一種快速檢測制藥用水中微生物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種微生物檢測方法，具體涉及一種快速檢測制藥用水中微生物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物快速檢測方法是微生物學(xué)中的一個(gè)快速發(fā)展的方向，無論是對食品，藥品用水安全的監(jiān)督和管理，都需要一種較為快速的微生物檢測方法。
[0003]目前，對于微生物菌含量的檢測，主要是依照傳統(tǒng)的方法，將待檢測的對象，接種到適合的培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察和計(jì)數(shù)。
[0004]但是目前的這種方法由于需要長期的培養(yǎng)，需要數(shù)天，這對于需及時(shí)檢測到待檢對象中的含菌量是不利的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種快速檢測制藥用水中微生物的方法，能快速檢測制藥用水中微生物的含量，可以更快地確認(rèn)制藥用水中否存在污染，避免產(chǎn)品的生產(chǎn)中斷。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0007]一種快速檢測制藥用水中微生物的方法，包括如下步驟:
[0008]S1、將待測制藥用水通過0.23-0.47 μ m混合纖維素酯膜，直至抽濾無法進(jìn)行；
[0009]S2、將步驟S1所得的混合纖維素酯膜置于平皿中，加入l-3ml Trizol浸泡濾膜7-13min，得混合液；
[0010]S3、將步驟S3所得的混合液進(jìn)行離心處理后，取上清液2ul作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的調(diào)節(jié)為:首先在95°C運(yùn)行2min，之后40個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95°C 10s，和 60°C 34s ;之后 95°C lmin ；55°C 30s ；95°C 30s ；
[0011]S4、取納米銀粒子溶液90 μ 1與步驟S3所得的產(chǎn)物10 μ 1混合，加入終濃度為3.5-13.5mM的PBS緩沖溶液，5_15min后，觀察顏色變化，另取100 μ 1混合溶液加入96微孔板于酶標(biāo)儀上測量500-760nm的吸光度值。
[0012]其中，所述納米銀粒子溶液通過以下步驟制備所得:
[0013](1)將質(zhì)量濃度為0.8-2.2mg/mL的氧化可德蘭多糖溶液與摩爾濃度為10-110mmol/L的水溶性硝酸銀溶液按體積比1: 1混合后在磁力攪拌下，超聲水浴70-100 °C，恒溫反應(yīng) 0.5-2h ；
[0014](2)將步驟⑴所得的反應(yīng)液冷至室溫，用0.22_0.26μπι微孔濾膜過濾，30000-40000rpm離心0.5_lh，分散在丙酮和水的混合液中，去除過量的氧化可德蘭多糖和硝酸銀；
[0015](3)通過超聲波振蕩設(shè)備重新分散在水中的銀納米粒子，蒸餾水透析48h，即得納米銀粒子溶液。
[0016]其中，所述PBC 緩沖液的成分為 139mmol/L NaCl、2.6mmol/LKCl、13mmol/LNa2HP04和 3mmol/L ΚΗ2Ρ04Ο
[0017]其中，所述PBC緩沖液由ddH20配制。
[0018]其中，所述平皿在使用前需要?dú)⒕尽?br>[0019]本發(fā)明將PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入到納米銀粒子溶液中。一定時(shí)間后，加入PBS緩沖溶液。由于用于PCR反應(yīng)的引物能使納米銀粒子抵抗鹽離子，導(dǎo)致納米銀粒子溶液沒有顏色變化。當(dāng)水體中存在引物對應(yīng)的病原微生物，引物會被消耗，納米銀粒子就會重新暴露在鹽離子下，從而發(fā)生聚集，最終造成溶液顏色發(fā)生變化。顏色的變化與水中病原微生物有關(guān)，故該發(fā)明可用于檢測水中病原微生物的種類。
[0020]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0021]所用的納米銀粒子穩(wěn)定劑為PCR反應(yīng)引物，無需額外添加底物，方便簡單；檢測靈敏度較高，只需PCR過程有特異性片段產(chǎn)生，就能通過肉眼可見的溶液顏色變化對相應(yīng)病原微生物進(jìn)行定性，可以更快地確認(rèn)制藥用水中否存在污染，避免產(chǎn)品的生產(chǎn)中斷。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0023]以下實(shí)施例中所使用的PBC緩沖液由ddH20配制，成分為139mmol/L NaCl、
2.6mmol/L KCl、13mmol/L Na2HP04^P 3mmol/L KH 2P04，所使用的平皿在使用前需要?dú)⒕?。所使用的納米銀粒子溶液通過以下步驟制備所得:
[0024](1)將質(zhì)量濃度為0.8-2.2mg/mL的氧化可德蘭多糖溶液與摩爾濃度為10-110mmol/L的水溶性硝酸銀溶液按體積比1: 1混合后在磁力攪拌下，超聲水浴70-100 °C，恒溫反應(yīng) 0.5-2h ；
[0025](2)將步驟⑴所得的反應(yīng)液冷至室溫，用0.22_0.26μπι微孔濾膜過濾，30000-40000rpm離心0.5_lh，分散在丙酮和水的混合液中，去除過量的氧化可德蘭多糖和硝酸銀；
[0026](3)通過超聲波振蕩設(shè)備重新分散在水中的銀納米粒子，蒸餾水透析48h，即得納米銀粒子溶液。
[0027]實(shí)施例1
[0028]S1、將待測制藥用水通過0.35 μ m混合纖維素酯膜，直至抽濾無法進(jìn)行；
[0029]S2、將步驟S1所得的混合纖維素酯膜置于平皿中，加入2ml Trizol浸泡濾膜lOmin，得混合液；
[0030]S3、將步驟S3所得的混合液進(jìn)行離心處理后，取上清液2ul作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的調(diào)節(jié)為:首先在95°C運(yùn)行2min，之后40個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95°C 10s，和 60°C 34s ;之后 95°C lmin ；55°C 30s ；95°C 30s ；
[0031]S4、取納米銀粒子溶液90 μ 1與步驟S3所得的產(chǎn)物10 μ 1混合，加入終濃度為8.5mM的PBS緩沖溶液，lOmin后，觀察顏色變化，另取100 μ 1混合溶液加入96微孔板于酶標(biāo)儀上測量630nm的吸光度值。
[0032]實(shí)施例2
[0033]S1、將待測制藥用水通過0.47 μ m混合纖維素酯膜，直至抽濾無法進(jìn)行；
[0034]S2、將步驟S1所得的混合纖維素酯膜置于平皿中，加入3ml Trizol浸泡濾膜7min，得混合液；
[0035]S3、將步驟S3所得的混合液進(jìn)行離心處理后，取上清液2ul作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的調(diào)節(jié)為:首先在95°C運(yùn)行2min，之后40個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95°C 10s，和 60°C 34s ;之后 95°C lmin ；55°C 30s ；95°C 30s ；
[0036]S4、取納米銀粒子溶液90 μ 1與步驟S3所得的產(chǎn)物10 μ 1混合，加入終濃度為13.5mM的PBS緩沖溶液，5min后，觀察顏色變化，另取100 μ 1混合溶液加入96微孔板于酶標(biāo)儀上測量760nm的吸光度值。
[0037]實(shí)施例3
[0038]S1、將待測制藥用水通過0.23 μ m混合纖維素酯膜，直至抽濾無法進(jìn)行；
[0039]S2、將步驟S1所得的混合纖維素酯膜置于平皿中，加入lml Trizol浸泡濾膜13min，得混合液；
[0040]S3、將步驟S3所得的混合液進(jìn)行離心處理后，取上清液2ul作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的調(diào)節(jié)為:首先在95°C運(yùn)行2min，之后40個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95°C 10s，和 60°C 34s ;之后 95°C lmin ；55°C 30s ；95°C 30s ；
[0041]S4、取納米銀粒子溶液90 μ 1與步驟S3所得的產(chǎn)物10 μ 1混合，加入終濃度為
3.5mM的PBS緩沖溶液，15min后，觀察顏色變化，另取100 μ 1混合溶液加入96微孔板于酶標(biāo)儀上測量500nm的吸光度值。
[0042]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢測制藥用水中微生物的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51、將待測制藥用水通過0.23-0.47 μ m混合纖維素酯膜，直至抽濾無法進(jìn)行； 52、將步驟S1所得的混合纖維素酯膜置于平皿中，加入l_3mlTrizol浸泡濾膜7-13min，得混合液； 53、將步驟S3所得的混合液進(jìn)行離心處理后，取上清液2ul作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的調(diào)節(jié)為:首先在95°C運(yùn)行2min，之后40個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95°C 10s，和 60°C 34s ;之后 95°C lmin ；55°C 30s ；95°C 30s ； 54、取納米銀粒子溶液90μ1與步驟S3所得的產(chǎn)物10μ1混合，加入終濃度為3.5-13.5mM的PBS緩沖溶液，5_15min后，觀察顏色變化，另取100 μ 1混合溶液加入96微孔板于酶標(biāo)儀上測量500-760nm的吸光度值。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測制藥用水中微生物的方法，其特征在于，所述納米銀粒子溶液通過以下步驟制備所得: (1)將質(zhì)量濃度為0.8-2.2mg/mL的氧化可德蘭多糖溶液與摩爾濃度為lO-llOmmol/L的水溶性硝酸銀溶液按體積比1: 1混合后在磁力攪拌下，超聲水浴70-100°C，恒溫反應(yīng)0.5-2h ； (2)將步驟⑴所得的反應(yīng)液冷至室溫，用0.22-0.26 μπι微孔濾膜過濾，30000-40000rpm離心0.5_lh，分散在丙酮和水的混合液中，去除過量的氧化可德蘭多糖和硝酸銀； (3)通過超聲波振蕩設(shè)備重新分散在水中的銀納米粒子，蒸餾水透析48h，即得納米銀粒子溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測制藥用水中微生物的方法，其特征在于，所述 PBC 緩沖液的成分為 139mmol/L NaCl、2.6mmol/L KCl、13mmol/L Na2HP0jP 3mmol/LKH2P04o4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測制藥用水中微生物的方法，其特征在于，所述PBC緩沖液由ddH20配制。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測制藥用水中微生物的方法，其特征在于，所述平皿在使用前需要?dú)⒕尽?br>【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測制藥用水中微生物的方法，包括如下步驟：將待測制藥用水通過混合纖維素酯膜，直至抽濾無法進(jìn)行后，將所得的混合纖維素酯膜置于平皿中，加入Trizol浸泡濾膜，浸泡完成后進(jìn)行離心處理，取上清液2ul作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，加入納米銀粒子溶液混合，加入PBS緩沖溶液，5-15min后，觀察顏色變化。本發(fā)明所用的納米銀粒子穩(wěn)定劑為PCR反應(yīng)引物，無需額外添加底物，方便簡單；檢測靈敏度較高，只需PCR過程有特異性片段產(chǎn)生，就能通過肉眼可見的溶液顏色變化對相應(yīng)病原微生物進(jìn)行定性，可以更快地確認(rèn)制藥用水中否存在污染，避免產(chǎn)品的生產(chǎn)中斷。
【IPC分類】C12Q1/04, C12Q1/68
【公開號】CN105331730
【申請?zhí)枴緾N201510870030
【發(fā)明人】高顯會, 張慧影, 張國毅, 葛曉燕
【申請人】遼寧醫(yī)學(xué)院
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月27日