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一種分離純化的無細(xì)胞百白破-b型流感嗜血桿菌-A群C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗及其制備方法_4

文檔序號(hào):8371064閱讀:來源:國知局
[0090] 按多糖:蛋白=1:0. 8~1.2 (w/w)的比例計(jì)算破傷風(fēng)類毒素用量,加入多糖衍 生物溶液中,按多糖:碳二亞胺=I: l〇(w/w)的比例加入碳二亞胺,維持反應(yīng)溫度5±3°C、 pH5. 7±0. 2,反應(yīng)60分鐘,然后調(diào)節(jié)pH至6. 9±0. 1終止反應(yīng),經(jīng)澄清過濾后,用0. 15mol/ L氯化鈉溶液為超濾液,用超濾膜包超濾去除碳二亞胺,然后將多糖蛋白結(jié)合物溶液用 S印harose 4FF凝膠層析柱純化,以0· 15mol/L NaCl溶液為流動(dòng)相,監(jiān)測(cè)0D280nm的吸收 值,收集VO附近的洗脫峰,合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結(jié)合物,經(jīng)除菌過濾 后,即為b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液。
[0091] 2.疫苗配制:將A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液按照I: I: I (w/w)合并混勻,加入乳糖,用注射用水稀釋,即 為AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品。
[0092] S4.制備凍干制劑:將A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原 液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液按照I: I: I (w/w)合并混勻,加入乳糖,用注射用水稀 釋,即為AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品;
[0093] S5.分裝和包裝
[0094] 將上述制備的吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗半成品分裝于西林瓶或者預(yù)灌裝注射 器中,每瓶0. 5ml,AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品按照0. 5ml/瓶分裝 于西林瓶中進(jìn)行真空冷凍干燥后再獨(dú)立包裝。
[0095] 實(shí)施例6 :成品檢定
[0096] 1鑒別試驗(yàn)
[0097] 采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)PT、FHA、PRN抗原,應(yīng)含有相應(yīng)抗原(《中國藥典》2010版三 部"吸附百白破聯(lián)合疫苗"中附錄IXS)。采用絮狀試驗(yàn)(《中國藥典》2010版三部"吸附百 白破聯(lián)合疫苗"中附錄XIDS),本品應(yīng)與白喉抗毒素、破傷風(fēng)抗毒素出現(xiàn)絮狀反應(yīng)。采用免 疫雙擴(kuò)散法(《中國藥典》2010年版三部附錄VDI C),本品應(yīng)與A群腦膜炎球菌免疫血清、C 群腦膜炎球菌免疫血清、b型流感嗜血桿菌免疫血清及破傷風(fēng)類毒素免疫血清形成明顯沉 淀線。
[0098] 2物理檢查
[0099] 2. 1外觀:凍干制劑應(yīng)為白色疏松體,按標(biāo)示量加入吸附無細(xì)胞百白破后應(yīng)迅速 復(fù)溶為白色混懸液,無搖不散的凝塊或異物。
[0100] 2. 2裝量:依法檢查(《中國藥典》2010版三部,附錄IA),應(yīng)不低于標(biāo)示量。
[0101] 3化學(xué)檢查
[0102] 3. IpH 值:應(yīng)為 5. 8 ~7. 2
[0103] 3. 2氯化鈉含量:應(yīng)為L 5~9. 5g/L(《中國藥典》2010版三部,附錄VII G)。
[0104] 3. 3氫氧化鋁含量:應(yīng)為1.0~1.5mg/ml(《中國藥典》2010版三部,附錄VII F)。
[0105] 3. 4游離甲醛含量:應(yīng)不高于0.2g/L(《中國藥典》2010版三部,附錄VI F)
[0106] 3.5戊二醛含量:應(yīng)小于(λ 01g/L(《中國藥典》2010版三部,附錄VI D)。
[0107] 3. 6水分:應(yīng)不高于3.0% (《中國藥典》2010版三部,附錄VII D)。
[0108] 3. 7多糖含量
[0109] 按標(biāo)示量用純化水復(fù)溶后,取IOml超濾去乳糖后,用容量瓶定容至10ml。
[0110] 取處理后的溶液,以D核糖為對(duì)照,按核糖含量計(jì)算供試品中Hib多糖含量,每1 次人用劑量應(yīng)為10~15 μ g(《中國藥典》2010年版三部附錄VDI J)。
[0111] 取處理后的溶液,測(cè)定其中總磷含量(《中國藥典》2010年版三部附錄W A) JfHib 多糖含量按比例(Hib多糖含量:磷含量為11.40:1)計(jì)算出Hib多糖中磷含量,再將總磷 含量減去Hib多糖中磷含量,得到A群多糖磷含量,按比例(A群多糖含量:磷含量為1000 : 80)計(jì)算出A群多糖含量,每1次人用劑量應(yīng)為10~15 μ g。
[0112] 取處理后的溶液,測(cè)定C群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量(《中國藥典》2010年版三 部附錄VI 0,再根據(jù)比例(C群多糖含量:N-乙酰神經(jīng)氨酸含量為1000 :800)計(jì)算出C群 多糖含量,每1次人用劑量應(yīng)為10~15 μ g
[0113] 3. 8游離多糖含量
[0114] 按標(biāo)示量用純化水復(fù)溶后,采用超濾去除乳糖,再用冷酚法測(cè)定游離多糖,A群和 C群的游離多糖含量放行標(biāo)準(zhǔn)為不高于18%,有效期內(nèi)不高于20%。Hib游離多糖含量應(yīng) 不高于15%,有效期內(nèi)不高于20%。
[0115] 3. 9多糖分子大小測(cè)定
[0116] 用純化水復(fù)溶后,采用瓊脂糖CL-4B凝膠柱(I. 6cmX 100cm)測(cè)定A群、C群多糖 和Hib多糖的分子大小。Kd值小于0. 20的洗脫液多糖回收率放行標(biāo)準(zhǔn)均應(yīng)不低于65%, 有效期內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)均應(yīng)不低于60% (《中國藥典》2010年版三部附錄VDI G)。
[0117] 4.效價(jià)測(cè)定
[0118] 4.1無細(xì)胞百日咳疫苗
[0119] 每1次人用劑量中的免疫效價(jià)應(yīng)不低于4. OIU(按《中國藥典》2010版三部"吸附 百白破聯(lián)合疫苗"中附錄2進(jìn)行。
[0120] 4. 2白喉疫苗
[0121] 每1次人用劑量中白喉類毒素的免疫效價(jià)應(yīng)不低于30IU(《中國藥典》2010版三 部,附錄XI C)
[0122] 4. 3破傷風(fēng)疫苗
[0123] 每1次人用劑量中破傷風(fēng)類毒素的免疫效價(jià)應(yīng)不低于40IU(《中國藥典》2010版 三部,附錄XI B)
[0124] 5.效力試驗(yàn)
[0125] 每批疫苗皮下注射體重12~HgNIH(或BLAB/c)小鼠10只,另取同批小鼠10只 作為對(duì)照,注射滅菌PBS溶液。于第1、14和28天皮下注射三次,每次注射劑量為含7. 5 μ g 多糖(A群、C群、Hib多糖分別為2. 5 μ g)的A群C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌(結(jié) 合)聯(lián)合疫苗,于第35~42天經(jīng)眼眶后靜脈采血,分離血清;以ELISA法測(cè)定抗A群和抗 C群腦膜炎球菌多糖IgG抗體,以滅菌PBS溶液對(duì)照組小鼠血清的A值求出Cutoff值,放行 標(biāo)準(zhǔn)為供試品組應(yīng)有90%以上小鼠的血清抗Hib、抗A群和抗C群腦膜炎球菌多糖IgG抗 體水平高于CuttofT值,有效期內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)不低于80%。A群C群多糖抗體幾何平均滴度(GMT) 為等劑量A群和C群腦膜炎球菌多糖對(duì)照組的8倍以上為合格。
[0126] 6.無菌檢查:依法檢查(《中國藥典》2010版三部,附錄XII A),應(yīng)符合規(guī)定。
[0127] 7.熱原檢查
[0128] 依法檢查(《中國藥典》2010年版三部附錄ΧΠ D),注射劑量按家兔體重每Ikg注 射3. Oyg多糖(分別含A群多糖l.Oyg,含C群多糖LOygjib多糖LOyg)應(yīng)符合規(guī) 定。
[0129] 8特異性毒性檢查
[0130] 8.1無細(xì)胞百日咳疫苗
[0131] 按《中國藥典》2010版三部"吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗"附錄2. 5項(xiàng)進(jìn)行。
[0132] 8. 2白喉、破傷風(fēng)疫苗
[0133] 用體重250~350豚鼠,每批制品不少于4只,每只腹部皮下注射2. 5ml,分兩側(cè)注 射,每側(cè)I. 25ml,觀察30天。注射部位可有浸潤,經(jīng)5~10天變成硬結(jié),可能30天不完全 吸收。在第10、第20、第30天稱體重,到期體重比注射前增加,局部無化膿、無壞死、無破傷 風(fēng)及晚期麻痹癥者為合格。
[0134] 9.毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn):供試品置37°C四周,按《中國藥典》2010版三部"吸附無細(xì)胞百 白破聯(lián)合疫苗"附錄2. 6項(xiàng)進(jìn)行。
[0135] 10.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查:每1次人用劑量應(yīng)不高于500EU(《中國藥典》2010年版三 部附錄XII E)。
[0136] 將實(shí)施例1-4制備的聯(lián)合疫苗采用上述方法進(jìn)行檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示:
[0137] 表1 :實(shí)施例1-4制備的聯(lián)合疫苗的檢測(cè)結(jié)果
[0138]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種聯(lián)合疫苗,其特征在于,它由A組分和B組分組成: 所述A組分為液體制劑,它由以下組分組成: 百日咳毒素:5~40iig;絲狀血凝素:5~40iig;百日咳黏附素:2~IOiig;白喉類毒 素:10~25LF;破傷風(fēng)類毒素:4~IOLF;氫氧化鋁:1. 0~2.Omg/ml;氯化鈉:7. 5~9. 5g/ L; 所述B組分為凍干制劑,它由以下組分組成: A群腦膜炎多糖結(jié)合物:10~30 ii g ;C群腦膜炎多糖結(jié)合物:10~30 ii g ;B型流感嗜 血桿菌多糖結(jié)合物:1〇~30 ii g ;乳糖:5~20mg。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種聯(lián)合疫苗的制備方法,其特征在于,它包括以下步驟:
51. 制備各單價(jià)疫苗原液:包括白喉類毒素原液、破傷風(fēng)類毒素原液、無細(xì)胞百日咳疫 苗原液,所述無細(xì)胞百日咳疫苗原液包括百日咳毒素、絲狀血凝素和百日咳黏附素;
52. 制備液體制劑:將百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳黏附素、白喉類毒素原液、破傷 風(fēng)類毒素原液加入用氯化鈉稀釋的氫氧化鋁佐劑內(nèi),調(diào)pH至5. 8~7. 2,即為無細(xì)胞百白破 疫苗半成品;
53.制備各單價(jià)疫苗原液:包括A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫 苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液;
54. 制備凍干制劑:將A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液、b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液按照1:1:1 (w/V)合并混勻,加入乳糖,用注射用水稀釋,即 為AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品;
55.分裝和包裝 將上述制備的吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗半成品分裝于西林瓶或者預(yù)灌裝注射器中,AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗半成品分裝于西林瓶中進(jìn)行真空冷凍干燥后 再獨(dú)立包裝。
3.如權(quán)利要求2所述的一種聯(lián)合疫苗,其特征在于,A組分由以下步驟制備而成: SI.制備各單價(jià)疫苗原液
511. 白喉類毒素原液:開啟白喉?xiàng)U菌,先在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳1~3代,再轉(zhuǎn)至產(chǎn) 毒培養(yǎng)基制成生產(chǎn)用種子;采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng),培養(yǎng)基采用改良林氏培養(yǎng)基,34~36°C 培養(yǎng)45~52h,培養(yǎng)結(jié)束后加入甲醛殺菌,在培養(yǎng)物中加入硫酸銨沉淀雜蛋白,離心收集上 清;上清液超濾濃縮后再加入硫酸銨鹽析沉淀白喉毒素蛋白,離心收集沉淀,加生理鹽水溶 解,超濾去除毒素中的硫酸銨,加入甲醛,置35~37°C,脫毒30天,除菌過濾即為白喉類毒 素原液;
512. 破傷風(fēng)類毒素原液:開啟破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌,先在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳1~ 3代,再轉(zhuǎn)至產(chǎn)毒培養(yǎng)基制成生產(chǎn)用種子;采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng),培養(yǎng)基采用雙胨培養(yǎng)基, 34~36°C培養(yǎng)62~72小時(shí);培養(yǎng)結(jié)束后加入甲醛殺菌,培養(yǎng)液經(jīng)過濾去除菌體,
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