一種基于lamp技術(shù)的旋毛蟲(chóng)快速檢測(cè)方法及引物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于LAMP技術(shù)的旋 毛蟲(chóng)快速檢測(cè)方法及引物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 旋毛蟲(chóng)病是世界性分布的人獸共患寄生蟲(chóng)病，該病流行于哺乳動(dòng)物間，人和動(dòng)物 因生吃或半熟食含旋毛蟲(chóng)包囊的肉品而感染。該病危害十分嚴(yán)重，不但給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成 巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)人類健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。我國(guó)是世界上該病危害最為嚴(yán)重的少數(shù)幾 個(gè)國(guó)家之一，現(xiàn)已將其列為3大人獸共患寄生蟲(chóng)?。ㄐx(chóng)病，囊蟲(chóng)病及棘球蝴?。┲?， 而且作為肉類進(jìn)出口、屠宰動(dòng)物以及我國(guó)政府提出讓人民吃上"放心肉"首檢和必檢的人獸 共患病。
[0003] 我國(guó)已發(fā)現(xiàn)多種動(dòng)物能感染旋毛蟲(chóng)病，分別為豬、犬、牛、貓、羊、鼠、狐貍、黃鼠狼、 貂、貉、熊及麂，除海南和臺(tái)灣尚無(wú)相關(guān)資料報(bào)道外，其它省區(qū)均已成為動(dòng)物旋毛蟲(chóng)病流行 區(qū)。我國(guó)豬的感染十分普遍，一些高發(fā)省份和地區(qū)，感染率高達(dá)10 %~30 %。資料顯示，我 國(guó)自1964年至2004年已暴發(fā)流行旋毛蟲(chóng)病600余起，報(bào)道病例達(dá)26000余人，死亡250余 人，其中95%的病例由豬肉引發(fā)。近年來(lái)，隨著飼養(yǎng)動(dòng)物及居民肉類消費(fèi)量的增加，以及感 染動(dòng)物種類的增多，東北及中原地區(qū)又相繼出現(xiàn)了大量由于食用狗肉、羊肉和馬肉而暴發(fā) 人旋毛蟲(chóng)病，人的發(fā)病率不斷呈上升。衛(wèi)生部2001-2004年在全國(guó)組織開(kāi)展的"第二次全國(guó) 人體重要寄生蟲(chóng)病現(xiàn)狀調(diào)查"結(jié)果顯示旋毛蟲(chóng)病血清陽(yáng)性率平均高達(dá)3. 38%，推測(cè)目前我 國(guó)人旋毛蟲(chóng)病隱性感染高達(dá)4千余萬(wàn)人。
[0004] 進(jìn)行動(dòng)物肉品旋毛蟲(chóng)病的檢驗(yàn)檢疫對(duì)預(yù)防該病的感染和傳播具有重大意義。目 前，我國(guó)動(dòng)物旋毛蟲(chóng)病的檢疫中主要使用鏡檢法和消化法，具有操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但需要檢 疫者具有很好的專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，工作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度大，此外，肉品感染強(qiáng)度較低時(shí)容易 出現(xiàn)漏檢。PCR診斷技術(shù)大大提高了檢驗(yàn)檢疫方法的敏感性，然而因PCR儀價(jià)格較高、擴(kuò) 增產(chǎn)物需要進(jìn)行電泳分析等不利因素，該方法的應(yīng)用受到很大的限制。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技術(shù)于 2000 年由Notomi等人建立， 該方法是一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏、特異、低成本的核酸擴(kuò)增方法，在等溫條件下和較短的時(shí)間 內(nèi)可將目標(biāo)基因進(jìn)行大量擴(kuò)增，已應(yīng)用到病毒、細(xì)菌等病原的檢測(cè)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種基于LAMP技術(shù)的旋毛蟲(chóng)快 速檢測(cè)方法及引物組合物。
[0006] 提供一種能快速準(zhǔn)確檢測(cè)動(dòng)物肉品和肉制品中旋毛蟲(chóng)的方法。
[0007] 本發(fā)明可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一種用于檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的特異性的LAMP引物組合物，由F3、B3、FIP和BIP四條引物 組成，F(xiàn)3、B3、FIP和BIP引物序列分別如SEQIDNO. 1-SEQIDN0. 4所示。
[0009] 本發(fā)明所述的引物組合物在制備旋毛蟲(chóng)檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0010] 一種用于檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的LAMP檢測(cè)試劑盒，包含所述的特異性的LAMP引物組合物。
[0011] 所述的用于檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的LAMP檢測(cè)試劑盒，優(yōu)選包含：10μmol/L的FIP， 10ymol/L的BIP，10ymol/L的F3、10ymol/L的B3,10mmol/L的dNTPs，5mol/L甜菜堿， 0·lmol/L的MgS04,8μ/μ1 的BstDNA聚合酶，lOXBstDNAΒμffer以及ddH20。
[0012] 所述的用于檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的LAMP檢測(cè)試劑盒，還包括SYBRGreenI染料。
[0013] -種檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的方法，提取待檢樣品中全基因，以提取的DNA為模板，利用本發(fā) 明所述的特異性的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；取LAMP擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1 %的 瓊脂糖凝膠電泳，如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在其特有的階梯狀擴(kuò)增條帶則表示結(jié)果為陽(yáng)性，樣品 中含有旋毛蟲(chóng)，如果沒(méi)有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生則表示結(jié)果為陰性；或者向LAMP擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加 入SYBRGreenI染料，在日常光和/或紫外光下檢測(cè)，如果反應(yīng)產(chǎn)物在日常光下顯綠色、在 紫外光下產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，則表示結(jié)果為陽(yáng)性，樣品中含有旋毛蟲(chóng)，如果反應(yīng)產(chǎn)物在日常光下 顯橙色、紫外光下無(wú)熒光產(chǎn)生則表示結(jié)果為陰性。
[0014] 所述的檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的方法，優(yōu)選包括以下步驟：
[0015] (1)提取待檢樣品DNA;
[0016] ⑵按照以下順序分別加入：
[0017]
[0018] 將上述反應(yīng)體系充分混勻，95°C水浴鍋中孵育5min后，立即轉(zhuǎn)移至冰水中孵育 lmin，再加入BstDNA聚合酶（8U/μ1) 1μ1，充分混勻；
[0019] (3)將該反應(yīng)體系置于63°C的恒溫水浴鍋中孵育45-60min;
[0020] (4)將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到80C的丨旦溫水洛鍋中保溫10min;
[0021] (5)取5μ1反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)是否能夠擴(kuò)增出階梯狀擴(kuò) 增條帶來(lái)判斷結(jié)果；或者向剩余的20μ1反應(yīng)產(chǎn)物中加入0. 5μ1SYBRGreenI，觀察顏色 變化判斷結(jié)果。
[0022] 本發(fā)明所述的引物組合物在檢測(cè)肉制品中旋毛蟲(chóng)的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明基于LAMP檢測(cè)技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)，以旋毛蟲(chóng)ITSII基因?yàn)榉肿影袠?biāo)，設(shè)計(jì)其 獨(dú)特的引物，建立了旋毛蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法，對(duì)該方法的敏感性和特異性進(jìn)行了分析，并將 該檢測(cè)方法應(yīng)用于市售肉品的檢測(cè)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0024] 1.該引物組合物和對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)旋毛蟲(chóng)、 大腸桿菌、豬囊蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)等不同病原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果能且只能從旋毛蟲(chóng)樣品中獲得陽(yáng)性擴(kuò) 增。該檢測(cè)方法敏感性是普通PCR檢測(cè)技術(shù)的1000倍，1克肉品中含1條肌肉幼蟲(chóng)時(shí)也能 檢測(cè)出來(lái)。
[0025] 2.該檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)便、所需時(shí)間短、不需要特殊儀器，所需試劑價(jià)格便宜，幾乎 所有實(shí)驗(yàn)室都能進(jìn)行操作。提取肌肉樣品中DNA后，取適量DNA至反應(yīng)緩沖液中，至恒溫水 浴鍋或培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘即可直接觀察結(jié)果。該檢測(cè)方法具有方便、快速、價(jià)廉等優(yōu) 勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1旋毛蟲(chóng)ITS-II基因的擴(kuò)增
[0027] A.常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Marker，1為陰性對(duì)照（橙色），2 為旋毛蟲(chóng)（綠色）
[0028]B.LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Marker，1為陰性對(duì)照（橙色），2為旋 毛蟲(chóng)（綠色）
[0029]C.LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物顯色圖：1為陰性對(duì)照（橙色），2為旋毛蟲(chóng)（綠色）
[0030]圖2LAMP檢測(cè)技術(shù)敏感性（模板進(jìn)行梯度稀釋）
[0031] A.常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Marker，1-9分別為旋毛蟲(chóng)DNA進(jìn) 行 106、107、108、109、101Q、1011、1012、1013、10 14 倍稀釋
[0032]B. LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Marker，1-9分別為旋毛蟲(chóng)DNA進(jìn)行 ?ο6、?ο7、?ο8、?ο9、?ο10、1011、1012、1013、10 14 倍稀釋
[0033]C.LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物顯色圖：1-9分別為旋毛蟲(chóng)DNA進(jìn)行ΚΛ?Ο'ΚΛ?Ο'ΙΟ'ΙΟ11、 1012、1013、10 14倍稀釋，其中1~7泳道顯綠色，8、9泳道顯橙色。
[0034] 圖3LAMP檢測(cè)技術(shù)敏感性（不同旋毛蟲(chóng)添加量）
[0035]A. LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Marker，1-5分別為在1克肌肉中添加 0、1、3、5、10條肌肉旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)
[0036]B.LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物顯色圖：1-5分別為在1克肌肉中添加0、1、3、5和10條肌肉旋毛 蟲(chóng)幼蟲(chóng)，1泳道顯橙色，2~5泳道顯綠色。
[0037] 圖4LAMP檢測(cè)技術(shù)特異性
[0038]A.LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Marker，1-7分別為旋毛蟲(chóng)、柔嫩艾美 爾球蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)、豬囊蟲(chóng)、大腸桿菌等病原的DNA
[0039]B.LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物顯色圖：1_7分別為旋毛蟲(chóng)、柔嫩艾美爾球蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、弓 形蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)、豬囊蟲(chóng)、大腸桿菌等病原的DNA;1和5泳道顯綠色，其與泳道顯橙色。
[0040] 圖5LAMP檢測(cè)技術(shù)用于豬肉樣品的檢測(cè)
[0041]A.常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Marker，1為陽(yáng)性對(duì)照，2-11分別 為10個(gè)不同的豬舌肌肉樣品
[0042]B.LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子Marker，1為陽(yáng)性對(duì)照，2-11分別為10 個(gè)不同的豬舌肌肉樣品
[0043] C. LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物顯色圖：1為陽(yáng)性對(duì)照（綠色），2-11分別為10個(gè)不同的豬舌肌 肉樣品（橙色）。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 基礎(chǔ)材料：
[0045] 1.旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)：中國(guó)河南豬旋毛蟲(chóng)分離株國(guó)際編號(hào)ISS534,由本實(shí)驗(yàn)室保 存，經(jīng)ICR小鼠傳代。
[0046] 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ICR小鼠購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0047] 3.LAMP引物：F3、B3、FIP和BIP四條引物的序列分別如SEQIDNO. 1-SEQIDN0. 4 所示。
[0048] 4.PCR引物：上、下游引物（F、B)序列分別為SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6所列。
[0049] 5.工具酶與試劑：Bst DNA聚合酶（lOXBst DNA Buffer聚合酶緩沖液）購(gòu)自上 海研托生物科技有限公司，甜菜堿（Bataine)購(gòu)自南京奧多福尼生物科技有限公司，SYBR Green I購(gòu)自北京百泰克公司，rTaq(10X緩沖液）、dNTPs、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000和 DL5000購(gòu)自寶生物工程（TakaRa大連）有限公司，DAN提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，其余試 劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0050] 6.待檢測(cè)樣品：動(dòng)物舌肌樣品110份，從菜市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買，其中豬舌肌肉樣品70 份，鴨舌、雞舌、羊舌和牛舌等肌肉樣品各10份。
[0051] 7.主要儀器設(shè)備：冷凍臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorfcentrifuge5417R)，紫外可見(jiàn)分 光光度計(jì)（Bio-Rad) ;PCR擴(kuò)增儀（Biometra公司）隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GRP-9050型上海森 信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；電泳儀（DYY-11B，北京市六一儀器廠）；電熱恒溫水槽（DK-8D型上 海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad);電泳儀（DYY-11B，北京市六一儀器 廠）。