用于飼料中添加的屎腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明設(shè)及用于飼料中添加的尿腸球 菌的快速定性、定量檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國動物飼料中抗生素的禁用，新型的綠色添加劑的開發(fā)成為熱點(diǎn)。目前益 生菌制劑不斷發(fā)展，但是在其定性、定量檢測的方法還不夠科學(xué)和快速，運(yùn)在一定程度上限 制了益生菌制劑的發(fā)展。通常采用生理生化反應(yīng)和選擇性培養(yǎng)基純培養(yǎng)分離計(jì)數(shù)的傳統(tǒng)方 法，極易因?yàn)榫N差異導(dǎo)致的檢測效率受限、檢測結(jié)果不穩(wěn)定，除此之外，傳統(tǒng)方法也會耗 費(fèi)大量的時(shí)間和資源。實(shí)時(shí)巧光定量PCR相對于PCR技術(shù)來說，是定性到定量的飛躍，因其 特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確和高效的特點(diǎn)成為分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域非常重要的定量 檢測方法。通過種屬特異性PCR和實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)，建立豬飼料中尿腸球菌的快速 定性、定量檢測方法，可W提高檢測效率、簡化檢測程序，并促進(jìn)飼料行業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展， 為益生菌和飼料產(chǎn)業(yè)的快速和長遠(yuǎn)發(fā)展提供技術(shù)保障。
[0003] 本申請針對豬飼料中含有的尿腸球菌，通過對已經(jīng)報(bào)道的尿腸球菌基因組序列的 比對分析，選取尿腸球菌的保守基因作為目的基因，自行設(shè)計(jì)尿腸球菌的基因序列的種屬 特異性引物，利用該引物進(jìn)行種屬特異性PCR和實(shí)時(shí)巧光定量PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳圖 譜分析和實(shí)時(shí)巧光定量PCR圖譜分析，建立了豬飼料中尿腸球菌的快速定性和定量測定方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】
W04] 用于飼料中添加的尿腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒，包括引物： 5' -GCGTCCAAGTTATTTCCCATTTAC-3'、5' -CGATTCCTGACATCTTCAACACA-3'。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了用于飼料中添加的尿腸球菌的快速定性、定量檢 測試劑盒的檢測方法，方法簡單，重復(fù)性高，結(jié)果準(zhǔn)確。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種用于飼料中添加的尿腸球菌的快速定性、定 量檢測試劑盒的應(yīng)用。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取W下技術(shù)措施：
[0008] 用于飼料中添加的尿腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒，包括引物： 5' -GCGTCCAAGTTATTTCCCATTTAC-3'、5' -CGATTCCTGACATCTTCAACACA-3'。
[0009] 用于飼料中添加的尿腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒的檢測方法，包括飼料 樣品預(yù)處理的方法，該方法包括：
[0010] 經(jīng)過充分粉碎混勻的飼料25g與225mL的滅菌生理鹽水混合，在4°CW100轉(zhuǎn)/分 的速度震蕩1-化，配成10%的均勻稀釋液。對均勻稀釋液進(jìn)行10倍遞增稀釋，選擇2個(gè)W 上適宜的稀釋度，根據(jù)需要，提取細(xì)菌基因組DNA或RNA。
[0011] 用于飼料中添加的尿腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒的應(yīng)用，其應(yīng)用包括利 用該試劑盒制備成用于尿腸球菌的檢測試劑，或利用該試劑盒進(jìn)行尿腸球菌的定性檢測， 或利用該試劑盒進(jìn)行尿腸球菌的定量檢測，或利用該試劑盒同時(shí)進(jìn)行尿腸球菌的定性和定 量的檢測。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0013] (1)本發(fā)明所采用的飼料樣本的處理方法使得在益生菌的提取過程中，益生菌的 擴(kuò)增有限，同時(shí)飼料中的益生菌又可W充分釋放，運(yùn)樣所測得值才能真實(shí)的反應(yīng)出飼料中 的益生菌數(shù)目，為一種特異的適用于飼料中尿腸球菌提取方法，為本發(fā)明首創(chuàng)。
[0014] (2)本發(fā)明對目前已經(jīng)報(bào)道的尿腸球菌及飼料中可能添加的如嗜酸乳桿菌、植物 乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌等其他益生菌所有的基因組序 列進(jìn)行了比對分析，選擇了保守的單拷貝基因作為目的基因，并W該基因的保守序列設(shè)計(jì) 了特異性的引物，W該引物對飼料中的尿腸球菌進(jìn)行定性、定量檢測，所得到數(shù)據(jù)才能真實(shí) 的反應(yīng)出飼料中添加的尿腸球菌的數(shù)量。
[0015] (3)本發(fā)明可W在不進(jìn)行益生菌純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，簡便、快速、準(zhǔn)確地定性、定量 檢測豬飼料中尿腸球菌，整個(gè)過程對飼料中尿腸球菌的檢測程序簡單、檢測效率高、準(zhǔn)確性 好，靈敏度高，最低檢測標(biāo)準(zhǔn)要比傳統(tǒng)的方法低的多，而且重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0016] 圖1為尿腸球菌的定性檢測示意圖。
[0017]Μ:化2000marker;1:陽性對照（含有目的基因的質(zhì)粒為模版）；2:尿腸球菌；3: 添加有尿腸球菌的飼料；4:嗜酸乳桿菌；5:糞腸球菌；6:兩歧雙歧桿菌；7:動物雙歧桿菌； 8:大腸桿菌；9:干酪乳桿菌；10:植物乳桿菌；11:保加利亞乳桿菌；12陰性對照 陽018] 圖2為Real-time PCR對尿腸球菌引物特異性的驗(yàn)證示意圖。
[0019] 其中A.嗜酸乳桿菌B.植物乳桿菌C.保加利亞乳桿菌化干酪乳桿菌E.糞腸球 菌F.尿腸球菌G.雙歧桿菌H.青春雙歧桿菌
[0020] 圖3為不同濃度尿腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌種擴(kuò)增曲線示意圖。 陽02U 其中A. 10 1稀釋；B. 10 2稀釋；C. 10 3稀釋；D. 10 4稀釋出.10 5稀釋；F. 10 6稀釋. G. 10 7稀釋；H. 10S稀釋。
[0022] 圖4為尿腸球菌定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明實(shí)施例所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。所用試劑或 材料，均已公開。
[0024]PMD18-T克隆載體核D冊α感受態(tài)細(xì)胞均購自Takara生物科技有限公司，Trizol 試劑是由Invitrogen公司專供提取的RNA的產(chǎn)品；麗ase I是TaKaRa公司產(chǎn)品；此過程中 使用的氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑是天津市化學(xué)試劑Ξ廠生產(chǎn)的產(chǎn)品。尿腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌 種購自中國普通微生物菌種保藏管理中屯、。 陽02引 實(shí)施例1 : 陽0%] 尿腸球菌目的檢測基因的選?。?br>[0027] 本發(fā)明對目前已經(jīng)報(bào)道的尿腸球菌及飼料中可能添加的如嗜酸乳桿菌、保加利亞 乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌等其他益生菌所有 的基因組序列進(jìn)行了大量比對分析，選擇定性、定量檢測的目的基因，該目的基因在尿腸球 菌菌基因組中是保守的看家基因，而且是單拷貝基因，W該基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性 的引物，對飼料中的尿腸球菌進(jìn)行定性、定量檢測，所得到數(shù)據(jù)才能真實(shí)的反應(yīng)出飼料中添 加的尿腸球菌的數(shù)量。針對該目的基因設(shè)計(jì)的引物為：5'-GCGTCCAAGTTATTTCCCATTTAC-3'、 5' -CGATTCCTGACATCTTCAACACA-3'，該引物可用于尿腸球菌的定性及定量檢測。 陽02引 實(shí)施例2 : W29] 用于飼料中添加的尿腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒，包括引物： 5' -GCGTCCAAGTTATTTCCCATTTAC-3'、5' -CGATTCCTGACATCTTCAACACA-3。
[0030] 實(shí)施例3 :
[0031] 用于飼料中添加的尿腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒的檢測方法，包括飼料 樣品預(yù)處理的方法，該方法包括：
[0032] 經(jīng)過充分粉碎混勻的飼料25g與225mL的滅菌生理鹽水混合，在4°CW100轉(zhuǎn)/分 的速度震蕩1-化，配成10%的均勻稀釋液。無菌操作對上一步制備的均勻稀釋液進(jìn)行10 倍遞增稀釋，選擇2~3個(gè)W上適宜的稀釋度，根據(jù)需要，提取細(xì)菌基因組DNA或RNA。
[0033] 其余步驟利用實(shí)施例1中的引物對對提取的DNA或RNA進(jìn)行定性和定量的鑒 定。用于飼料中添加的尿腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒的檢測方法，具體包括W下步 驟：
[0034] A、模板DNA的制備
[0035] 無菌操作將經(jīng)過充分粉碎混勻的飼料25g放入含有225mL的滅菌生理鹽水的滅菌 廣口瓶內(nèi)，在低溫條件下（4°C)W100轉(zhuǎn)/分的速度震蕩1.5h，配成10%的均勻稀釋液。 無菌操作對上一步制備的均勻稀釋液進(jìn)行10倍遞增稀釋，選擇3個(gè)W上適宜的稀釋度，采 用液氮凍融-CTAB法抽提樣品DNA:
[0036] (1)取預(yù)處理后的飼料樣品于2. 0血離屯、管中，加入500μLTE緩沖液混合均勻 后，置于液氮中凍結(jié)，凍結(jié)后取出放在65°C中水浴5min，反復(fù)凍融4次；
[0037] 似凍融結(jié)束后，往其中加入60.0化10%的805和10.0化110111邑/1^蛋白酶1(， 37°C搖床W200r/min振蕩地；
[0038] 0)加入100. 0 μL5MNaCl和100. 0 μLCTAB/NaCl，65Γ中水浴lOmin;
[0039] (4)然后，加入與步驟（3)得到的溶液等體積的苯酪、氯仿和異戊醇混合物，它們 的體積比分別為25:24:1,混勻后WlOOOOg/min離屯、lOmin,該溶液分成上層水相、中層固 相和下層有機(jī)相；
[0040] (5)吸取上層水相，加入與水相體積相等的苯酪、氯仿和異戊醇混合物抽提一次， 分離上清液；
[0041] (6)往上述上清液中加入1 %體積的3mol/L醋酸鋼和1倍體積的并異丙醇，混勻 后室溫靜置30min,lOOOOg/min離屯、5min，棄掉上清； 陽0創(chuàng) （7)用70 %乙醇洗涂沉淀兩次，室溫下自然干燥后獲得模板DNA，加入50. 0μL無 菌超純水溶解DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0043] 作為下一步定性PCR檢測的模板，于-20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0044]B、PCR擴(kuò)增W45] 反應(yīng)體系25. 0μL:
[0046] 2. 5μL10XPCRBuffer(含Mg2+)、
[0047] 2. 0μLlOmmol/LDNTPs(各 2. 5mm〇U、
[0048] 1. 0μLlOmmol/L上下游引物、
[0049] 1. 0μL50ng/LDNA模板、 陽0加]0. 5μΙ抓/LTaq酶、
[0051]用（1地2〇 補(bǔ)足至 25. 0μL; 陽05引 PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性3min;95°C預(yù)變性30s，64°C退火30s，72°C延伸45s，循 環(huán)40次；72°C延伸lOmin，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在4°C下保存；
[0053] 取5. 0μLPCR產(chǎn)物使用1. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。瓊脂糖凝膠電泳圖譜 分析是使用上海天能W商品名Tanon-4100凝膠電泳成像系統(tǒng)銷售的儀器進(jìn)行的；
[0054] 所述的尿腸球菌上下游特異性引物分別是： 陽化5]上游引物為：5' -GCGTCCAAGTTATTTCCCATTTAC-3，
[0056] 下游引物為：5，-CGATTCCTGACATCTTCAACACA-3，
[0057] C、結(jié)果及判定
[0058] 檢測時(shí)設(shè)W含有目的的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒DNA作為模板為陽性對照，W滅菌水作為 模板為陰性對照；同時(shí)W各標(biāo)準(zhǔn)菌株的非同種對照菌株作為參考進(jìn)行擴(kuò)增。如果標(biāo)準(zhǔn)菌株 擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，而陰性對照和非同種對照菌株沒有出現(xiàn)該特 異性條帶，則表明引物是特異的。根據(jù)在475bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，表明該飼料中含有尿 腸球菌，相反則不含有尿腸球菌。
[0059] 所述的含有目的基因的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒DNA是通過將尿腸球菌的PCR產(chǎn)物與 PMD18T載體鏈接轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a獲得的陽性克隆子。
[0060] 所述的定性檢測是在5V/cm的電壓