專(zhuān)利名稱：用于抗瘧疾疫苗的通用t細(xì)胞表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效誘發(fā)針對(duì)瘧疾的保護(hù)性免疫的疫苗，特別是包含在不同遺傳背景的個(gè)體中誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的通用T細(xì)胞表位之疫苗。
背景技術(shù)：
目前全世界感染4至5億人口的由瘧疾引起的公共健康問(wèn)題由于多藥抗藥性寄生物株和殺蟲(chóng)劑抗性蚊子載體的出現(xiàn)而日趨嚴(yán)重。這些發(fā)展導(dǎo)致人們更加努力以提供有效的疫苗，從而防止由于瘧疾，特別是惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)造成的死亡和發(fā)病。惡性瘧原蟲(chóng)是毒性最強(qiáng)的瘧原蟲(chóng)種類(lèi)。
在哺乳動(dòng)物宿主中，瘧疾感染是由瘧疾生物的游動(dòng)子孢子期開(kāi)始的，子孢子通過(guò)已感染蚊子的叮咬被注射到血液循環(huán)中。通過(guò)子孢子表面膜的一個(gè)主要成分環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)與肝細(xì)胞表面上的特異性受體之間的相互作用，子孢子定位于宿主的肝細(xì)胞。在胞內(nèi)復(fù)制并從破裂的肝細(xì)胞中釋放后，寄生物入侵血紅細(xì)胞，開(kāi)始了瘧疾紅細(xì)胞循環(huán)；此感染階段造成臨床疾病，且對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)而言可以致死。
瘧疾疫苗開(kāi)發(fā)主要集中于CS蛋白質(zhì)，其存在于子孢子和寄生物的肝臟期。特異于CS蛋白質(zhì)的重復(fù)區(qū)內(nèi)免疫結(jié)構(gòu)域B細(xì)胞表位(NANP)3肽的單克隆抗體和多克隆抗體可中和嚙齒類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)和人類(lèi)瘧疾種類(lèi)的子孢子的感染性(Nardin等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)15620，1982)。然而，因(NANP)3肽在疫苗中的使用僅導(dǎo)致有限的免疫應(yīng)答，很可能由于低表位密度和/或缺乏合適的T細(xì)胞表位(Herrington等人，自然(Nature)328257，1987)。
本發(fā)明人利用衍生自4名人類(lèi)志愿者的CD4+T細(xì)胞克隆確定了寄生物衍生的T細(xì)胞表位，上述四名志愿者是通過(guò)反復(fù)接觸由惡性瘧原蟲(chóng)瘧疾感染的蚊子誘發(fā)的叮咬處而免疫的。當(dāng)這些志愿者中的三名受到感染性惡性瘧原蟲(chóng)子孢子攻擊時(shí)，如血液期感染的總?cè)狈λ?，他們未受瘧疾感?Herringto等人，Am.J.Trop.Hyg.45535，1991)。
利用衍生自這些子孢子免疫的志愿者的CD4+T細(xì)胞克隆，鑒別了兩種T細(xì)胞表位，一個(gè)位于重復(fù)區(qū)，一個(gè)位于惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)的C-末端。包含于重復(fù)區(qū)N-末端的T細(xì)胞表位稱為T(mén)1，由交替的NVDPNANP重復(fù)組成(Nardin等人，科學(xué)(Science)，2461603，1989)。T1表位與含有(NANP)3B細(xì)胞表位的羰基端重復(fù)區(qū)相鄰，但與之抗原性不同。特異性識(shí)別源自N-末端重復(fù)區(qū)的多種組合的肽且含有NVDPNANP的人類(lèi)CD4+T細(xì)胞克隆不能應(yīng)答(NANP)3重復(fù)肽。T1重復(fù)表位在目前測(cè)序的所有惡性瘧原蟲(chóng)分離株中均保守，因此，期望將其包含于疫苗中以誘導(dǎo)與不同地理區(qū)域中的寄生物反應(yīng)的免疫應(yīng)答。
由子孢子特異的人類(lèi)CD4+T細(xì)胞克隆鑒別的第二種T細(xì)胞表位包含于惡性瘧原蟲(chóng)NF54株CS蛋白質(zhì)的橫跨編號(hào)為326-345的氨基酸殘基的肽(EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)(Moreno等人，國(guó)際免疫(Int.Immunol.)3997，1991；Moreno等人，免疫學(xué)雜志(J.Jmmunol.)151489，1993)。此表位顯示可被細(xì)胞毒性的和非細(xì)胞毒性的II類(lèi)限制性人CD4+T細(xì)胞克隆和I類(lèi)限制性CD8+CTL識(shí)別。
326-345氨基酸序列的獨(dú)特性在于其覆蓋了CS蛋白質(zhì)的多態(tài)區(qū)以及保守區(qū)RII(Dame等人，科學(xué)225593，1984)。保守的RII+含有與肝細(xì)胞受體相互作用以起始瘧疾生活周期的胞內(nèi)期的寄生物配體。肽特異性人CD4+T細(xì)胞識(shí)別326-345肽內(nèi)的一系列表位，所有這些表位覆蓋所有瘧原蟲(chóng)屬(Plasmodium)種類(lèi)的CS蛋白質(zhì)中所發(fā)現(xiàn)的保守性RII。
通過(guò)衍生自經(jīng)多次接觸瘧疾感染的蚊子的叮咬而免疫的人類(lèi)志愿者之CD4+T細(xì)胞定義的T*表位這一事實(shí)，暗示此肽序列在接觸子孢子上天然CS蛋白質(zhì)后經(jīng)過(guò)HLA II類(lèi)分子的高效加工用于提呈。設(shè)想含有此寄生物衍生的T細(xì)胞表位之疫苗可誘發(fā)在天然感染過(guò)的個(gè)體中的記憶應(yīng)答，且能通過(guò)在自然條件下連續(xù)接觸寄生物維持疫苗誘導(dǎo)的免疫。
在誘導(dǎo)針對(duì)瘧疾寄生物前紅細(xì)胞期的細(xì)胞免疫和體液免疫中，II類(lèi)限制性CD4+T細(xì)胞起中心作用(Nardin等人，免疫學(xué)年鑒(Ann.Rev.Immunol.)，11687，1993)。如果合成瘧疾疫苗中含的T細(xì)胞表位僅與有限范圍的II類(lèi)分子結(jié)合，則疫苗可能無(wú)法在不同遺傳背景的個(gè)體中引發(fā)免疫反應(yīng)。早期研究顯示惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)的(NANP)3重復(fù)在居住于瘧疾地方病區(qū)的天然感染個(gè)體中誘導(dǎo)低的或無(wú)法檢測(cè)的T細(xì)胞反應(yīng)(Herrington等人，自然328257，1987；Etlinger等人，免疫學(xué)雜志，140626，1988；Good等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)851199，1988)。
因此，本領(lǐng)域需要包含在致免疫組合物及疫苗中的寄生物衍生的T細(xì)胞表位，其結(jié)合絕大多數(shù)(如果不是全部的話)II類(lèi)分子，從而在不同遺傳背景的個(gè)體中提供針對(duì)瘧疾的保護(hù)性免疫。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A為EBV-B 9008細(xì)胞與生物素化肽溫育獲得的熒光的直方圖。圖1B為EBV-B 9065細(xì)胞與生物素化肽溫育獲得的熒光的直方圖。
圖2A為利用DR4(DRB1*0401)II類(lèi)分子的肽競(jìng)爭(zhēng)ELISA的圖示。測(cè)試了多種濃度的競(jìng)爭(zhēng)物肽326-345、T1或(NANP)3，以考察其抑制生物素化指示物肽GFK(A)7與可溶性DR分子結(jié)合的能力。肽/MHC復(fù)合物被捕獲到抗DR單克隆抗體包被的ELISA板上，經(jīng)過(guò)與HRP-親和素和過(guò)氧化物酶底物溫育顯色。圖2B為利用DR13(DRB1*1301)II類(lèi)分子的肽競(jìng)爭(zhēng)ELISA的圖示，如圖2A所述進(jìn)行。
圖3A是利用可溶性DQ9(DQA1*0201/DQB1*0303)II類(lèi)分子如圖2A所述進(jìn)行的肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的圖示。圖3B是利用可溶性DQ7(DQA1*0501/DQB1*0301)II類(lèi)分子如圖2A所述進(jìn)行的肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的圖示。
圖4A是在用50μg(T1)4MAP腹膜內(nèi)免疫的小鼠中測(cè)得的抗MAPELISA效價(jià)的圖示。圖4B是在用50μg(T*)4MAP腹膜內(nèi)免疫的小鼠中測(cè)得的抗MAP ELISA效價(jià)的圖示。圖4C是在用50μg(T*T1)4MAP腹膜內(nèi)免疫的小鼠中測(cè)得的抗MAP ELISA效價(jià)的圖示。
發(fā)明概述本發(fā)明包含引發(fā)針對(duì)瘧疾的保護(hù)性免疫的致免疫組合物。該組合物包括第一種瘧疾衍生的含有“通用”T細(xì)胞表位的肽，其在不同遺傳背景的哺乳動(dòng)物中引發(fā)抗瘧疾T細(xì)胞反應(yīng)。如此處所用，“不同遺傳背景”的哺乳動(dòng)物無(wú)限制的包括表達(dá)多種MHC II類(lèi)單元型的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通用T細(xì)胞表位包含EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列。優(yōu)選的，本發(fā)明的組合物還包括至少一種第二種瘧疾衍生的含有B細(xì)胞表位的肽，其在哺乳動(dòng)物中刺激抗瘧疾抗體的產(chǎn)生。該組合物還可包括額外的T細(xì)胞表位。該組合物優(yōu)選的配制成疫苗，其中還可包含藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑，以及任選地佐劑。
在另一方面，本發(fā)明提供了在易感哺乳動(dòng)物中用于抑制瘧疾生物繁殖的方法，優(yōu)選地通過(guò)在哺乳動(dòng)物中引發(fā)針對(duì)瘧疾的保護(hù)性免疫。通過(guò)向哺乳動(dòng)物施用致免疫有效量的致免疫組合物和如上述的疫苗實(shí)施這些方法。發(fā)明詳述本說(shuō)明書(shū)中引用的所有專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利及參考文獻(xiàn)均全文引用作為參考。對(duì)于不一致的地方，本發(fā)明的描述包括定義均加以控制。定義1.“致免疫組合物”是在宿主生物中引發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)的組合物。
2.“B細(xì)胞表位”如此處所用，是指在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)特異性抗體(即識(shí)別寄生物及免疫原性分子的抗體)產(chǎn)生的肽或其它免疫原性分子或其片段。
3.“通用”T細(xì)胞表位如此處所用，是指以II類(lèi)或I類(lèi)限制性方式活化T細(xì)胞功能的方式結(jié)合到多種MHC II類(lèi)分子上的肽或其它免疫原性分子或其片段。活化的T細(xì)胞可以是輔助細(xì)胞(CD4+)和/或細(xì)胞毒性細(xì)胞(II類(lèi)限制性CD4+和/或I類(lèi)限制性CD8+)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通用T細(xì)胞表位包括EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通用T細(xì)胞表位基本上由EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列組成。如此處所用，“基本上組成”表位的肽序列包括這樣的肽，其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被刪除或替換，但仍保持結(jié)合多種MHC II類(lèi)分子和/或活化攜帶這種分子的細(xì)胞之T細(xì)胞功能的能力。應(yīng)當(dāng)知曉一個(gè)或多個(gè)氨基酸的刪除或替換可能改變?cè)撾慕Y(jié)合一種或多種MHC II類(lèi)分子的能力，但仍能與多種其它MHC II類(lèi)分子結(jié)合。
瘧疾特異性或寄生物特異性通用T細(xì)胞表位可在一般人群中分別增強(qiáng)或誘發(fā)天然感染的和未感染的個(gè)體中的寄生物特異性T細(xì)胞。
4.“衍生自”特定生物或特定多肽的肽表位包括見(jiàn)于特定多肽內(nèi)的全部或部分氨基酸序列，且由該生物的基因組編碼。應(yīng)當(dāng)知曉，當(dāng)用作致免疫組合物的部分時(shí)，此肽之序列相對(duì)于其所衍生自的多肽可以改變，而不影響此改變了的肽引發(fā)特異于該肽所衍生自的多肽的免疫反應(yīng)。
5.“多抗原肽”(MAP)指從多聚賴氨酸核形成的肽多聚體，且含有分支的用于肽偶聯(lián)的骨架(Tam，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Meth.)19617，1996；Nardin等人，免疫學(xué)進(jìn)展(Adv.Immunol.)60105，1995)。
本發(fā)明提供了用于引發(fā)針對(duì)瘧疾，特別是針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的保護(hù)性免疫的致免疫組合物和方法。該組合物包括一種或多種下列成分(i)至少一種瘧疾衍生的肽，其包含能在不同遺傳背景的被接種人中引發(fā)抗瘧疾T細(xì)胞反應(yīng)的通用T細(xì)胞表位；且(ii)至少一種瘧疾衍生的肽，其包含能刺激針對(duì)瘧疾性生物的子孢子期的抗瘧疾(即中和)抗體產(chǎn)生的B細(xì)胞表位。優(yōu)選的，本發(fā)明的致免疫組合物包括至少一種B細(xì)胞表位和至少一種T細(xì)胞表位，最優(yōu)選的是一種通用T細(xì)胞表位。B細(xì)胞表位優(yōu)選地引發(fā)特異性識(shí)別并結(jié)合瘧疾環(huán)子孢子(CS)蛋白質(zhì)的抗體產(chǎn)生。該組合物還可包含衍生自其它瘧疾成分并與之反應(yīng)的B細(xì)胞表位和/或T細(xì)胞表位，如稱為T(mén)hrombospondin相關(guān)粘附(匿名)蛋白質(zhì)(TRAP)，也稱為子孢子表面蛋白質(zhì)2(SSP2)的惡性瘧原蟲(chóng)子孢子表面蛋白質(zhì)；LSAI；hsp70；SALSA；STARP，Hep17；MSA；RAP-1和RAP-2。
在一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞表位和通用T細(xì)胞表位成分摻入到多抗原肽(MAP)中，形成含有高表位密度的合成大分子多肽。用于MAP合成的方法公開(kāi)于(Tam，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，855409，1988；Tam，酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)1687，1989)。
本發(fā)明包含衍生自瘧原蟲(chóng)屬的種類(lèi)的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，包括但不限于惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)、間日瘧原蟲(chóng)(P.vivax)、三日瘧原蟲(chóng)(P.malariae)、蛋形瘧原蟲(chóng)(P.ovale)、賴氏瘧原蟲(chóng)(P.reichenowi)、諾氏瘧原蟲(chóng)(P.knowlesi)、大皮瘧原蟲(chóng)(P.lynomolgi)、巴西瘧原蟲(chóng)(P.brasilianum)、P.yoelii、柏氏瘧原蟲(chóng)(P.berghei)和查氏瘧原蟲(chóng)(P.chabaudi)。表位一般包含衍生自瘧原蟲(chóng)蛋白質(zhì)的至少5個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選地至少7個(gè)殘基，最優(yōu)選的至少10個(gè)殘基。B細(xì)胞表位可用本領(lǐng)域周知的方法鑒別，如通過(guò)(i)制備其序列衍生自瘧原蟲(chóng)種類(lèi)的CS蛋白質(zhì)的合成肽；和(ii)在一個(gè)模型系統(tǒng)中檢測(cè)合成肽引發(fā)抗瘧疾抗體的能力。瘧疾特異性B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位公開(kāi)于Nardin等人，免疫學(xué)年鑒，11687，1993。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的致免疫組合物包括帶有瘧疾B細(xì)胞表位(NANP)3的一種肽和帶有由惡性瘧原蟲(chóng)NF54株CS蛋白質(zhì)氨基酸殘基編號(hào)326-345的氨基酸EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT表示的通用T細(xì)胞表位，或由其衍生的免疫原性變體。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的致免疫組合物包括(NANP)3、EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT和T1表位。在其它分離株和其它瘧疾種類(lèi)中的相關(guān)序列在327、328、331、335和339位點(diǎn)具有相同的脂肪族殘基和芳香族殘基模式。認(rèn)為這些殘基代表了在II類(lèi)或I類(lèi)分子的肽結(jié)合裂隙中用于肽的結(jié)合的關(guān)鍵錨點(diǎn)。相應(yīng)的，共有這些結(jié)構(gòu)特征和/或有效地結(jié)合不同的II類(lèi)或I類(lèi)分子的涉及EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT的序列可用于本發(fā)明。
其它用于本發(fā)明的通用T細(xì)胞表位可利用下述用于EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT的實(shí)驗(yàn)方法加以鑒別。通用T細(xì)胞瘧疾表位的鑒定在本發(fā)明實(shí)施中，瘧疾特異性通用T細(xì)胞表位利用下述一種或多種方法鑒定(i)實(shí)驗(yàn)性測(cè)量體外不同的瘧疾衍生的肽與分離的II類(lèi)多肽之間的相互作用；和(ii)計(jì)算機(jī)分析不同肽序列以鑒定高親和力II類(lèi)等位基因特異性基序。將體外測(cè)量的相互作用與體內(nèi)致免疫性相關(guān)聯(lián)，如當(dāng)用含有這些T細(xì)胞表位的多抗原肽免疫時(shí)不同遺傳背景的小鼠的免疫反應(yīng)所測(cè)。類(lèi)似地，預(yù)計(jì)含有通用T細(xì)胞表位的衍生自惡性瘧原蟲(chóng)TRAP/SS2的一種肽已被實(shí)驗(yàn)性地顯示在體外結(jié)合多種II類(lèi)分子。這些用于鑒定通用T細(xì)胞受體的方法在下面更詳細(xì)描述。I.體外試驗(yàn)材料與方法肽如早先所述進(jìn)行多抗原肽(MAP)的合成(Tam，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，855409，1988)?；贐oc肽化學(xué)的固相肽合成用于在利用賴氨酸的α和ε氨基構(gòu)建的四叉核上合成T細(xì)胞表位。構(gòu)建了2個(gè)單表位MAP，其中縮寫(xiě)為(T1)4的僅含有T1表位(DPNANPNV)2，縮寫(xiě)為(T*)4的僅含有惡性瘧原蟲(chóng)NF54株的CS蛋白質(zhì)的326-345 T細(xì)胞表位EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT。也構(gòu)建了含有T*和T1表位(T*T1)4的四叉雙表位MAP，以帶賴氨酸核遠(yuǎn)端的T*表位的36mer序列合成。
氨基端生物素化的T1、326-345和(NANP)3肽均購(gòu)自AnaSpect(Anaheim，CA)。用HPLC使肽純度高于90％，且用質(zhì)譜分析證實(shí)肽的生物素化。小鼠四只近交系的6～8周齡小鼠獲自Jackson實(shí)驗(yàn)室，BarHarbor，ME。通過(guò)三次腹膜內(nèi)注射50μg單表位或雙表位的MAP免疫由5～10只A/J(H-2a)、C57B1/10(H-2b)、BALB/c(H-2d)和C3H(H-2k)系小鼠組成的組，其中MAP在弗氏佐劑中乳化。每次免疫接種后14～22天收集血清用于血清學(xué)試驗(yàn)。血清學(xué)試驗(yàn)ELISA用單表位或雙表位MAP作為抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)(Munesingh等人，歐洲免疫學(xué)雜志，123015，1991)。封閉的MAP包被的ELISA孔與PBS/0.05％Tween/2.5％BSA中2倍稀釋的血清一起溫育。清洗后，用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG(γ鏈特異)(Kirkeggard和Perry，Gaithersburg，MD)和ABTS(2，2′-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)/H2O2)作為底物，檢測(cè)結(jié)合的抗體。利用具有高于免疫前血清平均值+3S.D的O.D值之最終血清稀釋度作為終點(diǎn)，測(cè)定每組的幾何平均效價(jià)(GMT)。
IFA利用戊二醛固定的惡性瘧原蟲(chóng)子孢子和FITC標(biāo)記的抗鼠IgG進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)，以檢測(cè)結(jié)合的抗體。從按蚊(Anopheles)的唾液腺中分離子孢子，該蚊通過(guò)用衍生自體外血液期培養(yǎng)物的惡性瘧原蟲(chóng)(NF54株)配子母細(xì)胞飼養(yǎng)而感染。肽結(jié)合試驗(yàn)肽與表達(dá)特定II類(lèi)分子的細(xì)胞的結(jié)合生物素化肽與特定單元型的EBV-B細(xì)胞或用DR分子轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞的結(jié)合用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估(Busch等人，免疫學(xué)方法，1341，1990)。對(duì)提呈肽至T1特異性CD4+T細(xì)胞克隆的EBV-B細(xì)胞系9065和9008測(cè)試其結(jié)合生物素化T1、(NANP)3或326-345肽的能力。
對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)，在每個(gè)U型底96孔板的孔中將EBV-B細(xì)胞或L細(xì)胞(2×105細(xì)胞)與等體積(100μl)生物素化肽(200μg/ml)溫育。在冰上溫和攪拌溫育4小時(shí)后，通過(guò)清洗去除未結(jié)合的肽。為增加熒光信號(hào)的靈敏度，用雙層FITC-親合素標(biāo)記細(xì)胞，方法是先與FITC-親合素D溫育，再與生物素化抗親合素D溫育，并再次與FITC-親合素DCS溫育(Vector，Burlingame，CA)。在FACS分析前加入磺化丙錠(2.8μg/ml)以使活細(xì)胞上的孔開(kāi)放(gating)。
肽結(jié)合ELISA利用肽結(jié)合ELISA測(cè)量與可溶性DR或DQ分子相互作用的肽(Hammer等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1802353，1994)。通過(guò)用1％NP-40和多種蛋白酶抑制劑混合物進(jìn)行裂解和提取，從約109EBV-B細(xì)胞獲得II類(lèi)分子。由在Sepharose-蛋白質(zhì)A-抗II類(lèi)Mab柱上免疫親和純化細(xì)胞提取物中的II類(lèi)分子，其中柱是利用特異于DR(ATCCHB-55)或DQ(ATCC 144或SPV-L2)分子的Mab構(gòu)建的。
純合EBV-B細(xì)胞系用作每個(gè)DR肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的II類(lèi)分子來(lái)源DR1-HOM-2(DRB1*0101)、DR3-WT49(DRB1*0301)、DR4-BSM或PREISS(DRB1*0401)、DR7-EKR(DRB1*0701)、DR8-BM9(DRB1*0801)、DR11-SWEIG(DRB1*1101)和DR13-HHKB(DRB1*1301)。
從L細(xì)胞轉(zhuǎn)染子L416.3分離DR2a(DRB5*0101)分子。用衍生自SWEIG EBV-B細(xì)胞的可溶性DQ7分子(DQA1*0501/DQB1*0301)進(jìn)行DQ肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。在昆蟲(chóng)細(xì)胞中用桿狀病毒表達(dá)體系產(chǎn)生DQ9αβ二聚體(DQA1*0201/DQB1*0303)。
在肽結(jié)合試驗(yàn)中，最佳濃度的純化的DR或DQ分子與生物素化指示物肽(在含有2％正辛基葡糖苷的檸檬酸-磷酸緩沖液)、PMSF、EDTA和蛋白酶抑制劑一起加入到96孔板的各個(gè)孔。pH7的結(jié)合緩沖液用于所有的DQ和DR試驗(yàn)，除了DRB1*0701結(jié)合緩沖液的pH為5。室溫(RT)或37℃溫育過(guò)夜后，將肽/II類(lèi)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到用抗DRMabL234抗體(15μg/ml)或抗DQ MabHB144(3.5μg/ml)包被的孔中。經(jīng)兩小時(shí)溫育后，用PBS+1％Tween清洗各孔，通過(guò)加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素和底物對(duì)硝基磷酸苯酯(Kierkeggard和Perry，Gaithersburg，MD)顯現(xiàn)捕獲得生物素化肽/II類(lèi)分子復(fù)合物。在Titertek MC Multiscan ELISA讀數(shù)儀上(Flow labs)用405nm濾光片測(cè)定光密度。
為增加靈敏度，已知最佳結(jié)合到不同DR等位基因上的生物素化指示物肽用于肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。含有等位基因特異性結(jié)合基序的多聚丙氨酸設(shè)計(jì)物肽用作指示物肽，因?yàn)檫@些肽允許在結(jié)合親和中以100倍增加或降低的競(jìng)爭(zhēng)物檢測(cè)。在DR1、4、7和13試驗(yàn)及在DQ試驗(yàn)中生物素化Gly-Phe-Lys-(Ala)7(稱為GFK(A)7)用作指示物肽。DR3試驗(yàn)使用生物素化IAYD(A)5，DR8試驗(yàn)利用生物素化GYR(A)6L指示物肽。利用生物素化肽UD4即設(shè)計(jì)用于最優(yōu)結(jié)合所有DR4同種異型體的YPKFVKQNTLKAA也進(jìn)行了DR4競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。利用髓鞘堿性蛋白質(zhì)MBP的生物素化肽也測(cè)量了與DR2(DRB5*0101)分子的結(jié)合。
對(duì)于肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，最佳濃度的生物素化指示物肽(0.1μM-5μM)與10倍稀釋的未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性肽T1、氨基酸326-345或(NANP)3(0.01μM-100μM)溫育。在每個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，包括作為陽(yáng)性對(duì)照的一種未標(biāo)記的特定II類(lèi)結(jié)合特異性肽，以測(cè)定相對(duì)親合性。未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)物肽與生物素化指示物肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合II類(lèi)分子的能力通過(guò)測(cè)量光密度(O.D.)顯示。用公式
計(jì)算抑制百分率。測(cè)定了需要抑制生物素化指示物肽結(jié)合之50％的競(jìng)爭(zhēng)物肽的濃度(IC50)，且當(dāng)IC50小于100μM作為肽與II類(lèi)分子結(jié)合的指示。結(jié)果CS T細(xì)胞表位同與細(xì)胞結(jié)合的II類(lèi)分子之結(jié)合人CD4+T細(xì)胞克隆衍生自子孢子免疫的志愿者，其在DR或DQII類(lèi)分子中識(shí)別惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位。特異于惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)的326-345T細(xì)胞表位(T*)的克隆由多種DR等位基因限制，包括DR1、DR4、DR7或DR9。最近明確了位于惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)重復(fù)區(qū)的T1表位的遺傳限制。特異于DQ而非DR分子的單形決定簇的單克隆抗體明顯抑制T1肽特異性T細(xì)胞克隆的增殖反應(yīng)。當(dāng)表達(dá)子孢子免疫的T細(xì)胞供體(DRB1*1502/*1301，DQB1*0602/*0603)的DR/DQ單元型被用作APC時(shí)，僅有表達(dá)DQB1*0603的細(xì)胞可提呈T1肽至T細(xì)胞克隆。
然而，從對(duì)遺傳限制的研究得到的CS肽特異性T細(xì)胞數(shù)目受到子孢子免疫的志愿者數(shù)目少的局限。為了獲得關(guān)于在T1和326-345T細(xì)胞表位的提呈中有潛在功能之II類(lèi)分子的范圍的其它信息，利用確定的單元型或DR轉(zhuǎn)染子進(jìn)行體外結(jié)合試驗(yàn)。a).利用特定II類(lèi)單元型的EBV-B細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)為了測(cè)定已知單元型的EBV-B是否能用于篩選可結(jié)合CS蛋白質(zhì)的分子，檢測(cè)細(xì)胞系與生物素化T1和326-345肽的結(jié)合。已知幾乎不被人T細(xì)胞識(shí)別的生物素化(NANP)3肽也進(jìn)行檢測(cè)。已知一個(gè)表達(dá)DR4(BSM)和一個(gè)表達(dá)DR7(EKR)的這兩個(gè)EBV-B細(xì)胞系均作為APC能行使將326-345肽提呈至DR4和DR7限制性T細(xì)胞克隆的功能。如流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)，結(jié)合到BSM和EKR細(xì)胞系上的生物素化326-345肽分別帶有平均熒光通道值(MFC)251和242。然而，未獲得可檢測(cè)到的與這些細(xì)胞結(jié)合的T1表位或生物素化(NANP)3肽(MFC＜35)。
在反轉(zhuǎn)的試驗(yàn)中，檢測(cè)了已知能作為針對(duì)T1肽特異性T1細(xì)胞克隆的APC行使功能的EBV-B細(xì)胞系其結(jié)合可檢測(cè)水平的生物素化CS肽的能力。未測(cè)得生物素化T1肽與EBV-B細(xì)胞系9008和9065的結(jié)合(圖1A和圖1B)，這些細(xì)胞系表達(dá)DRB1*1501/DQB1*0602/0603和DRB1*1301/DQB1*0603單元型。相反，326-345肽分別以MFC403和758與這兩類(lèi)EBV-B細(xì)胞(9008或9065)結(jié)合。b).結(jié)合DR轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞由于EBV-B細(xì)胞表達(dá)多種II類(lèi)同型體，用326-345肽獲得的陽(yáng)性熒光可反應(yīng)出與DR和/或DQ，或其它HLA分子結(jié)合。通過(guò)測(cè)量生物素化CS肽與DR轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞的相互作用，測(cè)定了肽結(jié)合的II類(lèi)特異性。
在不同轉(zhuǎn)染子表面上的DR之表達(dá)水平與在EBV-B細(xì)胞上觀察到的類(lèi)似，用抗DR(L243)單克隆抗體染色后其MFC范圍從443-964。
表1生物素化瘧疾肽與DR轉(zhuǎn)染的鼠L細(xì)胞的結(jié)合<
>a生物素化CS肽(100μg/ml)與由DRA1*0101和DRB1*0401、*0701或*1501基因轉(zhuǎn)染的鼠L細(xì)胞結(jié)合，用FACS測(cè)量。結(jié)果表示為平均熒光通道值(MFC)。
b在各個(gè)轉(zhuǎn)染子上II類(lèi)表達(dá)的證明，是用特異于人II類(lèi)分子(MabL234)或陰性對(duì)照Mab(3D11)(50μg/ml)的Mab染色。
當(dāng)生物素化T1肽或(NANP)3肽與DR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系溫育時(shí)未觀察到明顯的熒光。生物素化326-345肽結(jié)合用DRB1*0401和*0701轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，MFC分別為217和203，這與特異于326-345肽的DR4及DR7限制性CD4+T細(xì)胞克隆的等位基因特異性一致。此外，326-345肽也顯示與DRB1*1501轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞結(jié)合(MFC167)，這與觀察到的同DR15陽(yáng)性9008EBV-B細(xì)胞系的結(jié)合一致(圖1A)。CS T細(xì)胞表位與可溶性II類(lèi)分子的結(jié)合為了測(cè)量肽結(jié)合親和力，且為了排除與表達(dá)在人和鼠細(xì)胞系上的非MHC細(xì)胞表面分子的非特異性相互作用，利用可溶性II類(lèi)分子進(jìn)行肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。
1.DR分子為了增加肽結(jié)合試驗(yàn)的靈敏度和特異性，利用生物素化指示物肽GFK(A)7進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，該肽是一種與DR分子有高親和力的多聚丙氨酸肽，其親和力可經(jīng)受具100倍親和力的肽競(jìng)爭(zhēng)。如多種濃度的冷競(jìng)爭(zhēng)物肽的劑量反應(yīng)曲線所示，326-345肽(不是T1或(NANP)3肽)可有效抑制生物素化GFK(A)7指示物肽與可溶性DR4分子結(jié)合(圖2A)。
在用可溶性DR13分子(圖2B)的肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中檢測(cè)326-345肽時(shí)可獲得類(lèi)似的結(jié)果。抑制50％的生物素化GFK(A)7肽結(jié)合(IC50)所需的326-345肽濃度與DR4(IC500.2μM)和DR13(IC500.33μM)肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中相類(lèi)似。無(wú)論T1肽還是(NANP)3肽在最高測(cè)試濃度均不能檢測(cè)到抑制(IC50＞100μM)。
利用所選的針對(duì)各DR等位基因有最佳結(jié)合的不同生物素化指示物肽，進(jìn)行了一系列肽結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，結(jié)果總結(jié)于表2。
表2利用可溶性DR分子的肽結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)
a結(jié)果以IC50表示，即抑制50％的生物素化指示肽結(jié)合所需的未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)物肽的濃度(μM)。抑制百分率的計(jì)算基于存在不同濃度的競(jìng)爭(zhēng)性肽(100-0.001μM)時(shí)獲得的O.D。IC50＜100μM表示陽(yáng)性肽結(jié)合。
衍生于流感血凝素的已知為陽(yáng)性競(jìng)爭(zhēng)物肽的HA307-319也包括于每次試驗(yàn)中，目的是為了確定CS肽與每個(gè)DR等位基因結(jié)合的相對(duì)親和力。
基于這些試驗(yàn)，326-345肽可顯示與編碼DR1、DR4、DR7、DR8、DR11和DR13 II類(lèi)分子的DRB1*基因產(chǎn)物結(jié)合(圖2，表2)。對(duì)于由DRB5*0101(IC5080μM)編碼的DR3分子(IC5070μM)和DR2a分子的結(jié)合，326-345肽是弱競(jìng)爭(zhēng)物。對(duì)于在肽結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)試的任何一種可溶性DR分子均未能檢測(cè)到與T1肽或(NANP)3肽的明顯結(jié)合。
如IC50以及與HA307-319肽相比的相對(duì)親和力的測(cè)定，326-345肽與各個(gè)DR基因結(jié)合的親和力均不同。在DR4、7、8等位基因中，326-345CS肽的結(jié)合與通用HA肽類(lèi)似，其IC50的HA307-319/CS326-345比例分別為1.4、0.25和0.5。然而，326-345肽與DR1和DR11結(jié)合的相對(duì)親和力較低，IC50比例分別為0.005和0.025。
2. DQ分子DR結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果表明326-345肽可結(jié)合多種DR分子，而T1肽和(NANP)3肽不能與測(cè)試的任何DR分子有高親和力的結(jié)合。為測(cè)定是否DQ-6限制性T1表位可結(jié)合到其它DQ等位基因，利用可溶性DQ分子進(jìn)行肽競(jìng)爭(zhēng)。
構(gòu)建了用于肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的可溶性DQ7(DQA1*0501/B1*0301)和DQ9(DQA1*0201/B1*0303)分子。在每個(gè)試驗(yàn)中包含一種衍生自不變鏈的氨基酸83-101的已知DQ結(jié)合肽CLIP83-101，以測(cè)定CS與可溶性DQ分子的結(jié)合的相對(duì)親和力。
已知與DQ6分子結(jié)合的T1肽不能與DQ7或DQ9分子結(jié)合(圖3)。類(lèi)似地，(NANP)3肽不能與CLIP83-101肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其它DQ等位基因。
相反，326-345肽可與CLIP肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DQ分子。利用可溶性DQ9分子的競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，326-345肽的IC50為2μM，結(jié)合親和力在用CLIP83-101肽獲得的范圍中(IC50，0.5μM)(圖3A)。用DQ7分子也能檢測(cè)到326-345肽的結(jié)合(IC5020μM)，雖然與CLIP肽相比其肽/DQ分子相互作用的親和力較弱(IC500.5μM)。含有T*T1表位的合成肽疫苗的免疫原性a.用含CS T細(xì)胞表位的單表位MAP免疫接種肽結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果表明326-345肽能與寬范圍的II類(lèi)分子結(jié)合，而T1肽在T細(xì)胞試驗(yàn)中顯示僅與DQ6分子可檢測(cè)的結(jié)合。為了測(cè)定326-345肽與T1肽的寬及窄的遺傳限制性是否與體內(nèi)的致免疫性相關(guān)，在不同系的小鼠中測(cè)定針對(duì)含有326-345表位或含有T1表位的多抗原肽(MAP)的免疫反應(yīng)。初步研究測(cè)得326-345表位含有B細(xì)胞表位及T細(xì)胞表位，因此用抗MAP抗體反應(yīng)作為在MAP免疫的小鼠中的功能性II類(lèi)限制性T輔助細(xì)胞指示物。
與體內(nèi)326-345肽對(duì)多種II類(lèi)分子的結(jié)合相符，僅含326-345序列的單表位MAP(縮寫(xiě)為T(mén)*)在所有測(cè)試的4個(gè)種系小鼠中引發(fā)抗肽反應(yīng)(圖4B)。反應(yīng)的大小為遺傳限制性的，在BALB/c(H-2d)和C57B1(H-2b)中獲得高水平抗肽抗體，在A/J(H-2a)小鼠中為中等水平。所有高度和中度反應(yīng)種系的小鼠在用326-345MAP免疫后均產(chǎn)生相似水平的抗肽抗體(SEM＜10％)。然而，在C3H(H-2k)中獲得的抗體反應(yīng)較低且多變，僅有2/5的MAP免疫的小鼠以可檢測(cè)到的抗體水平應(yīng)答。
相反，應(yīng)答含有326-345表位的(T*)4MAP時(shí)，含有T1表位的單表位MAP僅在一只H-2b小鼠中引發(fā)抗肽抗體反應(yīng)(圖4A)，這與先前公開(kāi)的結(jié)果相符(36)。應(yīng)答T1表位NH2-末端重復(fù)的小鼠的遺傳限制因此與觀察到的(NANP)3序列的羧基端重復(fù)相同，其帶有僅由C57B1(H-2b)小鼠識(shí)別的T輔助細(xì)胞。
為了測(cè)定由含重復(fù)T1或326-345序列羧基端的MAP引發(fā)的抗肽抗體能否識(shí)別惡性瘧原蟲(chóng)子孢子上的CS蛋白質(zhì)，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。已發(fā)現(xiàn)，用含有惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)的羧基端序列的MAP構(gòu)建體免疫接種，經(jīng)常會(huì)引發(fā)不能與子孢子反應(yīng)的高水平的抗肽抗體。與這些早期發(fā)現(xiàn)相符，僅那些識(shí)別CS蛋白質(zhì)重復(fù)區(qū)的抗MAP抗體與子孢子反應(yīng)。因此，雖然用(T*)4免疫接種的BALB/c小鼠產(chǎn)生最高的抗326-345抗體效價(jià)(ELISA GMT 163,840)，但未檢測(cè)到與惡性瘧原蟲(chóng)子孢子的反應(yīng)性(IFA＜80)。相反，應(yīng)答用單表位(T1)4MAP免疫的單一鼠種系C57B1可產(chǎn)生與惡性瘧原蟲(chóng)子孢子相類(lèi)似的抗T1肽ELISA效價(jià)(GMT 327,680)和IFA效價(jià)(163,840)，其中單表位(T1)4MAP含有NH2-末端重復(fù)T細(xì)胞表位(圖3A)。
b.用雙表位MAP免疫接種肽結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果以及在不同小鼠種系中的免疫原性研究表明326-345肽可為多種人和鼠II類(lèi)分子識(shí)別。為了測(cè)定在合成疫苗中包括326-345T細(xì)胞表位是否能克服應(yīng)答惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)重復(fù)區(qū)的免疫遺傳限制性，合成了一個(gè)含有與T1表位串聯(lián)的326-345表位的雙表位(T*T1)4MAP。
在用(T*T1)4MAP免疫的小鼠中抗MAP抗體的反應(yīng)表明(如用單表位(T*)4MAP所發(fā)現(xiàn)的)所有4個(gè)種系的小鼠應(yīng)答免疫接種且產(chǎn)生高水平的抗肽抗體(圖4C)。在不同種系中抗(T*T1)4MAP抗體反應(yīng)的數(shù)量級(jí)顯示如用單表位(T*)4MAP免疫的小鼠中獲得的相同序位，即BALB/c，C57B1＞A/J＞C3H。
在雙表位免疫的小鼠中抗MAP抗體反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)十分迅速(圖4C)。在C57B1小鼠中單劑量的(T*T1)4MAP后可檢測(cè)到高于105的抗MAP效價(jià)。在C3H小鼠中觀察到最低的抗體效價(jià)；然而，與用單表位MAP免疫的小鼠相反，所有用雙表位(T*T1)4MAP免疫的小鼠中產(chǎn)生抗MAP抗體。
更重要地，抗體反應(yīng)的精確特異性的分析表明用(T*T1)4MAP免疫的所有種系的小鼠均產(chǎn)生與惡性瘧原蟲(chóng)子孢子反應(yīng)的抗體(表3)。如用先前含有惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)重復(fù)的MAP構(gòu)建體所示，如(T1)4MAP ELISA所測(cè)，抗重復(fù)抗體水平與用雙表位MAP免疫的小鼠血清對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)子孢子的反應(yīng)性正相關(guān)。
表3.用雙表位(T*T1)4MAP免疫引發(fā)的抗體的精細(xì)特異性
結(jié)果以對(duì)第三次腹膜內(nèi)(i.p.)注射在弗氏佐劑中的(T*T1)4MAP獲得的血清之GMT表示。用雙表位或單表位MAP作為抗原進(jìn)行ELISA。IFA基于戊二醛固定的惡性瘧原蟲(chóng)(NF54)子孢子。
在不同小鼠種系中引發(fā)的抗重復(fù)和抗子孢子抗體的數(shù)量級(jí)反應(yīng)了326-345表位的遺傳限制性模式。對(duì)單表位(T*)4MAP的高反應(yīng)物(C57B1、BALB/c、A/J)和低反應(yīng)物(C3H)在用雙表位MAP免疫后的抗子孢子抗體產(chǎn)生中也是高反應(yīng)物和低反應(yīng)物。疫苗本發(fā)明的組合物也可在敏感宿主中用作引發(fā)免疫的免疫原，包括保護(hù)性免疫。免疫可包括在宿主(或在另一宿主或體外，作為被動(dòng)免疫)中引發(fā)抗體的產(chǎn)生，其將識(shí)別且結(jié)合到瘧原蟲(chóng)細(xì)胞。免疫也可包括瘧疾特異性T細(xì)胞的活化。因此，包括通用T細(xì)胞表位的致免疫組合物可用于疫苗制劑，以通過(guò)防止(總體上或部分上)在宿主中的疾病傳播賦予預(yù)防或治療性免疫，如通過(guò)抑制生物的前血紅細(xì)胞期的發(fā)育。
應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)這些有用的材料，不必由致免疫組合物(或由含有它的疫苗，或由一種抗體)在瘧疾感染或增殖的任何階段達(dá)到100％抑制。在感染的程度(如通過(guò)寄生物血癥的程度測(cè)得)中任何實(shí)質(zhì)性下降均能實(shí)際上減弱臨床癥狀和實(shí)際上增加宿主存活和恢復(fù)的可能性。
本領(lǐng)域已知多種用于疫苗制劑的多種方法。一般，疫苗制成可注射的液體溶液或懸浮液。也可制成適于注射前溶解或者懸浮的固體形式。也可為乳化制劑，或是包被于脂質(zhì)體中的蛋白質(zhì)形式?；钚悦庖咴猿煞挚膳c賦形劑混合，如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如需要，疫苗可以含有小量輔助物，如保溫或乳化劑、pH緩沖劑和/或增強(qiáng)疫苗效力的佐劑。致免疫組合物也可在摻入脂質(zhì)體或其它微載體中后施用。
也可需要重復(fù)免疫以使宿主累積產(chǎn)生免疫反應(yīng)。免疫原的量和免疫接種方案均可由實(shí)驗(yàn)決定，如本領(lǐng)域周知，利用動(dòng)物(如靈長(zhǎng)類(lèi))模型，隨后在人中臨床測(cè)試。關(guān)于疫苗組合物和免疫接種的信息描述于如美國(guó)專(zhuān)利No.4,767,622(Ristic，1988年8月30日)；美國(guó)專(zhuān)利No.4,735,799(Patarroyo，1988年4月5日)和Pataroyo，M.E.等人，自然，332158，1988；以及Wellcome基金會(huì)公開(kāi)的歐洲申請(qǐng)A.250,261(1987年12月23日公開(kāi))。
疫苗可通過(guò)皮下、肌肉內(nèi)、口腔內(nèi)、皮內(nèi)或鼻內(nèi)路徑施用。劑量范圍可從約5μg至約5mg每劑，可應(yīng)用單次或多次劑量方案。施用的量、次數(shù)和施用方案可由經(jīng)驗(yàn)決定，如通過(guò)建立劑量和頻率矩陣，并將一組實(shí)驗(yàn)單元或主體與矩陣中的各點(diǎn)相比較。
本發(fā)明也提供在敏感哺乳動(dòng)物中抑制瘧疾生物增殖的方法，其包括向哺乳動(dòng)物施用含有一種或多種下列成分的致免疫有效量的致免疫組合物(i)至少一種瘧疾衍生的含有B細(xì)胞表位的肽，其中的B細(xì)胞表位能刺激針對(duì)生物子孢子期的抗瘧疾抗體(如中和)的產(chǎn)生；和(ii)至少一種瘧疾衍生的肽，其包含能在不同遺傳背景的接種者中引發(fā)抗瘧疾T細(xì)胞反應(yīng)的通用T細(xì)胞表位。致免疫有效量是如上述測(cè)得的能有效引發(fā)針對(duì)瘧疾生物的保護(hù)性免疫的量。在另一方面，該組合物可施用于已接觸過(guò)瘧疾生物的哺乳動(dòng)物。在另一方面，多肽可在該哺乳動(dòng)物接觸瘧疾生物之前施用于哺乳動(dòng)物。
下列實(shí)施例意在用作本發(fā)明的非限定性闡述。實(shí)施例1含有MAP的抗瘧疾疫苗在不同遺傳背景的小鼠中的研究顯示含有T*表位(見(jiàn)上)的肽基疫苗在無(wú)佐劑時(shí)(即當(dāng)在磷酸鹽緩沖液中單獨(dú)施用)為免疫原性的。
通過(guò)添加佐劑(如明礬(Rehydragel，ReheisNJ)或QS21(CambridgeBiotech，Cambridge MA))獲得增強(qiáng)的抗體反應(yīng)。
典型的包含MAP的抗瘧疾疫苗帶有1mg與100μgQS21混合的(T*T1B)4MAP。此疫苗由皮下注射施用。實(shí)施例2在人中引發(fā)CS特異性抗體進(jìn)行下列研究以檢查對(duì)多種不同遺傳背景的人用含通用T細(xì)胞表位的疫苗的免疫效果。
方法合成了一種稱為(T1BT*)4-P3C的多肟(polyoxime)合成瘧疾疫苗。疫苗含有如上述的通用T細(xì)胞表位(T*)且與衍生自惡性瘧原蟲(chóng)CS重復(fù)的28個(gè)殘基重復(fù)序列(DPNANPNV)3(NANP)3(稱為T(mén)1B)相結(jié)合。疫苗也含有一種連接到賴氨酸核的共價(jià)連接的合成佐劑三棕櫚酰半胱氨酸(Pam 3CyS)。用于致免疫多肟組合物合成的方法公開(kāi)于國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/25071。用于含T*多肟合成的方法公開(kāi)于共同未決申請(qǐng)?zhí)枺撸撸撸?，其?996年12月24日提交，基于臨時(shí)申請(qǐng)No.60/034,506。
向表達(dá)寬范圍II類(lèi)單元型的10個(gè)人類(lèi)志愿者皮下施用疫苗(無(wú)額外的佐劑或乳化劑)。在第0天和第28天接種。在免疫接種前于第14天和第42天獲得血清。
用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定抗體效價(jià)，采用的板由三表位多肟免疫原(T1BT*)4或僅含有CS重復(fù)(T1B)4的雙表位MAP包被。將板與2倍系列稀釋的血清(自180稀釋度開(kāi)始)溫育，然后洗板，且與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG反應(yīng)。由加入過(guò)氧化物酶底物(ABTS)且測(cè)量410nm處光密度(OD)顯示結(jié)合的抗體存在。終點(diǎn)效價(jià)代表免疫血清的最終稀釋度，其中血清的O.D值大于獲自免疫接種前十名志愿者血清的平均O.D值+3標(biāo)準(zhǔn)偏差。
結(jié)果如表4所示，單劑量免疫接種14天后，在50％的接種者中可檢出特異于多肟免疫原的抗體。于第28天施用第二次多肟疫苗，在多數(shù)接種者血清中可檢出增加的抗肽抗體應(yīng)答和陽(yáng)性反應(yīng)。此外，如利用(T1B)4MAP進(jìn)行的ELISA所示，可檢出特異性地與CS重復(fù)反應(yīng)的抗體。惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)的重復(fù)區(qū)是可中和子孢子感染的保護(hù)性抗體的目標(biāo)，方法是通過(guò)在哺乳動(dòng)物宿主中阻斷宿主肝細(xì)胞的入侵且阻止瘧疾生活周期的開(kāi)始。最后，在第二劑疫苗施用后，所有個(gè)體均有陽(yáng)性IgM反應(yīng)。
表4不同HLA單元型志愿者中含有T*惡性瘧原蟲(chóng)通用T細(xì)胞表位的多肟疫苗的免疫原性
a.在皮下注射1mg(T1BT*)4多肟疫苗后+14天收集的血清中測(cè)量初級(jí)IgG抗體反應(yīng)。次級(jí)IgG抗體反應(yīng)則在第28天第二次注射疫苗后的+14天收集的血清中測(cè)量。
這些結(jié)果表明，在所有接種者中，含有通用T細(xì)胞表位的疫苗能引發(fā)特異于惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白質(zhì)的IgG或IgM抗重復(fù)抗體。因此，含有這種通用表位克服了針對(duì)CS重復(fù)的免疫反應(yīng)的遺傳限制性，且提供了一種在不同遺傳背景的個(gè)體中有免疫原性的合成肽疫苗。
權(quán)利要求
1.一種致免疫組合物，其包含第一種含有通用T細(xì)胞表位的瘧疾衍生肽，其中該組合物在不同遺傳背景的哺乳動(dòng)物中引發(fā)抗瘧疾T細(xì)胞反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所定義的致免疫組合物，其還包含第二種含有B細(xì)胞表位的瘧疾衍生肽，其中B細(xì)胞表位在哺乳動(dòng)物中刺激抗瘧疾抗體的產(chǎn)生。
3.如權(quán)利要求1所定義的致免疫組合物，其中所述第一種肽摻入到多抗原肽中。
4.如權(quán)利要求2所定義的致免疫組合物，其中所述第一種和第二種肽摻入到多抗原肽中。
5.如權(quán)利要求1所定義的致免疫組合物，其中所述第一種肽含有EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT的序列。
6.如權(quán)利要求1所定義的致免疫組合物，其中所述第一種肽基本上由EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列組成。
7.一種含有如權(quán)利要求1所定義的致免疫組合物及藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑的疫苗。
8.如權(quán)利要求7的疫苗，其還包含藥學(xué)可接受的佐劑。
9.一種在敏感哺乳動(dòng)物中抑制瘧疾生物增殖的方法，其包括向該哺乳動(dòng)物施用致免疫有效量的如權(quán)利要求7所定義的疫苗。
10.一種在哺乳動(dòng)物中引發(fā)針對(duì)瘧疾的保護(hù)性免疫的方法，其包括向該哺乳動(dòng)物施用致免疫有效量的如權(quán)利要求7所定義的疫苗。
11.一種致免疫組合物，其包含帶有EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列的第一種瘧疾衍生肽，其中所述組合物在不同遺傳背景的哺乳動(dòng)物中引發(fā)一種抗瘧疾T細(xì)胞反應(yīng)。
12.如權(quán)利要求11所定義的致免疫組合物，其還包含帶有B細(xì)胞表位的第二種瘧疾衍生肽，其中B細(xì)胞表位在哺乳動(dòng)物中刺激抗瘧疾抗體的產(chǎn)生。
13.一種包含如權(quán)利要求11所定義的致免疫組合物和藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑的疫苗。
14.如權(quán)利要求13所定義的疫苗，其還包含藥學(xué)可接受的佐劑。
15.一種在敏感哺乳動(dòng)物中抑制瘧疾生物增殖的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用致免疫有效量的如權(quán)利要求13所定義的疫苗。
16.一種在哺乳動(dòng)物中引發(fā)針對(duì)瘧疾的保護(hù)性免疫的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用致免疫有效量的如權(quán)利要求13所定義的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了引發(fā)針對(duì)瘧疾的保護(hù)性免疫的方法和組合物。特別地,本發(fā)明涉及在不同遺傳背景的個(gè)體中引發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的通用T細(xì)胞表位。也公開(kāi)了包含瘧疾特異性通用T細(xì)胞表位的致免疫組合物和疫苗。
文檔編號(hào)C07K7/08GK1244126SQ98801959
公開(kāi)日2000年2月9日 申請(qǐng)日期1998年1月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月21日
發(fā)明者E·納丁, A·莫萊諾 申請(qǐng)人:紐約大學(xué)