合 酶基因，利用軟件Clustal W和DNAstar篩選該病毒基因組的保守片段，借助Primer Premie巧.Ο進(jìn)行引物、探針的設(shè)計(jì)和篩選，最后利用GenBank的Blast的功能確定引物和探 針的特異性。引物和探針序列送至生工生物工程（上海）有限責(zé)任公司進(jìn)行合成。
[0010] 似制備CMNV陽(yáng)性對(duì)郵樣品的RNA
[0011] 將樣品保存在飽和醋酸錠溶液中，采用商品化的RNA提取試劑盒（天根生化科技 (北京）有限公司）按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，提取的RNA放于-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0012] (3)配制反應(yīng)體系
[0013] 采用商品化的一步法巧光定量RT-PCR試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司），根 據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)液，其中RT-PCR反應(yīng)液總體積為25 μ L:反應(yīng)緩沖液12. 5 μ L Taq服混液為1 μ L PrimeScript PLUS RTase混液為1 μ L ROX參比染料為lul，探針 0. 2~0. 5μL(10mmol/L)，同時(shí)加入所述的兩個(gè)引物和RNA,引物的終濃度為1μL(10mmol/ L)，RNA為1 μ L用無(wú)RNase水為補(bǔ)齊25 μ L。
[0014] (4)反應(yīng)分析
[0015] 上述反應(yīng)液可W由羅氏Li曲t切cler 480II實(shí)時(shí)巧光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42°C，10分鐘；95°C，10秒；PCR反應(yīng)：95°C，5秒；60°C， 30秒；40個(gè)循環(huán)。如果出現(xiàn)擴(kuò)增曲線、Ct值小于35個(gè)循環(huán)且Tm值為81. 53+0. 14°C范圍 內(nèi)可判斷結(jié)果為陽(yáng)性，否則即為陰性。
[0016] (5)RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0017] 1)WCMNV陽(yáng)性病料RNA為模板，利用引物1和引物2進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，獲得片段 大小為179bp的PCR產(chǎn)物，對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、純化。
[0018] 2) WT-Vector pM護(hù)Μ20作為純化后的PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄載體，然后轉(zhuǎn)化入D冊(cè)α感 受態(tài)細(xì)胞中。
[001引如利用質(zhì)粒提取試劑盒度iomed公司）進(jìn)行質(zhì)粒的提取。
[0020] 4)利用EcoRIaaKaRa公司）37°C單酶切2小時(shí)，使質(zhì)粒線性化。體系為：
[0021]
[002引 5)利用SP6RNAPolymerase燈aKaRa公司）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，37°C反應(yīng)1小時(shí)，體系 為：
[0023]
[0024] 6)合成后的RNA利用面aseI進(jìn)行質(zhì)粒DM的降解，37 °C反應(yīng)30分鐘，體系如下：
[00巧]
[0026] 7)進(jìn)行酪氯仿抽提純化所提取的RNA
[0027]i.向6)中體系加入2. 5μL的0. 5mmol/LEDTA，混勻。80°C加熱處理2分鐘。
[002引 ?.用DEPC處理水定容至100μL。
[0029] 化.加入100μL苯酪：氯仿：異戊醇（25:24:1)抽提液，混勻。
[0030]iv. 4°C下12000巧m離屯、5分鐘，溶液出現(xiàn)分層，取上層清液。
[0031] V .加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1)混勻。
[0032]vi. 12000巧m離屯、5分鐘，取上面水相層。
[003引vii.加入10μL3mmol/L醋酸鋼和250μL乙醇，混勻。-20°C放置20分鐘。
[0034] viii. 4°C下12000巧m離屯、10分鐘，棄上層清液。
[003引ix.加入1血70%乙醇，輕微混勻后4°C下1200化pm離屯、10分鐘，棄上清液。
[0036] X .將合成的RNA干燥后利用RNase化ee水溶解，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度和純度。
[0037] 利用測(cè)定RNA的濃度，計(jì)算拷貝數(shù)。用RNase化ee水將RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?稀釋成1〇7~10 2copies/μL作為RNA標(biāo)準(zhǔn)品W制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用優(yōu)化好的體系進(jìn)行 CMNVRT-PCR，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[003引根據(jù)W上技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一種對(duì)郵偷死野田村病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[00測(cè)（1)樣品預(yù)處理
[0040] 將樣品保存在飽和醋酸錠溶液中，采用RNA提取試劑盒提取RNA;
[0041] (2)配制反應(yīng)體系
[0042] 采用一步法巧光定量RT-PCR試劑盒，根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)液，其中 RT-PCR反應(yīng)液總體積為25μL:反應(yīng)緩沖液12. 5μLhq服混液為1μLPrimeScript PLUSRTase混液為1μLROX參比染料為lul，探針0. 2~0. 5μL(l〇mm〇l/L)，同時(shí)加入所 述的兩個(gè)引物和RNA，引物的終濃度為lyL(l〇mm〇l/U，RNA為1μ^用無(wú)RNase水為補(bǔ)齊 25μL。
[0043] 引物 1(沈QIDΝ0:1) :5'-CCGACAAGGTATCCAAAGC-3'
[0044] 引物 2(沈QIDN0:2) :5'-ACCTGTTAGGTACGCTACCACT-3'
[0045] 探針（SEQIDN0:3) :5'-CGCTCACGGCTTTGGATACCTT-3'
[0046] (3)反應(yīng)和結(jié)果分析
[0047] 上述反應(yīng)體系由羅氏Li曲t切cler480II實(shí)時(shí)巧光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR; 根據(jù)反應(yīng)的曲線、Ct值和溶解曲線判斷結(jié)果的陰性和陽(yáng)性；
[0048] 優(yōu)選地，上述反應(yīng)體系在羅氏Li曲t切cler 96巧光定量系統(tǒng)或Applied Biosystems7500R巧光定量系統(tǒng)機(jī)器上進(jìn)行。
[0049] 優(yōu)選地，反應(yīng)條件是：
[0050] 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42°C，10分鐘；95°C，10秒；PCR反應(yīng)：95°C，5秒；60°C，30秒；40個(gè)循 環(huán)。
[0051] 優(yōu)選地，結(jié)果判斷方法為，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線、Ct值小于35個(gè)循環(huán)且T