一種鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列、分子探針及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列、分子探針及其應(yīng)用。本發(fā)明鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用于鑒別鐵皮石斛的核苷酸分子探針上游SHF：如SEQIDNO.2所示；下游SHR：如SEQIDNO.3所示。用于鑒別鐵皮石斛的核苷酸分子探針SHF/SHR在鑒別鐵皮石斛上的應(yīng)用。本發(fā)明樣品用量少，僅需少量樣品就可以完成整個(gè)操作；準(zhǔn)確、靈敏度高，SHF/SHR為鐵皮石斛專一性分子探針，若為其他石斛種類，為陰性反應(yīng)；方法簡(jiǎn)單，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，時(shí)間短，半日即可完成。
【專利說明】—種鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列、分子探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法鑒別鐵皮石斛的【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列、分子探針及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale Kimura et Migo)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)的植物，主要分布于我國云南、廣西、浙江、安徽、福建、四川等省區(qū)。鐵皮石斛最早在《本草綱目》中被列為藥用，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，在《道藏》中和天山雪蓮、三兩重人參、花甲之茯從、百二十年首烏、深山靈芝、冬蟲夏草等一起被列為“中華九大仙草”，鐵皮石斛位于“九大仙草”之首，具有滋陰養(yǎng)胃、潤肺止咳、清熱明目的功效，另外，還有增強(qiáng)人體免疫力，消除腫瘤，抑制癌癥等作用。由于鐵皮石斛非常名貴，人為過度采收和生境破壞嚴(yán)重，加上鐵皮石斛生境獨(dú)特，繁殖困難，鐵皮石斛野生資源處于極度瀕危狀態(tài)，被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生珍貴藥材品種。另外，目前市場(chǎng)上商品鐵皮石斛以假亂真現(xiàn)象十分常見，嚴(yán)重影響了商品鐵皮石斛的質(zhì)量。因此，尋找有效的鑒別鐵皮石斛的方法是十分重要的。
[0003]DNA分子標(biāo)記數(shù)量非常多，遍及整個(gè)基因組，多態(tài)性高，遺傳穩(wěn)定，不受環(huán)境及基因表達(dá)與否的限制，能對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、任何組織器官甚至細(xì)胞作檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)(start codon targeted Polymorphism, SCoT)分子標(biāo)記方法,對(duì)鐵皮石斛及其他一些石斛種類的遺傳多樣性進(jìn)行研究，獲得了石斛SCoT指紋圖譜，從中篩選出鐵皮石斛特異性條帶，通過克隆、測(cè)序等，設(shè)計(jì)了特異性探針，應(yīng)用于鐵皮石斛的鑒定，為解決藥材市場(chǎng)上鐵皮石斛藥材混亂和品質(zhì)優(yōu)劣等問題，產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和利用提供有效的分子技術(shù)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列。
[0005]本發(fā)明用于鑒別鐵皮石斛的特征性核苷酸序列來源于SCoT通用引物13擴(kuò)增所得的鐵皮石斛特異性核苷酸序列，具體序列為:
[0006]ACGACATGGCGACCATCGGGGGTCACTCTGGCTACGGTTGGGAAGAAACTTCGACAATGG TCGAGAAGAAACTCCGGTGATAGTCGGGAAGAAAACTCCTGTGACAATCAGGAAGAAACTCTGA CTAAGATTGGGAGAAACTCCGACGGTGGTTAGAAACGGCTAGAACTCTGACGGAGATTGGGAGG AACTCTGACGATGGTCGCCATGTCGTA，如SEQ ID N0.1 所示；
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供基于上述鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列設(shè)計(jì)的用于鑒別鐵皮石斛的核苷酸分子探針(SHF/SHR)，該核酸分子探針序列如下:
[0008]上游引物SHF:5’ -GGGGTCACTCTGGCTACG-3’，如 SEQ ID N0.2 所示；
[0009]下游引物SHR:5’ -TACGACATGGCGACCATC-3’，如 SEQ ID N0.3 所示。[0010]上述核苷酸分子探針(SHF/SHR)，具有極高的專一性，僅與鐵皮石斛發(fā)生反應(yīng)，而不與其他石斛種類反應(yīng)。利用該探針通過常規(guī)PCR擴(kuò)增可以快速的對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行鑒別。[0011 ] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述鑒別鐵皮石斛的分子探針的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明采用上述核酸分子探針(SHF/SHR)作為特異性擴(kuò)增引物，以鐵皮石斛基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，獲得清晰的鐵皮石斛特異性條帶，實(shí)現(xiàn)對(duì)鐵皮石斛的鑒別。
[0013]本發(fā)明具有的有益效果:
[0014]I)樣品用量少，僅需少量樣品就可以完成整個(gè)操作；
[0015]2)準(zhǔn)確、靈敏度高，SHF/SHR為鐵皮石斛專一性分子探針，若為其他石斛種類，為陰性反應(yīng)；
[0016]3)方法簡(jiǎn)單，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，時(shí)間短，半日即可完成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是采用SCoT引物13進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳圖(箭頭所指的條帶是鐵皮石斛特有的條帶，分子量為200bp左右)；
[0018]圖2是采用鐵皮石斛特異性核酸分子探針SHF/SHR對(duì)36種的38份石斛樣品(見表1)進(jìn)行檢測(cè)的PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0019]圖3是采用鐵皮石 斛特異性核酸分子探針SHF/SHR對(duì)15份不同來源的鐵皮石斛(見表2 )進(jìn)行檢測(cè)的PCR擴(kuò)增電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明可以從分子水平上客觀準(zhǔn)確的鑒定鐵皮石斛，具體包括:1.提供用于鐵皮石斛鑒定的DNA片段；2.提供來源于上述DNA片段的石斛專一性核酸分子探針；3.提供上述核酸分子探針的應(yīng)用。
[0021]在采用SCoT分子標(biāo)記研究石斛屬植物遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，SCoT通用引物13擴(kuò)增的帶型中，鐵皮石斛有特異性條帶，能將其與其他石斛種類區(qū)別開。因此，可根據(jù)此特異性條帶合成特異性的核酸分子探針，建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確鑒定鐵皮石斛的分子生物學(xué)方法。
[0022]本發(fā)明提供的用于鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列來源于采用SCoT通用引物13擴(kuò)增得到的鐵皮石斛特異性序列，該序列如SEQ ID N0.1所示。
[0023]本發(fā)明的鐵皮石斛專一性核酸分子探針是以上述鐵皮石斛核苷酸序列為基礎(chǔ)，利用 Primer Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)得到的。分子探針(SHF/SHR)如 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3所示。
[0024]本發(fā)明所提供的鐵皮石斛的鑒定方法，可采用PCR方法:以本發(fā)明的核酸分子探針(SHF和SHR)為PCR引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。具體步驟和過程按常規(guī)PCR方法進(jìn)行，采用該P(yáng)CR方法可快速、準(zhǔn)確地鑒定鐵皮石斛，且樣品用量少。
[0025]通過具體實(shí)施例、附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
[0026]實(shí)施例1:鐵皮石斛特異性核苷酸序列的制備
[0027]1.基因組DNA的提取
[0028]針對(duì)石斛材料多糖等次生產(chǎn)物含量多的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)采取以下方法:[0029](I)取0.3g左右新鮮葉片，用研缽研磨至粉末狀。將粉末迅速轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入Iml抽提緩沖液(200mmol/L Tris-HCl，50ml/L乙二胺四乙酸EDTA，250mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)為2 %的β -巰基乙醇)，混勻后冰上靜止15min，于4°C，8000r/min離心IOmin0去上清，如果上清液比較粘稠，則按上述方法再進(jìn)行離心，直到上清液變清澈，目的是除去多糖等次生代謝物。
[0030](2)在步驟(1)得到的沉淀中加入500μ 165°C預(yù)熱的抽提緩沖液(3 % CTAB,IOOmmoI/L Tris-HCl (PH=8.0),25 mM EDTA ;體積分?jǐn)?shù)為 I % 的 β -巰基乙醇)，混勻后65°C水浴30至40分鐘，得到混合液。
[0031 ] (3 )步驟(2 )混合液冷卻至常溫，加入與步驟(2 )混合液等體積的氯仿/異戊醇溶液(氯仿與異戊醇的體積比為24:1)輕輕顛倒混勻Imin~2min，直到?jīng)]有明顯的分層為止。常溫靜止 5min 后，于 4°C, 10000r/min 離心 lOmin。
[0032](4)取步驟(3)上清至新離心管中，用酚-氯仿-異戊醇溶液(酚、氯仿、異戊醇的體積比=25:24:1)重復(fù)抽提一次。
[0033](5)轉(zhuǎn)移步驟(4)上清至離心管中，加入1/2倍步驟(4)上清體積的5mol/L NaCl,2倍步驟(4)上清體積的無水乙醇，然后輕微上下顛倒幾次，常溫靜止20min至30min。取白色沉淀至新的離心管中進(jìn)行離心(若沉淀物較少的于4°C, 12000r/min離心2min獲得沉淀)。
[0034](6)用體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇洗滌2次，接著去除乙醇后自然風(fēng)干，用500μ1 TE緩沖液溶解，然后加入I μ 110ng/mL核糖核酸酶Rnase，37°C水浴lOmin，降解RNA。
[0035](7)在步驟(6)降解RNA后的溶液中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇溶液(酚、氯仿、異戊醇的體積比=25:24:1)抽提一次，然后方法同步驟(5)得到DNA沉淀，將DNA沉淀用體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇洗滌2次，接著去除乙醇后自然風(fēng)干，用500 μ I TE緩沖液溶解，得到石斛基因組NA溶液。
[0036](8 )用0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)步驟(7 ) DNA溶液中石斛基因組DNA質(zhì)量。
[0037]2.SCoT - PCR 擴(kuò)增
[0038]用SCoT通用引物13進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下表所示:
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列為: ACGACATGGCGACCATCGGGGGTCACTCTGGCTACGGTTGGGAAGAAACTTCGACAATGGTCGAGAAGAAACTCCGGTGATAGTCGGGAAGAAAACTCCTGTGACAATCAGGAAGAAACTCTGACTAAGATTGGGAGAAACTCCGACGGTGGTTAGAAACGGCTAGAACTCTGACGGAGATTGGGAGGAACTCTGACGATGGTCGCCATGTCGTA,如 SEQ IDN0.1所示。
2.利用如權(quán)利要求1所述的一種鑒別鐵皮石斛的核苷酸序列設(shè)計(jì)的用于鑒別鐵皮石斛的核苷酸分子探針SHF/SHR，其特征在于該核酸分子探針序列如下: 上游引物 SHF:5，-GGGGTCACTCTGGCTACG-3’，如 SEQ ID N0.2 所示； 下游引物 SHR:5，-TACGACATGGCGACCATC-3’，如 SEQ ID N0.3 所示。
3.如權(quán)利要求2所述的用于鑒別鐵皮石斛的核苷酸分子探針SHF/SHR在鑒別鐵皮石斛上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103834735SQ201410081496
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】王慧中, 馮尚國, 何仁鋒, 崔藝慶 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)