一種分離純化的無(wú)細(xì)胞百白破-b型流感嗜血桿菌-A群C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于疫苗生產(chǎn)制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離純化的無(wú)細(xì)胞百白破_b 型流感嗜血桿菌-A群C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 百日咳、白喉、破傷風(fēng)等疾病在我國(guó)流行范圍廣、危害嚴(yán)重，及時(shí)進(jìn)行疫苗接種是 有效的預(yù)防保護(hù)性措施。百日咳、白喉和破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗（DTP)作為最早納入WHO擴(kuò)大免 疫計(jì)劃（EPI)的疫苗，已經(jīng)在預(yù)防和控制這三種傳染病方面發(fā)揮了重要作用。20世紀(jì)70年 代，由于接種全細(xì)胞百白破疫苗（DTwP)后出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)，日本及荷蘭等國(guó)家出現(xiàn) 了抵制疫苗接種及停用的現(xiàn)象，導(dǎo)致接種率下降，致使百日咳的發(fā)病率出現(xiàn)反彈。目前，絕 大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家均已經(jīng)采用副反應(yīng)較小的無(wú)細(xì)胞百白破疫苗（DTaP)為基礎(chǔ)的聯(lián)合疫苗， 作為常規(guī)免疫用疫苗。無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗從生產(chǎn)工藝來(lái)講可分為共純化疫苗和分離純化疫 苗。目前中國(guó)和日本部分企業(yè)采用的是共純化工藝，即細(xì)菌培養(yǎng)后，鹽析沉淀PT、FHA等保 護(hù)性抗原，然后用蔗糖密度梯度離心去除雜質(zhì)，同時(shí)收集富含PT和FHA的有效成分。分離 純化是采用柱層析將不同的保護(hù)性抗原分別純化，然后再將各抗原定量配比成疫苗。分離 純化法的成本較高，但優(yōu)點(diǎn)是成分明確，容易進(jìn)行質(zhì)量控制，副作用更小。目前大多數(shù)發(fā)達(dá) 國(guó)家均采用柱層析分離純化各組份來(lái)生產(chǎn)無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗。
[0003] 流感嗜血桿菌（Haemophilus Influenza, Hi)迄今仍是導(dǎo)致人類(lèi)侵襲性疾病的主 要致病菌，其中絕大部分由b型流感嗜血桿菌（Haemophilus Influenza type b，Hib)引 起。Hib腦膜炎居細(xì)菌性腦膜炎的首位，具有發(fā)病率高、病死率高和致殘率高的特點(diǎn)；其另 一個(gè)特點(diǎn)是發(fā)病年齡小，嬰幼兒感染率高，發(fā)病年齡主要集中在5歲以下，尤其是2歲以下。 全世界估計(jì)每年至少造成300萬(wàn)例嚴(yán)重疾病，其中約38. 6萬(wàn)人死亡，已成為全球性的一大 公共衛(wèi)生問(wèn)題。在發(fā)展中國(guó)家，Hib肺炎在兒童感染性疾病中占有重要地位，約占所有兒童 肺炎的20%，是發(fā)展中國(guó)家兒童肺炎的重要死亡原因。上世紀(jì)90年代初，西歐、美洲等國(guó) 家將Hib結(jié)合疫苗納入常規(guī)兒童免疫規(guī)劃，Hib侵襲性疾病的發(fā)病率迅速降低或消失。目 前，世界衛(wèi)生組織（WHO)正致力于推動(dòng)將其納入其它國(guó)家的計(jì)劃免疫程序中。在我國(guó)，3~ 5歲兒童中Hib自然感染抗體水平低，為Hib感染高危人群。我國(guó)醫(yī)院臨床研究提示，Hib 腦膜炎在小兒化膿性腦膜炎中占51. 7%，其中84%為2歲以下兒童；兒童中Hib肺炎占 34. 3%，因此我國(guó)有使用Hib結(jié)合疫苗的必要。
[0004] 流行性腦脊髓膜炎是一種由奈瑟氏腦膜炎球菌（Neisseriameningitidis)引起 的急性呼吸道傳染病。一百多年來(lái)，一直在世界各地流行或散在發(fā)生，感染病原菌后可引 起敗血癥、腦膜炎。易感人群主要為兒童，以暴發(fā)型病死率最高，可達(dá)40%~60%。當(dāng)今 世界各大洲發(fā)病率在1/10萬(wàn)~10/10萬(wàn)，總病死率在5%~15%，高達(dá)20%的腦膜炎患 者會(huì)有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括智力受損和耳聾等。根據(jù)莢膜多糖型別進(jìn)行血清學(xué)分類(lèi)可分 13個(gè)血清型，其中A群，B群，C群約占流行菌群的90%。我國(guó)于1938年、1949年、1959 年、1967年和1977年發(fā)生過(guò)5次全國(guó)性流腦流行。其中以1967年春季最為嚴(yán)重，發(fā)病率 高達(dá)403/10萬(wàn)，病死率為5. 49%。我國(guó)過(guò)去90%以上的病例是A群病菌致病，現(xiàn)在B群 或C群病菌有時(shí)亦引起流腦暴發(fā)。2003年開(kāi)始，C群流腦的發(fā)病率明顯上升。目前A群和 C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有進(jìn)一步增高的趨勢(shì)。目前預(yù)防流腦最有效的 方法是接種疫苗。我國(guó)從2007年起已將流腦疫苗納入國(guó)家免疫規(guī)劃，在全國(guó)范圍對(duì)適齡兒 童普及接種。
[0005] 目前在全世界可通過(guò)免疫接種來(lái)預(yù)防的疾病已經(jīng)達(dá)三十多種，其中大部分是針對(duì) 兒童接種。自1974年WHO推行擴(kuò)大免疫計(jì)劃以來(lái)，疫苗的接種覆蓋率得到大大提高，接種 次數(shù)也不斷增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，兒童入學(xué)前需接受預(yù)防接種21次左右，在未來(lái)還會(huì)有新的疫苗 不斷研究和開(kāi)發(fā)出來(lái)，因此兒童免疫計(jì)劃表中的疫苗種類(lèi)也會(huì)隨之增加。為了在兒童期有 限的時(shí)間內(nèi)減少接種次數(shù)同時(shí)又能預(yù)防更多疾病，迫切需要研究開(kāi)發(fā)聯(lián)合疫苗。
[0006] 聯(lián)合疫苗較以往的單價(jià)疫苗有很多優(yōu)勢(shì)，如更少的接種次數(shù)，降低嬰幼兒創(chuàng)傷；提 高國(guó)家免疫計(jì)劃表的實(shí)施效率，減少漏種；更高的免疫覆蓋率；更低的空間存放要求；便于 未來(lái)增加新品種疫苗到免疫計(jì)劃表中。因此從某種意義上說(shuō)，聯(lián)合疫苗在預(yù)防傳染病的作 用中代表了未來(lái)疫苗的發(fā)展方向。其中，以無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗為基礎(chǔ)的多聯(lián)疫苗是近 年來(lái)的研究熱點(diǎn)，聯(lián)合疫苗中的組成成分也越來(lái)越多，如DTaP/Hib四聯(lián)疫苗；DTaP-IPV/ Hib五聯(lián)疫苗；DTaP-IPV-HBV-Hib六聯(lián)疫苗。
[0007] 由于流行病分布的差異，目前國(guó)外還未上市DTaP-b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合物 與A群C群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合物的聯(lián)合疫苗（簡(jiǎn)稱DTaP-Hib-AC)。國(guó)內(nèi)雖然有在研 制中的相似產(chǎn)品百白破-Hib-AC聯(lián)合疫苗，但其仍然采用傳統(tǒng)甲醛殺菌工藝制備全細(xì)胞百 日咳疫苗原液，副作用較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種分離純化的無(wú)細(xì)胞百白破_b 型流感嗜血桿菌-A群C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗及其制備方法，該疫苗具有安全、有效、可控 及一針?lè)蓝嗖〉奶攸c(diǎn)，制備方法操作簡(jiǎn)單、制備方便、成本低，適宜于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
[0009] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種聯(lián)合疫苗，它由A組分和B組分組 成：
[0010] 所述A組分為液體制劑，它由以下組分組成：
[0011] 百日咳毒素：5~40μ g ;絲狀血凝素：5~40μ g ;百日咳黏附素：2~10μ g ;白喉 類(lèi)毒素：1〇~25LF ;破傷風(fēng)類(lèi)毒素：4~IOLF ;氫氧化鋁：1. 0~2. Omg/ml ;氯化鈉：7. 5~ 9. 5g/L ；
[0012] 所述B組分為凍干制劑，它由以下組分組成：
[0013] A群腦膜炎多糖結(jié)合物：10~30 Ug5C群腦膜炎多糖結(jié)合物：10~30 Ug5B型流 感嗜血桿菌多糖結(jié)合物：1〇~30μ g ;乳糖：5~20mg。
[0014] 一種聯(lián)合疫苗的制備方法，它包括以下步驟：
[0015] SI.制備各單價(jià)疫苗原液：包括白喉類(lèi)毒素原液、破傷風(fēng)類(lèi)毒素原液、無(wú)細(xì)胞百日 咳疫苗原液，所述無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗原液包括百日咳毒素、絲狀血凝素和百日咳黏附素；
[0016] S2.制備液體制劑：將百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳黏附素、白喉類(lèi)毒素原液、 破傷風(fēng)類(lèi)毒素原液加入用氯化鈉稀釋的氫氧化鋁佐劑內(nèi)，調(diào)pH至5. 8~7. 2,即為無(wú)細(xì)胞百 白破疫苗半成品；
[0017] S3.制備各單價(jià)疫苗原液：包括A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結(jié) 合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液；
[0018] S4.制備凍干制劑：將A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原 液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液按照I: I: I (w/w)合并混勻，加入乳糖，用注射用水稀 釋?zhuān)礊锳C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品；
[0019] S5.分裝和包裝
[0020] 將上述制備的吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗半成品分裝于西林瓶或者預(yù)灌裝注射 器中，AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品分裝于西林瓶中進(jìn)行真空冷凍 干燥后再獨(dú)立包裝。
[0021] 進(jìn)一步地，A組分由以下步驟制備而成：
[0022] SI.制備各單價(jià)疫苗原液
[0023] SlL白喉類(lèi)毒素原液：開(kāi)啟白喉?xiàng)U菌，先在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳1~3代，再轉(zhuǎn) 至產(chǎn)毒培養(yǎng)基制成生產(chǎn)用種子；采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用改良林氏培養(yǎng)基，34~ 36°C培養(yǎng)45~52h，培養(yǎng)結(jié)束后加入甲醛殺菌，在培養(yǎng)物中加入硫酸銨沉淀雜蛋白，離心收 集上清；上清液超濾濃縮后再加入硫酸銨鹽析沉淀白喉毒素蛋白，離心收集沉淀，加生理鹽 水溶解，超濾去除毒素中的硫酸銨，加入甲醛，置35~37°C，脫毒30天，除菌過(guò)濾即為白喉 類(lèi)毒素原液；
[0024] S12.破傷風(fēng)類(lèi)毒素原液：開(kāi)啟破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌，先在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳 1~3代，再轉(zhuǎn)至產(chǎn)毒培養(yǎng)基制成生產(chǎn)用種子；采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用雙胨培養(yǎng) 基，34~36°C培養(yǎng)62~72小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后加入甲醛殺菌，培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)濾去除菌體，加入 硫酸銨沉淀毒素蛋白，離心收集沉淀，超濾去除毒素中的硫酸銨后加入甲醛，置35~37°C 脫毒30天，除菌過(guò)濾即為破傷風(fēng)類(lèi)毒素原液；
[0025] S13.無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗原液：開(kāi)啟百日咳桿菌，接種于改良包-姜培養(yǎng)基或活性 炭半綜合培養(yǎng)基，于35~37°C培養(yǎng)不超過(guò)48小時(shí)，再接種于CPB培養(yǎng)基中傳兩代，每代培 養(yǎng)時(shí)間18~26小時(shí)，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)以制備足夠的生產(chǎn)用種子，然后接種到發(fā)酵罐中液體培 養(yǎng)，培養(yǎng)基采用CPB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)兩天，培養(yǎng)結(jié)束后在培養(yǎng)物中加入0. 01 %硫柳汞進(jìn)行 殺菌處理，將收獲的培養(yǎng)物離心，離心收獲的菌體和上清液2~8°C保存待下一步純化。
[0026] A.百日咳黏附素的分離純化：將菌體采用60°C熱釋放，超濾濃縮后，上樣于Capto adhere層析柱，以醋酸緩沖液為流動(dòng)相，收集含百日咳黏附素的洗脫組份，再上樣于Capto SP層析柱，以醋酸緩沖液為流動(dòng)相，以氯化鈉梯度洗脫，收集洗脫峰，即為分離純化的百日 咳黏附素；
[0027] B.百日咳毒素和絲狀血凝素的純化：將上清液超濾濃縮后上樣于CaptoSP層析 柱，流動(dòng)相采用含尿素的磷酸鹽緩沖液，以氯化鈉梯度洗脫，分別收集含百日咳毒素和絲 狀血凝素的洗脫組份，將含百日咳毒素的洗脫組份上樣于CaptoMMC層析柱，緩沖液采用 Tris-HCl緩沖液，以氯化鈉梯度洗脫，收集百日咳毒素洗脫峰；將含絲狀血凝素的洗脫峰 上樣于羥基磷灰石層析柱純化，收集洗脫峰；
[0028] C.制備無(wú)細(xì)胞百日咳原液：將百日咳毒素采用戊二醛、絲狀血凝素和百日咳黏附 素采用甲醛進(jìn)行脫毒，除菌過(guò)濾后即為無(wú)細(xì)胞百日咳原液；
[0029] S2.合并及稀釋?zhuān)簩偃湛榷舅?、絲狀血凝素、百日咳黏附素、白喉類(lèi)毒素原液、破 傷風(fēng)類(lèi)毒素原液加入用氯化鈉稀釋的氫氧化鋁佐劑內(nèi)，調(diào)PH至5. 8~7. 2,即為無(wú)細(xì)胞百白 破疫苗半成品。
[0030] 進(jìn)一步地，B組分由以下步驟制備而成：
[0031] SI.制備各單價(jià)疫苗原液
[0032] SlL A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液：開(kāi)啟A群腦膜炎球菌工作種子批菌種，接種至 流腦半綜合培養(yǎng)基，溫度35~37°C，培養(yǎng)16~24小時(shí)，然后經(jīng)過(guò)三代擴(kuò)增培養(yǎng)，制備生產(chǎn) 用種子，將其接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度35~37°C，培養(yǎng)時(shí)間6~12小時(shí)后加入甲醛殺菌； 將已殺菌的培養(yǎng)液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度I. 〇g/L，充分 攪拌后靜置