痕量微生物快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種痕量微生物的快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會(huì)的快速發(fā)展，在工業(yè)生產(chǎn)、制藥制水、食品藥品監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域中，都亟需實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量細(xì)菌的快速實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而保證工業(yè)生產(chǎn)電子元器件的質(zhì)量，藥品、水質(zhì)及食品的質(zhì)量安全。
[0003]當(dāng)前對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)方法主要有經(jīng)典的平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法、顯微熒光計(jì)數(shù)法和當(dāng)前熱門的流式細(xì)胞術(shù)。
[0004]平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，可靠度高，成本低，但因需進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，檢測(cè)速度慢，時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)48?72小時(shí)，不能滿足特定場(chǎng)合的快速、實(shí)時(shí)性要求，同時(shí)，有些細(xì)菌的培養(yǎng)條件苛刻，當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境，如溫度、營(yíng)養(yǎng)物組成發(fā)生改變時(shí)，一些細(xì)菌會(huì)進(jìn)入一種“活的不可培養(yǎng)”狀態(tài)，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確。
[0005]顯微熒光計(jì)數(shù)法是先對(duì)目標(biāo)物品進(jìn)行染色處理后，置于熒光顯微鏡中進(jìn)行觀測(cè)，手動(dòng)計(jì)數(shù)的方法。該方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，觀測(cè)中存在較明顯的離焦情況，一次所能觀測(cè)的區(qū)域也較小，且手動(dòng)計(jì)數(shù)存在很多不確定性，計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確度不高。
[0006]流式細(xì)胞術(shù)是利用將標(biāo)本預(yù)處理后，制成單細(xì)胞懸浮液，再進(jìn)行具有特異性的、化學(xué)定量關(guān)系的染色后，懸浮液進(jìn)入流動(dòng)室，通過用激光激發(fā)，測(cè)定散射光和熒光，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌形態(tài)及各種成分的檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)具有速度快，多參數(shù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，但要求被測(cè)物濃度在幾百到幾千數(shù)量級(jí)，對(duì)于痕量微生物計(jì)數(shù)檢測(cè)誤差很大。
[0007]綜上所述，目前雖然已有很多微生物檢測(cè)方法與技術(shù)，但其中大多數(shù)方法的檢測(cè)速度或檢測(cè)精度上有很大不足，應(yīng)用范圍相當(dāng)局限，尚不能實(shí)現(xiàn)痕量微生物的快速、多參數(shù)精確檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)微生物檢測(cè)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種痕量微生物快速檢測(cè)方法，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)痕量微生物的快速實(shí)時(shí)檢測(cè)。
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的一種痕量微生物快速檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0010]步驟一、采用粒徑為小于0.Ιμπι的熒光染料對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行熒光標(biāo)記；
[0011 ]步驟二、用孔徑為0.2?Ιμπι，且為無自發(fā)熒光的濾膜和換膜過濾器對(duì)樣本溶液進(jìn)行過濾，從而將目標(biāo)微生物截留于所述濾膜上；
[0012]步驟三、由中央控制單元同步進(jìn)行熒光信號(hào)的采集和對(duì)濾膜的激光掃描，從而獲得濾膜的目標(biāo)微生物分布的二維圖像和目標(biāo)微生物的計(jì)數(shù)結(jié)果;過程如下:
[0013]準(zhǔn)直激光束經(jīng)二維掃描振鏡反射后進(jìn)入掃描透鏡，經(jīng)由二維掃描透鏡在被測(cè)濾膜上表面聚焦，發(fā)濾膜上的目標(biāo)微生物吸收激光能量，通過能級(jí)躍迀，釋放出熒光信號(hào)，該熒光信號(hào)由掃描透鏡收集，之后投射到二維掃描振鏡上，經(jīng)二維掃描透鏡反射后沿激光束入射反方向傳播，然后依次通過二向分色鏡、熒光濾光鏡、聚焦透鏡和共焦孔，進(jìn)入光電探測(cè)器轉(zhuǎn)換為模擬電信號(hào)，模擬電信號(hào)由數(shù)據(jù)采集卡轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，并最終輸出到中央控制單元，完成單點(diǎn)熒光信號(hào)采集;在中央控制單元控制下同步驅(qū)動(dòng)振鏡進(jìn)行二維激光束掃描和熒光信號(hào)采集，完成對(duì)濾膜表面一個(gè)矩形區(qū)域的檢測(cè)，獲得的信號(hào)為一維信號(hào)；之后，對(duì)采集到的一維信號(hào)進(jìn)行濾波、特征峰值提取、計(jì)數(shù)和二維圖像重構(gòu)處理，從而生成顯示目標(biāo)微生物分布狀態(tài)的二維圖像，并輸出目標(biāo)微生物的計(jì)數(shù)結(jié)果。
[0014]其中，步驟三中，對(duì)濾膜的激光掃描是利用激光掃描系統(tǒng)對(duì)步驟二獲得的截留有微生物的濾膜進(jìn)行激光掃描，所述激光掃描系統(tǒng)的光學(xué)景深大于1 Ομπι?200μηι，優(yōu)選30?ΙΟΟμπι。所述激光掃描系統(tǒng)的波長(zhǎng)根據(jù)步驟一所用的熒光染料特性決定，激光波長(zhǎng)為所選用熒光染料的峰值吸收波長(zhǎng)，所述激光掃描系統(tǒng)的功率設(shè)計(jì)為1?200mw，優(yōu)選10?50mw
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0016](1)通用性好:可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)微生物的檢測(cè)，而可以檢測(cè)區(qū)分死活細(xì)菌，具有良好的通用性。
[0017](2)速度快:由于檢測(cè)不需要進(jìn)行培養(yǎng)，并且掃描的速度也非?？?，因此，總體檢測(cè)的速度很快，完成單個(gè)樣本的檢測(cè)時(shí)間在15分鐘內(nèi)(包括樣本前期準(zhǔn)備時(shí)間)。
[0018](3)痕量檢測(cè):檢測(cè)下限低，可以檢測(cè)細(xì)菌的范圍從1?50000，尤其對(duì)細(xì)菌數(shù)量在100以下的樣本液仍可以完成快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明痕量微生物快速檢測(cè)方法的流程示意圖；
[0020]圖2為本發(fā)明痕量微生物快速檢測(cè)方法實(shí)施步驟的流程示意圖；
[0021 ]圖3為本發(fā)明痕量微生物快速檢測(cè)方法濾膜熒光檢測(cè)流程示意圖；
[0022]圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)細(xì)菌液所得圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)描述，所描述的具體實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋說明，并不用以限制本發(fā)明。
[0024]本發(fā)明一種痕量微生物快速檢測(cè)方法，其中，需要用到的器件通常包括中央控制單元、數(shù)據(jù)采集卡、光電探測(cè)器、激光器、二向分色鏡、熒光濾光鏡、聚焦透鏡、二維掃描振鏡、掃描透鏡、濾膜和共焦孔，如圖3所示;該檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0025]步驟一、熒光標(biāo)記:采用粒徑小于0.Ιμπι的熒光染料對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行熒光標(biāo)記，所述熒光標(biāo)記通過選取特定波長(zhǎng)激發(fā)的熒光標(biāo)記物，對(duì)微生物特定組分進(jìn)行標(biāo)記，熒光標(biāo)記物與微生物特定組分結(jié)合后，在激光激發(fā)下，量子產(chǎn)率得到極大提高，熒光強(qiáng)度會(huì)得到極大增強(qiáng)；
[0026]步驟二、溶液過濾:選取孔徑為0.2?Ιμπι、且為無自發(fā)熒光的濾膜和換膜過濾器對(duì)樣本溶液進(jìn)行過濾，濾膜自身無熒光效應(yīng)，通過濾膜對(duì)水溶液過濾，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物與水的分離，由于熒光染料(粒徑為小于0.Ιμπι)自身不會(huì)被濾膜截留，因此，把目標(biāo)微生物截留于所述濾膜上面；
[0027]步驟三、樣本掃描:把過濾后的樣本置于雙振鏡掃描檢測(cè)系統(tǒng)平臺(tái)中，點(diǎn)亮激光器，特定激發(fā)波長(zhǎng)激光通過光路后，對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行熒光激發(fā)，在檢測(cè)系統(tǒng)中，通過設(shè)定大光束雙振鏡系統(tǒng)擺動(dòng)的方式、速度，光斑隨雙振鏡系統(tǒng)擺動(dòng)而移動(dòng)進(jìn)行掃描，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)微生物的快速移動(dòng)掃描。即由中央控制單元同步進(jìn)行對(duì)濾膜的激光掃描和熒光信號(hào)的采集，從而獲得濾膜的目標(biāo)微生物分布的二維圖像和目標(biāo)微生物的計(jì)數(shù)結(jié)果;過程是:準(zhǔn)直激光束經(jīng)二維掃描振鏡反射后進(jìn)入掃描透鏡，經(jīng)由二維掃描透鏡在被測(cè)濾膜上表面聚焦，發(fā)濾膜上的目標(biāo)微生物吸收激光能量，通過能級(jí)躍迀，釋放出熒光信號(hào)，該熒光信號(hào)由掃描透鏡收集，之后投射到二維掃描振鏡上，經(jīng)二維掃描透鏡反射后沿激光束入射反方向傳播，然后依次通過二向分色鏡、熒光濾光鏡、聚焦透鏡和共焦孔，進(jìn)入光電探測(cè)器轉(zhuǎn)換為模擬電信號(hào)，模擬電信號(hào)由數(shù)據(jù)采集卡轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，并最終輸出到中央控制單元，完成單點(diǎn)熒光信號(hào)采集;在中央控制單元控制下同步驅(qū)動(dòng)振鏡進(jìn)行二維激光束掃描和熒光信號(hào)采集，完成對(duì)濾膜表面一個(gè)矩形區(qū)域的檢測(cè)，獲得的信號(hào)為一維信號(hào)。之后，對(duì)采集到的一維信號(hào)進(jìn)行濾波、特征峰值提取、計(jì)數(shù)和二維圖像重構(gòu)處理，生成顯示目標(biāo)微生物分布狀態(tài)的二維圖像，并輸出目標(biāo)微生物