本發(fā)明屬于畜牧業(yè)動物醫(yī)學技術研究領域,涉及基于TaqMan水解探針熒光RT-PCR檢測豬NLRP12的核苷酸序列和方法,適用于豬組織樣本,包括胃、小腸、大腸等消化道組織以及肝臟、脾臟、淋巴結、肺臟等組織器官中NLRP12的準確檢測,更具體的說是用于豬組織器官中NLRP12mRNA的表達分析、炎癥反應機制研究和腸道屏障功能研究等方面的應用。
背景技術:
NOD-樣受體(NOD-like receptors,NLRs)是先天性免疫中的一大類病原模式識別受體。機體依靠NLRs識別病原感染的信號,啟動免疫應答,發(fā)揮抵抗病原微生物感染的作用。NLRP12是NLRs家族的一個成員,廣泛存在于消化道組織、免疫器官組織以及免疫細胞中,參與病原識別和炎性體組成。炎性體活化后激活胱冬肽酶(caspase-1),調控白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)家族中促炎性細胞因子IL-1b、IL-18和IL-33的生成,參與調節(jié)機體炎癥反應和腸道黏膜屏障功能。
促炎性細胞因子的釋放,能夠促進局部炎性細胞浸潤,減輕或加重組織炎性損傷狀態(tài)。適度炎癥反應有助于消除內外源致病因素,使機體內環(huán)境處于穩(wěn)態(tài);慢性、失調的炎癥反應則持續(xù)地損傷細胞和組織,促使組織器官異常重構,最終導致器官功能衰竭甚至喪失。因此,研究不同病原體引起炎癥的機制,有利于控制炎癥的發(fā)生以及炎癥的進程,使炎癥反應朝向對機體有益的方向發(fā)展,促進機體順利恢復到健康的狀態(tài)和水平。
NLRP12是近兩年來研究較多的一種病原識別受體,主要集中在模型動物小鼠的研究上,在人上的研究也僅有少量報道,但是在豬上的研究還未見報道。很多動物病原體感染豬后,都會引起炎癥反應,但不同的感染類型其引起炎癥反應的機制也各不相同。中國是養(yǎng)豬大國,豬的健康養(yǎng)殖關系和影響著食品安全問題。因此,研究研究豬疫病炎癥反應的發(fā)生機制,控制炎癥反應的進程,使豬只早日恢復健康,就顯得非常重要。一方面,可以減少藥物尤其是抗生素類藥物的使用量,保證豬肉食品的安全,另一方面,還可以降低養(yǎng)殖成本,提高養(yǎng)豬業(yè)的經濟效益。
在本研究中,我們采用TaqMan熒光RT-PCR方法建立了檢測豬NLRP12的檢測技術,對反應的各種條件進行了優(yōu)化,其中包括引物探針的篩選、Mg2+使用濃度的優(yōu)化、引物及探針使用濃度的優(yōu)化。建立了靈敏、特異,能夠用于檢測豬NLRP12 mRNA表達的方法。
技術實現要素:
本發(fā)明的一個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的檢測豬NLRP12的核苷酸序列,包括引物序列和基于MGB修飾的短探針序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供快速、準確、使用方便的基于MGB修飾的檢測豬NLRP12 mRNA表達的方法。
為實現上述目的,本發(fā)明公開了如下的技術方案:
一組檢測豬NLRP12的核苷酸序列,其特征在于,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3所示,其中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2分別為檢測豬NLRP12的正義引物和反義引物,序列SEQ ID NO.3為檢測豬NLRP12的熒光探針。
本發(fā)明所所述探針序列SEQ ID NO.3的5’端標記報告熒光基團FAM,3’端標記淬滅熒光基團MGB。
本發(fā)明進一步公開了采用檢測豬NLRP12的核苷酸序列進行檢測的方法,其特征在于,由以下組分作為檢測NLRP12所用的必備材料:
1)裂解液;
2)RT反應液,包括:5′RT緩沖液、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTPs(each)、200 mM隨機引物、40 U/mL RNase抑制劑、200 U/mL反轉錄酶M-MLV;
3)qPCR反應液,包括:10′PCR緩沖液、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTPs(each)、2.5 U/mL Taq DNA聚合酶、20 mM正義引物、20 mM反義引物、20 mM熒光探針;
4)DEPC水:用自來水三次蒸餾獲取三蒸水,在三蒸水中加入DEPC至終濃度為0.1%,37°C攪拌處理12 h,121°C高壓蒸汽滅菌15 min;
5)豬NLRP12標準品:為體外轉錄的RNA片段,豬NLRP12標準品的序列為序列表SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列;
其中,正義引物為序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,反義引物為序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列,熒光探針為序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列,其中5’端標記報告熒光基團FAM,3’端標記淬滅熒光基團MGB。
所述RT反應液中各成分的使用濃度為1′RT緩沖液、2.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs、20 mM隨機引物、1 U/mL的RNase抑制劑、5 U/mL的反轉錄酶M-MLV;所述qPCR反應液中各成分的使用濃度為1′PCR緩沖液、3.5 mM MgCl2、0.2 mMdNTPs、0.05 U/mLTaq DNA聚合酶、0.2 mM正義引物、0.2 mM反義引物、0.1 mM熒光探針;
本發(fā)明更進一步公開了采用檢測豬NLRP12的核苷酸序列檢測豬NLRP12的方法在豬組織器官中NLRP12 mRNA表達方面的應用。實驗結果顯示:本發(fā)明建立的熒光qPCR檢測方法可以對病毒RNA進行相對定量,根據標準曲線Y=-4.67X+38.51(X代表Ct值,Y代表NLRP12的相對含量),可知Ct值越小,NLRP12的表達量相對越高。發(fā)病豬不同組織中NLRP12的表達均高于正常豬不同組織中NLRP12的表達,并且以發(fā)病豬淋巴結中NLRP12的表達量為最高。
本發(fā)明更加詳細的描述如下:
選擇豬NLRP12基因的特定序列作為靶區(qū)域,在多重序列比對的基礎上,進行引物和探針設計。引物長度為21個堿基左右,引物內無二級結構和重復性,引物間和引物內無互補序列,引物的熔解溫度(Tm值)在60°C左右,引物間的Tm值相差小于2°C。探針的長度為16個堿基。
一組檢測豬NLRP12的核苷酸序列,如下:
1)5?-CACAAGGTGATGCTGGATTGG-3?(SEQ ID NO.1)
2)5?-CCCGGCAGTTGATGTAGAAGAC-3?(SEQ ID NO.2)
3)5?-[FAM]-ACGGGAAGCTCTTCCA-[MGB]-3?(SEQ ID NO.3)
其中序列1)和2)分別為檢測豬NLRP12基因的正義引物和反義引物,序列3)為檢測豬NLRP12基因的MGB修飾的熒光短探針,探針的5?端標記報告熒光基團FAM(6-carboxy-熒光素),3?端標記淬滅基團MGB。
我們采用TaqMan熒光RT-PCR檢測技術建立了檢測豬NLRP12的檢測方法,對反應的各種條件進行了優(yōu)化,其中包括引物探針的篩選、Mg2+使用濃度的優(yōu)化、引物及探針使用濃度的優(yōu)化,得到以下檢測方法。
本發(fā)明提供的一種檢測豬NLRP12的方法,由以下內容組成:
1)RNA提取試劑盒:購自天根生化科技(北京)有限公司。
2)RT反應液,表1為RT反應液配方:
表1 RT反應液配方
反轉錄酶M-MLV(200 U/mL)、5′RT緩沖液、隨機引物(200 mM)、RNase抑制劑(40 U/mL)購自大連寶生物生物工程有限公司;dNTPs(2.5 mM each)、MgCl2(25 mM)購自天根生化科技(北京)有限公司。
3)qPCR反應液,表2為qPCR反應液配方:
表2 qPCR反應液配方
Taq DNA聚合酶(2.5 U/mL)、10′PCR緩沖液、dNTPs(2.5 mM each)、MgCl2(25 mM)自天根生化科技(北京)有限公司,引物和探針均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
4)DEPC水,用自來水三次蒸餾獲取三蒸水,在三蒸水中加入DEPC至終濃度為0.1%,37°C攪拌處理12 h,121°C高壓蒸汽滅菌15 min。
5)豬NLRP12標準品:為體外轉錄的RNA片段。將RT-PCR擴增獲得的NLRP12長度為240 bp編碼序列克隆于pGEM-T載體,轉化TOP10感受態(tài)細胞,用質粒小提試劑盒提取質粒DNA,經PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質粒,命名為pGEM-NLRP12。以純化的質粒為模板,酶切線性化之后,用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7試劑盒進行體外轉錄;將體外轉錄產物用DNase除去其中的DNA模板后經Trizol提取后進行測定,即得到制備豬NLRP12標準品所需的RNA標準品母液。
6)豬NLRP12標準品的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
7)對合成的引物和探針做HPLC分析,如得到單吸收峰圖譜、而且用紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之間,即視為合格引物。
將篩選好的引物濃度從0.1 mM至0.8 mM以0.1 mM為間距遞增,探針濃度從0.025 mM至0.2mM以0.025 mM為間距遞增。對引物和探針不同濃度的配比進行了比較,從多次重復試驗中發(fā)現:采用表2所列引物濃度和探針濃度時熒光增幅相對較高。
7)RT反應條件:30°C 10 min,42°C 1 h,99°C 5 min,16°C 1 min。
8)qPCR反應條件:95°C 4 min;95°C 10 sec,61°C 15 sec,72°C 15 sec,40個循環(huán),每次循環(huán)退火延伸時收集熒光。
研究表明,Mg2+濃度對熒光PCR擴增結果有影響,故應用篩選好的引物探針,將Mg2+的濃度從0.5 mM至5.0 mM以0.5 mM為間距遞增,對不同Mg2+濃度條件下的擴增進行了比較。優(yōu)化后的Mg2+濃度見表1。
本發(fā)明的優(yōu)點是:本發(fā)明選擇豬NLRP12基因保守序列,設計引物和MGB探針,建立并優(yōu)化了檢測組NLRP12的熒光RT-PCR檢測方法,該法特異性好,靈敏度高,能夠快速、準確的檢測豬組織器官樣本中NLRP12,在研究NLRP12炎性體時能夠對NLRP12進行實時監(jiān)測,及時了解和掌握炎癥的發(fā)生過程和發(fā)展進程,以及采用抗炎藥物干預炎癥反應的效果,具有重要的理論意義和實踐意義。
附圖說明
圖1豬不同組織中NLRP12 mRNA相對定量試驗和線性回歸結果;
圖2 NLRP12熒光PCR檢測方法的特異性試驗結果。
具體實施方式
下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明,本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外,實施方案應理解為說明性的,而非限制本發(fā)明的范圍,本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言,在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下,對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所用原料及試劑均有市售。
實施例1 豬不同組織中NLRP12 mRNA相對定量試驗
(1)豬組織樣品處理:用無菌的剪刀和鑷子剪去待檢組織樣品約1.0 g于研缽中充分研磨,再加入5 mL PBS混勻,然后將組織懸液轉入無菌Eppendorf管中,編號備用。
(2)RNA的提?。河肦NA提取試劑盒提取不同組織的RNA,按照試劑盒操作說明書進行,提取的RNA冰上保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)RNA反轉錄為cDNA:從冰箱中取出M-MLV(200 U/mL)、5′RT緩沖液、隨機引物(200 mM)、RNase抑制劑(40 U/mL)、dNTPs(2.5 mM each)、MgCl2(25 mM),在室溫下融化后,2 000 rpm離心10 sec。設所需PCR管數為n(n=樣本數+1管陰性對照),每個測試反應體系需要10 mL RT反應液,其中含有4 mL 5′RT緩沖液,2mLMgCl2(25 mM),2 mL dNTPs(2.5 mM each),1 mL隨機引物(200 mM),0.5mLRNase抑制劑(40 U/mL),0.5mL反轉錄酶M-MLV(200 U/mL)。計算好各試劑的使用量,加入一適當體積試管中,充分混合均勻,向每個PCR管中各分裝10 mL。在各設定的普通PCR管中分別加入制備的RNA溶液各10 mL,蓋緊管蓋,于1000 rpm離心10 sec。將PCR管排好放入普通PCR儀內進行反轉錄。反應參數設置:30°C 10 min,42°C 1 h,99°C 5 min,16°C 1 min。反轉錄結束后,取出cDNA冰上保存?zhèn)溆谩?/p>
(4)qPCR反應:從冰箱中取出Taq DNA聚合酶(2.5 U/mL)、10′PCR緩沖液、正義引物(20 mM)、反義引物(20 mM)、MGB探針(20 mM)、dNTPs(2.5 mM each)、MgCl2(25 mM),在室溫下融化后,2 000 rpm離心10 sec。設所需PCR管數為n(n=樣本數+1管陰性對照+10管陽性標準品),每個測試反應體系需要15mL qPCR反應液,其中含有2 mL 10′PCR緩沖液、2.8mL MgCl2(25 mM),1.6 mL dNTPs(2.5 mM each),0.4 mLTaq DNA聚合酶(2.5 U/mL),0.2 mL正義引物(20 mM),0.2 mL反義引物(20 mM),0.1 mL MGB探針(20 mM),7.7mL DEPC水。計算好各試劑的使用量,加入一適當體積試管中,充分混合均勻,向每個qPCR管中各分裝15mL。在各設定的qPCR管中分別加入制備的cDNA各5mL,蓋緊管蓋,于1000 rpm離心10 sec。將qPCR管排好放入熒光PCR檢測儀內,記錄樣本擺放順序。反應參數設置:95°C 4 min;95°C 10 sec,61°C 15 sec,72°C 15 sec,40個循環(huán),每次循環(huán)退火延伸時收集熒光。
(5)結果的判定:結果分析條件設定,讀取檢測結果。閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點。不同儀器可根據儀器噪音情況進行調整。質控標準,陰性對照無Ct值并且無擴增曲線。陽性對照的Ct值應£35.0,并出現特定的擴增曲線。如陰性對照和陽性對照條件不滿足以上條件,此次實驗視為無效。
(6)豬不同組織中NLRP12 mRNA相對定量統(tǒng)計分析:對3頭健康豬和3頭致病性大腸桿菌感染豬不同的組織臟器qPCR的檢測數據進行統(tǒng)計分析,結果見表3。
表3 NLRP12 qPCR檢測同一頭豬不同組織臟器的結果統(tǒng)計
我們建立的熒光qPCR檢測方法可以對病毒RNA進行相對定量,根據標準曲線Y=-4.67X+38.51(X代表Ct值,Y代表NLRP12的相對含量),可知Ct值越小,NLRP12的表達量相對越高。從表3可以看出,發(fā)病豬不同組織中NLRP12的表達均高于正常豬不同組織中NLRP12的表達,并且以發(fā)病豬淋巴結中NLRP12的表達量為最高。
實施例2
檢測方法的特異性試驗
用實施例1中所述方法對豬腸組織及環(huán)境中常見的幾種病原體(包括大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和豬繁殖與呼吸綜合征病毒)進行檢測,結果表明所建立的方法與病原體均無交叉反應,特異性良好(圖2)。
<110> 天津市畜牧獸醫(yī)研究所
<120> 一種檢測豬NLRP12的核苷酸序列及應用
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<212> DNA
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<400> 1
cacaaggtga tgctggattg g 21
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<213> 人工序列
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cccggcagtt gatgtagaag ac 22
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<211> 18
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<400> 3
acgggaagct cttccagg 18
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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