一種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用細(xì)胞系生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽腦脊髓炎（Avian Encephalomyelitis; AE)又稱流行性震顫，是由禽腦脊髓炎 病毒（AEV)引起的一種主要危害4周齡以下雛雞，以侵害雛雞中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起雛雞非 化膿性腦炎為主要病理特征的病毒性傳染病，病雛主要表現(xiàn)為運(yùn)動失調(diào)、頭頸震顫和后趾 麻痹等神經(jīng)癥狀。具有突然出現(xiàn)和難以預(yù)測持續(xù)期等特點(diǎn)，能造成雛雞的損失和母雞產(chǎn)蛋 率的下降，成為當(dāng)前世界上危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。我國自80年代中期有此病發(fā) 生的報道以來，在全國各地均有發(fā)生和流行，給養(yǎng)雞業(yè)造成了較大的損失。目前該病尚無 有效的治療藥物，因此預(yù)防免疫顯得更為重要。
[0003] 禽腦脊髓炎病毒（AEV)屬于小RNA病毒科，肝病毒屬，能在易感雞群的雛雞、雞胚 中高效價繁殖。國內(nèi)外已有應(yīng)用原代雞胚源細(xì)胞(雞胚成纖維、腎細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰細(xì) 胞等)培養(yǎng)禽腦脊髓炎病毒的研究報道，但病毒效價低，均不超過1〇 3_ 5EID5tZml。還未有成功 應(yīng)用細(xì)胞系培養(yǎng)禽腦脊髓炎病毒的報道，目前禽腦脊髓炎病毒疫苗制備均采用雞胚法。用 雞胚培養(yǎng)禽腦脊髓炎病毒，需要用大量SPF雞胚，生產(chǎn)成本高、勞動強(qiáng)度大、產(chǎn)品批間差異 大，給疫苗產(chǎn)量、質(zhì)量的提高帶來困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷提供一種利用細(xì)胞系生產(chǎn)禽 腦脊髓病毒滅活疫苗的方法。
[0005] 本發(fā)明所述技術(shù)問題是由以下技術(shù)方案解決的。
[0006] -種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，包括如下步驟： a. 選擇細(xì)胞系作為制苗用細(xì)胞； b. 制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng) 制苗用細(xì)胞形成良好單層時，經(jīng)EDTA-胰酶消化后，加入細(xì)胞生長液制備成細(xì)胞懸液， 用于繼續(xù)傳代或接種病毒； c. 生產(chǎn)用毒種的繁殖 將制苗用細(xì)胞懸液，分裝細(xì)胞培養(yǎng)瓶，同時接種禽腦脊髓炎雞胚組織毒，培養(yǎng)72h時更 換細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，收獲培養(yǎng)物，為一代細(xì)胞毒；一代細(xì)胞毒傳代培養(yǎng)，為二 代細(xì)胞毒；取一代、二代細(xì)胞毒作為生產(chǎn)用毒種； d. 生產(chǎn)制苗毒液 將制苗用細(xì)胞懸液，分裝細(xì)胞培養(yǎng)瓶，同時接入禽腦脊髓炎病毒生產(chǎn)用毒種進(jìn)行培養(yǎng)， 72h時更換細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，收獲培養(yǎng)物，-15°C保存。
[0007] e.疫苗制備 將收獲的制苗毒液滅活后加入佐劑，乳化制備成禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗。
[0008] 上述生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，所述步驟a中細(xì)胞系是幼倉鼠腎傳代 細(xì)胞（BHK21)、雞胚成纖維細(xì)胞系（DF-1)。幼倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK21)經(jīng)過有限稀釋法克隆 純化篩選。
[0009] 上述生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，所述步驟c和d中，禽腦脊髓炎雞胚組 織毒的接種量為細(xì)胞生長液的〇. 5%~2% (V/V)，細(xì)胞毒接種量為細(xì)胞生長液的1%~3% (V/V)〇
[0010] 上述生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，所述步驟c和d中，在幼倉鼠腎傳代細(xì) 胞（BHK21)接種病毒后，37°C培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)為33°C再培養(yǎng)96h~120h。
[0011] 上述生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，所述步驟c和d中，在雞胚成纖維細(xì)胞 系（DF-I)接種病毒后，37°C培養(yǎng)120 h~144 h。
[0012] 上述生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，所述步驟b中，細(xì)胞生長液的配方是： 體積百分含量90~92%低糖DMEM或DMEM/F12液、8~10%新生牛血清、適量的抗生素 ，pH 值調(diào)整為7. 0-7. 4。
[0013] 上述生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，所述步驟c和d中，細(xì)胞維持液的配方 是：體積百分含量97~99%低糖DMEM或DMEM/F12液、1~3%新生牛血清、適量的抗生素， pH值調(diào)整為7. 2-7. 4。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 1. 在本發(fā)明中，用細(xì)胞系替代雞胚培養(yǎng)禽腦脊髓炎病毒，病毒適應(yīng)性好、效價高； 2. 在本發(fā)明中，幼倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK21)經(jīng)過純化篩選，提高了細(xì)胞對病毒的敏感 性，保證了細(xì)胞的狀態(tài)均一，減小批次間差異，確保生產(chǎn)工藝參數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定； 3. 本發(fā)明中，病毒接種時采用同步接種法，無需吸附，簡化操作，節(jié)省人力； 4. 本發(fā)明中，在幼倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK21)接種病毒24h后，降低培養(yǎng)溫度，減慢了細(xì) 胞老化速度，提升了細(xì)胞活力，提高了病毒效價； 5. 本發(fā)明中，用細(xì)胞系生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗批間質(zhì)量差異小，具有生產(chǎn)工藝 簡單穩(wěn)定、易操作、產(chǎn)量大、成本低、外源病毒污染幾率小等特點(diǎn)，具備工業(yè)化大生產(chǎn)的可行 性和可放大性，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，其中各實(shí)施例僅用于解釋本發(fā) 明的技術(shù)方案、而并非限定本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。
[0016] 實(shí)施例1有限稀釋法克隆純化篩選幼倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK21) 幼倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK21)、禽腦脊髓炎病毒Van Roekel株（AEV VR株)均購自中國獸 醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0017] 細(xì)胞生長液的配方為體積百分含量為92%低糖DMEM液，8%新生牛血清，調(diào)整PH 值為7. 2 ; A.單克隆細(xì)胞株制備 a.細(xì)胞的有限稀釋 制備BHK21細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用細(xì)胞生長液進(jìn)行梯度稀釋到IO1個細(xì)胞/ml，即每 0.1 ml 1個細(xì)胞。
[0018] b.細(xì)胞的克隆培養(yǎng) 將上述稀釋好的細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.1 ml/孔，顯微鏡下觀察，棄去非 單一細(xì)胞并且細(xì)胞狀態(tài)不佳的細(xì)胞孔，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并及 時換液，待細(xì)胞增殖為克隆群落，選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞孔，用EDTA-胰酶進(jìn)行消化，制 成懸液，重復(fù)上述克隆方法1~2次，直至篩選出單克隆生長孔。
[0019] c.單克隆化細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng) 選取單克隆生長孔，用EDTA-胰酶消化，先后經(jīng)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò) 大培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)到一定數(shù)量，進(jìn)行單克隆細(xì)胞的凍存及細(xì)胞庫的建立。
[0020] B.禽腦脊髓炎病毒高適應(yīng)性細(xì)胞株的篩選 a. BHK21單克隆細(xì)胞株接種禽腦脊髓炎雞胚組織毒 按V:V 1%接種量將禽腦脊髓炎病毒雞胚組織毒接種BHK21單克隆細(xì)胞株，37°C培養(yǎng) 94h，收獲病毒液。收獲病毒液凍融3次后，接種BHK21單克隆細(xì)胞，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連傳6 代。
[0021] b. BHK21單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)禽腦脊髓炎病毒的EID5tl檢測 將病毒液用滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，經(jīng)卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚，置37°C孵 育288h，判定。按照《中華人民共和國獸藥典》（三部、2010年版）記載方法計(jì)算EID5Q。
[0022] C.結(jié)果 a.禽腦脊髓炎病毒疫苗株高適應(yīng)性BHK21單克隆細(xì)胞株的篩選。
[0023] 通過有限稀釋法擴(kuò)大培養(yǎng)獲得BHK21單克隆細(xì)胞株32株。通過禽腦脊髓炎病毒 疫苗株感染BHK21單克隆細(xì)胞株后EID 5tl的檢測，篩選出1株BHK21單克隆細(xì)胞：第26株， 為禽腦脊髓炎病毒疫苗株高適應(yīng)性BHK21單克隆細(xì)胞株，并標(biāo)號為B26。
[0024] b.禽腦脊髓炎病毒疫苗株感染BHK21單克隆細(xì)胞株的EID5Q。
[0025] 表1禽腦脊髓炎病毒疫苗株感染B26單克隆細(xì)胞株的EID5tl
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，其特征在于：包括如下步驟： a. 選擇細(xì)胞系作為制苗用細(xì)胞； b. 制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng) 制苗用細(xì)胞形成良好單層時，經(jīng)EDTA-胰酶消化后，加入細(xì)胞生長液制備成細(xì)胞懸液， 用于繼續(xù)傳代或接種病毒； c. 生產(chǎn)用毒種的繁殖 將制苗用細(xì)胞懸液，分裝細(xì)胞培養(yǎng)瓶，同時接種禽腦脊髓炎雞胚組織毒，培養(yǎng)72h時更 換細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，收獲培養(yǎng)物，為一代細(xì)胞毒；一代細(xì)胞毒傳代培養(yǎng)，為二 代細(xì)胞毒；取一代、二代細(xì)胞毒作為生產(chǎn)用毒種； d. 生產(chǎn)制苗毒液 將制苗用細(xì)胞懸液，分裝細(xì)胞培養(yǎng)瓶，同時接入禽腦脊髓炎病毒生產(chǎn)用毒種進(jìn)行培養(yǎng)， 72h時更換細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，收獲培養(yǎng)物，-15°C保存； e. 疫苗制備 將收獲的制苗毒液滅活后加入佐劑，乳化制備成禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步 驟a中細(xì)胞系是幼倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK21)、雞胚成纖維細(xì)胞系（DF-I);幼倉鼠腎傳代細(xì)胞 (BHK21)經(jīng)過有限稀釋法克隆純化篩選。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步 驟c和d中，禽腦脊髓炎雞胚組織毒的接種量為細(xì)胞生長液的0. 5%~2% (V/V)，細(xì)胞毒接 種量為細(xì)胞生長液的1%~3% (V/V)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步 驟c和d中，在幼倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK21)接種病毒后，37°C培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)為33°C再培養(yǎng) 96h~120h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步 驟c和d中，在雞胚成纖維細(xì)胞系（DF-I)接種病毒后，37°C培養(yǎng)120h~144h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步 驟b中，細(xì)胞生長液的配方是：體積百分含量90~92%低糖DMEM或DMEM/F12液、8~10% 新生牛血清、適量的抗生素，pH值調(diào)整為7. 0-7. 4。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步 驟c和d中，細(xì)胞維持液的配方是：體積百分含量97~99%低糖DMEM或DMEM/F12液、1~ 3%新生牛血清、適量的抗生素，pH值調(diào)整為7. 2-7. 4。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗的方法，所述方法包括以下步驟：a.選擇細(xì)胞系作為制苗用細(xì)胞；b.制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)；c.生產(chǎn)用毒種的繁殖；d.生產(chǎn)制苗毒液；e.疫苗制備。本發(fā)明采用傳代細(xì)胞系作為制苗用細(xì)胞，并篩選了敏感細(xì)胞系，加強(qiáng)了病毒與細(xì)胞的匹配性。本發(fā)明具有生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定、易操作、批間差異小、成本低等特點(diǎn)，生產(chǎn)的禽腦脊髓炎病毒滅活疫苗安全性和免疫原性好。CCTCC NO：C201420920141112
【IPC分類】C12N7-00, A61P31-14, A61K39-125
【公開號】CN104689311
【申請?zhí)枴緾N201410846776
【發(fā)明人】韓佳麗, 邱貞娜, 梁武, 劉濤, 柳珊, 朱秀同, 郁宏偉, 楊保收, 何平有, 徐倩倩, 鄭朝朝
【申請人】瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2014年12月31日