專利名稱：屎腸球菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸球菌屬的屎腸球菌Anp01(Enterococcus faecium AnpOl)，于2009年1 月19日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，CCTCCNO: M209019,其作為一種飼料添加劑， 用于改善機體免疫力。
背景技術(shù)：
隨著科技的發(fā)展，人們越來越重視機體免疫力的提高，微生態(tài)制劑作為一種能夠明顯提 高人體免疫力功能的制劑，受到國際醫(yī)學(xué)機構(gòu)的普遍關(guān)注和積極研究。微生態(tài)制劑也是一種 很好的飼料添加劑，并能起到機體免疫激活劑的作用，能刺激動物產(chǎn)生干擾素，提高免疫球 蛋白濃度和巨噬細胞的活性，通過非特異性免疫調(diào)節(jié)因子等激發(fā)機體免疫力的增強。動物口 服益生菌后，調(diào)整腸道內(nèi)菌群構(gòu)成，使腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡加以改善，活化腸粘膜內(nèi)的相關(guān) 淋巴組織，使SigA抗體分泌增強，提高免疫識別能力，并誘導(dǎo)T、 B淋巴細胞和巨噬細胞等 產(chǎn)生細胞因子，通過淋巴細胞再循環(huán)而活化全身的免疫系統(tǒng)，從而增強機體免疫力。益生菌 可以激活巨噬細胞功能，刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，有益菌能夠刺激負責人體免疫的淋巴細胞 分裂繁殖，同時還能調(diào)動非特異性免疫系統(tǒng)，去"吃"掉包括病毒、細菌、衣原體等在內(nèi)的 各種可致病的外來微生物?，F(xiàn)在使用的益生菌的種類主要有三種酵母菌、乳酸菌、芽孢菌， 其中以乳酸菌被選作益生菌菌種的數(shù)量最多，主要原因是因為乳酸菌能在動物的腸道內(nèi)展現(xiàn) 強而有力的生物活力。然而這些乳酸菌類的益生菌菌種的世代時間大約在40-60分鐘之間，如 最常見的乳酸桿菌等，世代時間較長，在腸道內(nèi)和病原菌的競爭能力不強；乳酸桿菌制造的 乳酸5(^是L型乳酸，5094是D型乳酸，L型乳酸又稱為天然乳酸，可被動物吸收并利用，而D 型乳酸則只能被吸收，而無法利用，因此吸收的D型乳酸的能量會被浪費掉；三種益生菌菌 種中以芽孢菌在干燥的環(huán)境下安定性最高，不易受到外界環(huán)境的影響，乳酸菌和酵母菌的安 定性則差很多，必須利用特殊的方法保護才能提高其安定性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的詞料添加劑菌種，屎腸球菌。本發(fā)明是屎腸球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01) CCTCC NO: M 209019。本發(fā)明是屎腸球菌AnpOl(EnterococcusfaeciumAnpOl)已于2009年1月19日保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為M209019。
本發(fā)明屎腸球菌Anp01(Enterococcus faecium AnpOl) CCTCC M 209019是一種對人和動物沒有毒性和腸病原性的正常腸道菌類，用它制成的飼料添加劑，即使在不正常的情況下，也不會制造任何毒素，在宿主動物免疫功能低下時，也不會產(chǎn)生潛在的危險，是一種純天然,沒有任何外來的抗藥性存在的飼料添加劑。此種屎腸球菌對酸有高度的抵抗力，可通過胃酸的考驗順利到達腸道，在pH 時，90分鐘后存活率約為75-80%;世代時間特別短，約19分鐘分裂一次，在腸道內(nèi)和病原菌的競爭性強；另外，制造的乳酸全部都是L型乳酸，可以全部被動物吸收并利用?？傊?，本發(fā)明的屎腸球菌可以在腸道內(nèi)快速生長，形成菌落并調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制病原菌如沙門氏菌、大腸桿菌等，產(chǎn)生L型乳酸，產(chǎn)生類殺菌類，分泌生物薄膜，保護腸粘膜免受毒素侵襲，重建腸內(nèi)正常菌群，刺激免疫系統(tǒng)，促進動物整體健康。
本發(fā)明是屎腸球菌Anp01(EnterococcusfaeciumAnp01)已于2009年1月19日保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC,保藏編號為M209019。
具體實施例方式
本發(fā)明屎腸球菌為球形或橢圓形，呈鏈狀排列，無芽胞。無鞭毛。培養(yǎng)早期(2 4h)形成透明質(zhì)酸的莢膜，有菌毛，含型特異的M蛋白。易被普通的堿性染料著色，革蘭染色陽性。培養(yǎng)要求較高，需補充血液、血清、葡萄糖等。在血清肉湯中易形成長鏈，管底形成絮狀沉淀。在血瓊脂平板上，不同菌株溶血不一。
生化特征屎腸球菌分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不被膽汁溶解。
下面以幾個試驗說明屎腸球菌作為飼料添加劑的好處(1)本發(fā)明的屎腸球菌可以制造類殺菌素在試管內(nèi)混合培養(yǎng)屎腸球菌和大腸桿菌時，屎腸球菌的繁殖曲線和單獨培養(yǎng)時相同，但是大腸桿菌則在培養(yǎng)一段時間后數(shù)量開始減少，有人認為這是因為屎腸球菌分泌乳酸，使試管內(nèi)的pH值降低，因而抑制大腸桿菌的繁殖，但是如果在試管內(nèi)加入緩沖劑，使試管內(nèi)的pH值固定時，大腸桿菌的繁殖曲線仍然相同，其實這是因為大腸桿菌分泌了所謂的"類殺菌素"殺死大腸桿菌的關(guān)系，同樣的試驗改用沙 門氏菌結(jié)果相同。
(2) 屎腸球菌的分泌物減少大腸桿菌吸附在腸上皮細胞的數(shù)量，在培養(yǎng)腸上皮細胞的試 管內(nèi)加入病原性大腸桿菌， 一段時間后每個腸上皮細胞上約吸附著5個大腸桿菌，但是如果 在加入大腸桿菌的同時加入屎腸球菌的培養(yǎng)上清液，則只有約2個大腸桿菌吸附在腸上皮細 胞上，這是因為屎腸球菌產(chǎn)生一種分泌物會抑制病原菌吸附在腸上皮細胞上。
(3) 屎腸球菌的培養(yǎng)上清液降低感染傷寒桿菌的小白鼠的死亡率對照組的小白鼠只用 傷寒桿菌感染，試驗組的小白鼠感染傷寒桿菌的同時另外給予屎腸球菌的培養(yǎng)上清液，第io 天和第15天使對照組的死亡率分別為65%和85%，而試驗組的死亡率則分別為30%和40%， 此試驗證明屎腸球菌的培養(yǎng)上清液不只在試管內(nèi)可以抑制病原菌，在活體內(nèi)也可以抑制病原
菌o
(4) 屎腸球菌抑制仔豬腸道內(nèi)的大腸桿菌28日齡仔豬給予含有屎腸球菌詞料添加劑 的飼料，發(fā)現(xiàn)試驗組腸道內(nèi)腸球菌的數(shù)量顯著的比對照組仔豬多，相對的大腸桿菌的數(shù)量則 顯著的比對照組少。同時發(fā)現(xiàn)試驗組腸道內(nèi)的另一種乳酸菌，乳酸桿菌的數(shù)量比對照組多很 多，原因是屎腸球菌在腸道內(nèi)制造一個適合其他乳酸菌生長繁殖的環(huán)境。
(5) 屎腸球菌刺激免疫系統(tǒng)帶有腫瘤的大白鼠其巨噬細胞(Macrophage)吞噬熒光顆粒 的比例約為30%，投與含有屎腸球菌飼料添加劑的飼料后，巨噬細胞吞噬熒光顆粒的比例提 高到約為45%，正常大白鼠的巨噬細胞吞噬熒光顆粒的比例約為60%。
(6) 屎腸球菌剌激免疫系統(tǒng)小白鼠給予屎腸球菌12小時后其血液中的干擾素的量約 為對照組的6倍多。
(7) 屎腸球菌保護腸道中其他的乳酸菌群使用修正流動培養(yǎng)系統(tǒng)(類似活體腸道內(nèi)的 情況)培養(yǎng)屎腸球菌和L. acidophilus,對照組只培養(yǎng)L. acidophilus,試驗組同時培養(yǎng)屎腸球 菌和L. acidophilus,第3-6天給予AmpiciUin,給予AmpiciUin后對照組L. acidophilus數(shù)量很 快的減少，停用AmpiciUin后數(shù)量慢慢回升，但和屎腸球菌混合培養(yǎng)的試驗組給予AmpiciUin 后L. acidophilus的數(shù)量慢慢減少，停用AmpiciUin后L. acidophilus的數(shù)量很快的回升，可見 屎腸球菌可保護L. acidophilus,使之較不受AmpiciUin的縧響。
(8) 屎腸球菌保護腸道腮紅的其他的乳酸菌群與(7)類似的試驗，只是L. acidophilus 改為L.reuteri,且AmpiciUin改為Cephalexin,給予時間為第3-12天，其結(jié)果也類似。
5屎腸球菌(Enterococcus faecium )
16S rRNAJ ，列測定結(jié)果如下:
1GGCTCAGGACGMCGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCMGTCGTACGCTTCTTTTTCCA
61CCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAMGMGAGTGGCGMCGGGTGAGTMCACGTGGGTMC
121CTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGMACAGGTGCTAATACCGTATAACMTCGAAA
181CCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGC
241ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCMGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGG
301GTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG
361AATCTTCGGCMTGGACGMAGTCTGACCGAGCMCGCCGCGTGAGTGAAGMGGTTTTC
421GGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGMGMCMGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGA
481CGGTATCTMCCAGAMGCCACGGCTMCTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT
541GGCMGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGCTTTCTTAAGTCTGA
601TGTGAAAGCCCCCGGCTCMCCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGA
661AGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGMCACCAG
721TGGCGMGGCGGCTCTCTGGTCTGTMCTGACGCTGAGGCTCGAMGCGTGGGGAGCAM
781CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAMCGATGAGTGCTMGTGTTGGAGGGTT
841TCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTMCGCATTMGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAA
901GGTTGMACTCAAAGGMTTGACGGGGGCCCGCACMGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTT
961CGMGCAACGCGAAGMCCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAG
1021CTTCCCCTTCGGGGGCMAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAG
1081ATGTTGGGTTMGTCCCGCAACGAGCGCMCCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTG
1141GGCACTCTAGCMGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGMGGTGGGGATGACGTCAAATCAT
1201CATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACMTGGGMGTACAACGAGTTGCGAA
1261GTCGCGAGGCTAAGCTMTCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCMCTC
簡GCCTGCATGAAGCCGGMTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTC
1381CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGMGTCGGTGA
1441GGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTG
權(quán)利要求
1、屎腸球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01)CCTCC NOM 209019。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腸球菌屬的屎腸球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01)，于2009年1月19日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，CCTCC NOM209019，其作為一種飼料添加劑，用于改善機體免疫力。本發(fā)明屎腸球菌Anp01(Enterococcus faecium Anp01)CCTCC M209019是一種對人和動物沒有毒性和腸病原性的正常腸道菌類，用它制成的飼料添加劑，即使在不正常的情況下，也不會制造任何毒素，在宿主動物免疫功能低下時，也不會產(chǎn)生潛在的危險，是一種純天然，沒有任何外來的抗藥性存在的飼料添加劑。
文檔編號C12N1/20GK101629155SQ200910136109
公開日2010年1月20日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者劉光輝, 峰 邵 申請人:邵 峰;劉光輝