一種嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌二聯(lián)口服緩釋微球疫苗及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物疫苗制備技術(shù)，具體涉及一種嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌二聯(lián) 口服緩釋微球疫苗及制備方法。本發(fā)明的疫苗主要適用于魚類。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophil，Ah)和維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii， Αν)可引起魚類、兩棲類和爬行類動物爆發(fā)出血性敗血癥，導(dǎo)致淡水魚皮膚出血（出血性敗 血癥）和大量死亡，給規(guī)模化淡水魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。應(yīng)用抗生素等傳統(tǒng)療法 易誘發(fā)細菌耐藥，藥物殘留及環(huán)境生態(tài)破壞等一系列問題。
[0003] 目前所開發(fā)的嗜水氣單胞菌疫苗（全菌疫苗、基因工程疫苗）均為注射免疫或浸 泡免疫。雖然與注射免疫、浸泡免疫相比，口服免疫效果較差，但魚口服免疫具有使用方便、 安全好、魚群應(yīng)激小、適于規(guī)?；爸貜?fù)免疫等特點，有望成為最有前景的魚類免疫途徑。
[0004] 由于魚類胃酸性環(huán)境及腸內(nèi)消化酶的破壞，傳統(tǒng)疫苗到達腸粘膜之前被大量降 解，即使有少量的抗原到達腸粘膜也無法形成持續(xù)性的免疫刺激，很難誘發(fā)高效的免疫應(yīng) 答，而通過增加免疫劑量或免疫次數(shù)來提高免疫效果又大大提高了免疫成本，免疫效果較 差。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者先后利用各種聚合物微囊傳遞系統(tǒng)開展口服疫苗研宄。
[0005] 2006年A. Ρ. ROdrigueS等人利用植物油乳化法研制嗜水氣單胞菌海藻酸鈉口服 疫苗，但所制備微球的粒徑較大，平均粒徑約為50 μ m，不符合理想微球的粒徑要求（10 μ m 左右），可能會影響抗原提呈細胞對微球的攝取，動物免疫試驗效果未見報道。
[0006] 海藻酸鈉（C6H7O8Na) n是由α - L 一甘露糖醛酸（M單元）與β - D -古羅糖醛 酸（G單元）依靠1，4 一糖昔鍵連接而組成的線性共聚物。海藻酸鈉粉末遇水變濕，可緩慢 的完全水化并溶解。海藻酸鹽可通過其古羅糖酸的鈉離子與二聯(lián)陽離子（Ca 2+)交換而瞬時 凝膠化成球。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種在魚類消化系統(tǒng)中相對穩(wěn)定，粒徑適中，易被巨噬細 胞捕獲，具有緩釋性和抗原保護性，且生物相容性好的微囊抗原傳遞系統(tǒng)。并將該微囊抗原 傳遞系統(tǒng)應(yīng)用于嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌，開發(fā)出嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌二聯(lián) 微囊口服疫苗，以克服滅活疫苗直接口服免疫效果差的缺陷。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：申請人制備了一種嗜水氣和維氏氣單胞菌二聯(lián)口服緩釋微 球疫苗，包括海藻酸鈣控釋微囊以及包封于所述微囊中的滅活嗜水氣和維氏氣單胞菌，該 滅活疫苗含有的嗜水氣和維氏氣單胞菌的保藏號分別為CCTCC Ν0:Μ 2013566和CCTCC Ν0:Μ 2013565;所述抗原已滅活，其保藏地址為中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng) 物保藏中心（CCTCC)，其分類命名分別為"嗜水氣單胞菌XDMG(I)Aeromonas hydrophil XDMG(I) "和"維氏氣單胞菌 XDLG(I)Aeromonas veronii XDLG(I) "。
[0009] 本發(fā)明的進一步改進包括：
[0010] 所述嗜水氣單胞菌的抗原和維氏氣單胞菌的抗原體積含量一致。
[0011] 所述的海藻酸鈣控釋微囊包裹嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的包封率 (96. 31±0. 20)%，載菌量（2. 37±0. 36)X 108cfu/mg。該括號內(nèi)內(nèi)容為本領(lǐng)域技術(shù)人員常 用表示方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以準(zhǔn)確無誤的理解該描述所表達的意思。
[0012] 海藻酸鈣控釋微囊粒徑為10. 35 μ m。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于，提供一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的嗜水氣單胞菌及維 氏氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的菌株，該菌株分別是嗜水氣單胞菌，保藏在中國典型培養(yǎng)物保 藏中心（CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO:M 2013566;和維氏氣單胞菌，保藏在中國典型培養(yǎng) 物保藏中心（CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO:M 2013565。
[0014] 本發(fā)明進一步提供一種嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌二聯(lián)口服緩釋微球疫 苗的制備方法，將嗜水氣單胞菌株及維氏氣單胞菌株復(fù)壯后于28 °C下擴大培養(yǎng)，經(jīng) 0. 2%的福爾馬林滅活后，12000rpm離心，用無菌生理鹽水洗滌細菌，將細菌濃度調(diào)整為 1.0乂101°(^11/ 1^;在均質(zhì)勻漿機的攪動下，將海藻酸鈉和上述滅活菌液以體積比1:1的 比例配成海藻酸鈉一抗原乳濁液，其中海藻酸鈉濃度為2. 0% W/V，攪拌溫度為45°C，菌 膠比為1 :6,攪拌速度為600r/m/min，乳化時間為15min ;該乳池液經(jīng)噴霧干燥機霧化后 直接噴入經(jīng)磁力攪拌機攪動的含有2% CaClJ^ pH = 3的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 中，形成海藻酸鈣微囊，經(jīng)離心，收集海藻酸鈣微囊；再將收集的微囊冷凍干燥后，封蓋包 裝；其中所述的海藻酸鈣控釋微囊包裹滅活嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的包封率為 (96. 31±0· 20) %，載菌量（2. 37±0· 36) X 108cfu/mg。
[0015] 優(yōu)選的，上述的海藻酸鈣控釋微囊粒徑為10. 35 μ m。
[0016] 上述抗原菌株的分離鑒定方法如下所述：
[0017] 嗜水氣單胞菌及維氏氣單胞菌菌株，申請人自新鄉(xiāng)市患細菌性敗血病的病魚體內(nèi) 分離，其中嗜水氣單胞菌32株，維氏氣單胞力20株，冷凍干燥保存。根據(jù)攻毒試驗中，每 組鯽魚的死亡情況，并結(jié)合個菌株毒力因子的特點，篩選出了毒力因子多，毒性強的菌株作 為疫苗制備備用菌株：嗜水氣單胞菌XDMG(l)，其LD 5tl為1.5X105cfu/mL。維氏氣單胞菌 XDLG(I),其LD5tl為4. 5X 10 5cfu/mL。以上菌株均于2013年11月11日保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，其保藏號分別為CCTCC NO:M 2013566和CCTCC NO:M 2013565。取 樣時間為2010年7月，地點：新鄉(xiāng)，衛(wèi)輝東湖，分別取自于麥穗魚和鰱魚的肝部。
[0018] 本發(fā)明選取豫北地區(qū)毒力因子多、免疫源性高、毒性強的嗜水氣單胞菌及維氏氣 單胞菌制成二聯(lián)滅活口服緩釋微球疫苗。采用甲醛滅活制備疫苗，對鯽魚（30~35g)進行 口服免疫，進行血清抗體效價檢測，病理切片分析和攻毒保護試驗。結(jié)果表明，鯽魚在經(jīng) 口服免疫后，第3周即檢測到凝集抗體，于第6周凝集效價達到高峰，而對照組在整個實驗 過程均沒有檢測到抗體；病理切片也表明，該疫苗能夠?qū)a魚靶器官產(chǎn)生很好的保護作用； 攻毒保護試驗中，免疫組的免疫保護率達46. 7%。嗜水氣單胞菌及維氏氣單胞菌滅活疫苗 對鯽魚有顯著的免疫保護效應(yīng)，可作為預(yù)防細菌性敗血癥感染的疫苗。
[0019] 將所制備的嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌二聯(lián)口服緩釋微球疫苗與一定量的經(jīng) 去水浸泡軟化過的商品化魚用飼料粉末混合后，壓制成條，晾干，制成顆粒。
[0020] 免疫途徑：口服免疫。對魚群禁食24h后，將一定量的含有嗜水氣單胞菌和維氏氣 單胞菌二聯(lián)口服緩釋微球疫苗的魚飼料顆粒投入水中，供魚群自由采食。免疫劑量為：每 克體重的魚投放微囊口服疫苗〇.2mg(即：每克體重的魚免疫細菌5. OX IO7Cfu)。首免10 天后，進行二免，用法及劑量同前。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是：
[0022] 1.壁材來源廣泛本研宄所使用的壁材為天然高分子材料，其來源廣泛，價格低廉 且具有免疫增強