嗜水氣單胞菌的lamp檢測(cè)引物組及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)引物組，包括一對(duì)外引物AH-F3和AH-B3、一對(duì)內(nèi)引物AH-FIP和AH-BIP以及一對(duì)環(huán)引物AH-LF和AH-LB，其中AH-F3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，AH-B3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，AH-FIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，AH-BIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，AH-LF的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，AH-LB的核苷酸序列SEQ?ID?NO.6所示。本發(fā)明的試劑盒操作簡(jiǎn)便快速，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；具有特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高，可達(dá)到46fg/mL、準(zhǔn)確率高、可靠等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)引物組及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于嗜水氣單胞菌檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)引物組及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila, AH)廣泛分布于人的食物鏈、水體環(huán)境和泥土中?？梢酝ㄟ^飲水、皮膚創(chuàng)傷等途徑感染動(dòng)物機(jī)體，能感染魚蝦、兩棲類、爬行類、禽類和哺乳類等動(dòng)物，引起出血性敗血癥，造成大量死亡。同時(shí)，該菌還可引起人類食物中毒、腸胃炎、腦膜炎、肺炎及敗血癥，是一種典型的人-畜-魚共患病病原體，給人類健康帶來危害，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中危害最大的病原菌之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，綜合預(yù)防是相對(duì)有效的方法，即盡早發(fā)現(xiàn)疾病并采取諸多措施阻止細(xì)菌傳播。因此，建立靈敏、準(zhǔn)確、快捷、方便的嗜水氣單胞菌檢測(cè)方法是減少嗜水氣單胞菌的發(fā)生和危害的重要途徑。
[0003]目前嗜水氣單胞菌的檢測(cè)方法主要有生化檢驗(yàn)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。生化鑒定方法由于氣單胞菌屬的種類繁多，而且它們的生化性狀極為相似，需要采取一系列生化鑒定反應(yīng)才能夠鑒定到種，這種方法步驟繁瑣耗時(shí)、特異性和靈敏度低，遠(yuǎn)不能滿足日?？焖贆z測(cè)工作的需要。免疫酶聯(lián)檢測(cè)方法(ELISA)可以快速檢測(cè)細(xì)菌，但必需先制備相關(guān)抗體，步驟繁瑣耗時(shí)。PCR技術(shù)具有靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原的檢測(cè)中。但PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境的要求高，儀器設(shè)備貴、操作步驟多。與一般PCR技術(shù)相比，熒光PCR檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)化了操作步驟，而且可消除擴(kuò)增產(chǎn)物引起的交叉污染，減少假陽(yáng)性的發(fā)生。但實(shí)時(shí)熒光PCR儀器設(shè)備昂貴，無法用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。我國(guó)浙江省淡水水產(chǎn)研究所潘曉藝等人發(fā)明的專利“致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法”(ZL201010611571.0)具有較好的特異性和靈敏度。目前檢測(cè)方法正向特異性高、更快速、更靈敏、更方便、費(fèi)用更低廉化的方向發(fā)展，建立檢測(cè)嗜水氣單胞菌快速準(zhǔn)確的LAMP方法，是適應(yīng)口岸快速檢測(cè)和大通關(guān)的時(shí)代要求，對(duì)促進(jìn)中國(guó)水養(yǎng)殖、食品安全及口岸檢疫有重要作用。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是 NOTOMI等建立的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，在60~65°C的恒溫條件下，歷時(shí)幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP反應(yīng)中可形成明顯的白色焦磷酸鎂沉淀，可通過對(duì)濁度的觀察或加入熒光染料，直接通過顏色變化來判定反應(yīng)結(jié)果。該技術(shù)具有高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便、易檢測(cè)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、細(xì)菌、寄生蟲、轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的檢測(cè)，并取得了較理想的效果。適合基層推廣檢測(cè)，符合疾病檢測(cè)的快速、準(zhǔn)確的診斷需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)引物組，該引物組特異性強(qiáng)，靈敏度高。
[0006]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，該試劑盒高效、快速、簡(jiǎn)便，成本低。
[0007]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)引物組，包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物，其中AH-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，AH-B3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，AH-FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，AH-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，AH-LF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，AH-LB的核苷酸序列SEQ ID N0.6所示。
[0008]具體外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物的核苷酸序列如下:
[0009]外引物AH-F3:CAATGGCAGTCTGATCTCC (SEQ ID NO:1);
[0010]外引物AH-B3:TGTCGGCTCATGTCAGTA (SEQ ID N0:2)；
[0011]內(nèi)引物 AH-FIP:CTGACCTGACTGCTTGGCAGCGACGATACCGTAGAGA (SEQ ID NO: 3);
[0012]內(nèi)引物 AH-BIP:CGCTGCAATTGATGGTGAGCAGTTTGATATCCCGCTGC (SEQ ID N0:4)；[0013]環(huán)引物AH-LF:GGAGCCTGAACGTCATGG (SEQ ID NO: 5);
[0014]環(huán)引物AH-LB:GGCACTGACGCTGAATCT (SEQ ID NO:6)。
[0015]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括上述的檢測(cè)引物組。
[0016]在上述嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒中，其中內(nèi)引物、環(huán)引物和外引物的摩爾比優(yōu)選為8:4:1。
[0017]本發(fā)明所述的試劑盒中還包括DNA聚合酶、LAMP反應(yīng)液、封閉液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0018]本發(fā)明所述的DNA聚合酶優(yōu)選為Bst DNA聚合酶。
[0019]本發(fā)明所述的LAMP反應(yīng)液含IOmM dNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液和150mMMgSO4水溶液。
[0020]在上述LAMP反應(yīng)液中，IOmM dNTP、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液和150mMMgS04水溶液三者優(yōu)選按體積比8:5:2組成。
[0021]在上述LAMP反應(yīng)液中，所述的封閉液優(yōu)選為礦物油。
[0022]在上述LAMP反應(yīng)液中，所述的陽(yáng)性對(duì)照優(yōu)選為含有嗜水氣單胞菌(AH)菌毛蛋白基因的重組質(zhì)粒，所述的陰性對(duì)照優(yōu)選為無菌去離子水。
[0023]本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑盒中還可以含有核酸染料SYBR Green I。
[0024]本發(fā)明可以采用上述試劑盒檢測(cè)嗜水氣單胞菌(AH)，具體包括如下步驟:
[0025]I)核酸提取:細(xì)菌樣品按照細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行提??；
[0026]2) LAMP反應(yīng)體系的建立:25 μ L反應(yīng)體系含有:12.5 μ L的LAMP反應(yīng)液，I μ LBstDNA 聚合酶，2 μ L 核酸提取液，AH-FIP1.6 μ Μ, ΑΗ-ΒΙΡ1.6 μ Μ, AH-LF0.8 μ Μ, AH-LB0.8 μ Μ,AH-F30.2 μ Μ, ΑΗ-Β30.2 μ Μ,無菌去離子水，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；加入兩滴封閉液，振蕩離心，濁度儀設(shè)置反應(yīng)溫度為63°C，反應(yīng)時(shí)間65min，反應(yīng)結(jié)束后80°C保持5min ；
[0027]3)結(jié)果判斷可以采用以下三種方法之一:
[0028]方法a:采用實(shí)時(shí)濁度儀(LA-320C)檢測(cè)反應(yīng)管內(nèi)產(chǎn)物的濁度；
[0029]方法b為核酸染料檢測(cè):往LAMP產(chǎn)物中加入I μ L稀釋10倍的SYBR Green I染料，通過肉眼來觀察其顏色，如果顯示核酸染料原來的橙色，則表示沒有擴(kuò)增，如果顏色變綠則表示有擴(kuò)增；[0030]方法c為瓊脂糖電泳檢測(cè):取5 μ L LAMP產(chǎn)物與1 μ L6 X Buffer混合，加至2%的瓊脂凝膠進(jìn)行電泳，凝膠置于EB中染色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，觀察梯形條帶，以判斷是否有擴(kuò)增。
[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0032](1)快速高效:整個(gè)擴(kuò)增只用65min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)IO9~IOltl個(gè)拷貝；
[0033](2)操作簡(jiǎn)便:不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恒溫儀就能反應(yīng)和檢測(cè)；
[0034](3)高特異性:本發(fā)明對(duì)溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、大腸桿菌、遲鈍愛德華氏菌、無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、蠟樣芽胞桿菌、志賀氏菌、肺炎鏈球菌、綠膿桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、摩氏摩根菌的核酸均不發(fā)生擴(kuò)增，僅對(duì)嗜水氣單胞菌擴(kuò)增；
[0035](4)高靈敏度:本發(fā)明的最低檢出限達(dá)46fg/mL，比普通PCR檢測(cè)靈敏10000倍；
[0036](5)鑒定簡(jiǎn)便:本發(fā)明可通過濁度儀、核酸染料、瓊脂糖凝膠電泳判斷是否擴(kuò)增。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1是實(shí)施例3中LAMP檢測(cè)方法對(duì)嗜水氣單胞菌的特異性試驗(yàn)，其中1、9、17:嗜水氣單胞菌，2、10、18陰性對(duì)照，3:溫和氣單胞菌，4:維氏氣單胞菌，5:豚鼠氣單胞菌，6:大腸桿菌，7:遲鈍愛德華氏菌，8:無乳鏈球菌，11:海豚鏈球菌，12:金黃色葡萄球菌，13:霍亂弧菌，14:蠟樣芽胞桿菌，15:志賀氏菌，16:肺炎鏈球菌，19:綠膿桿菌，20:弗氏檸檬酸桿菌，21:摩氏摩根菌；
[0038]圖2實(shí)施例3中LAMP檢測(cè)方法對(duì)嗜水氣單胞菌的靈敏度試驗(yàn)，A和B =LAMP靈敏度濁度儀圖，C = LAMP靈敏度的凝膠電泳圖；D:PCR靈敏度的凝膠電泳圖；其中M = Markerl:陰性對(duì)照，2:10。，3: Κ1，4:1(T2，5:1(T3，6: 1θΛ 7:10-5，8: 1θΛ 9:10-7，10: 1θΛ 11:10-9，12:10-10 ；
[0039]圖3是實(shí)施例3中LAMP檢測(cè)方法對(duì)嗜水氣單胞菌的臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn)，其中A:實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)床樣品；B:核酸染料法檢測(cè)臨床樣品，1:陰性對(duì)照2:嗜水氣單胞菌KQ2010522，3:嗜水氣單胞菌BF20120816，4:嗜水氣單胞菌SK20120912，5:嗜水氣單胞菌DSN20121018，6:嗜水氣單胞菌NH130605，其中圖B中樣品2、3、4、5、6顯色綠色。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0041]實(shí)施例1嗜水氣單胞菌的LAMP引物組及檢測(cè)試劑盒的建立
[0042]嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括LAMP引物組、LAMP反應(yīng)液、封閉液、BstDNA聚合酶、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0043]DLAMP引物設(shè)計(jì):根據(jù)從Genbank上檢索到的嗜水氣單胞菌(AH)菌毛基因序列(Genbank登錄號(hào)為CP000462.1)為靶基因，選取保守序列，利用在線設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer version4 (http: //primerexplorer.1p/e)設(shè)計(jì)用于檢測(cè)嗜水氣單胞菌的特異性引物，其序列見下表1:
[0044]表1引物序列表[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)引物組，其特征是:包括一對(duì)外引物AH-F3和AH-B3、一對(duì)內(nèi)引物AH-FIP和AH-BIP以及一對(duì)環(huán)引物AH-LF和AH-LB，其中AH-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，AH-B3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，AH-FIP的核苷酸序列如SEQID N0.3所示，AH-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，AH-LF的核苷酸序列如SEQ IDN0.5所示，AH-LB的核苷酸序列SEQ ID N0.6所示。
2.一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述試劑盒包括權(quán)利要求1中所述的檢測(cè)引物組、DNA聚合酶、LAMP反應(yīng)液、封閉液礦物油、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述檢測(cè)引物組中內(nèi)引物、環(huán)引物和外引物的摩爾比為8:4:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述的LAMP反應(yīng)液含10mM dNTPUOXThermoPol反應(yīng)緩沖液和150mM MgSOyK溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述IOmMdNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液和150mM MgSO4水溶液三者體積比為8:5:2。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述的陽(yáng)性對(duì)照為含有嗜水氣單胞菌菌毛蛋白基因的重組質(zhì)粒，所述的陰性對(duì)照為無菌去離子水。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述試劑盒還包括顯色劑SYBR Green I。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103911433SQ201410081651
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】柯浩, 李嘉彬, 馬江耀, 馬艷平, 劉振興, 郝樂, 梁志凌 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所