本發(fā)明涉及一種新的殺蟲(chóng)蛋白及其核苷酸序列。

背景技術(shù)：

蘇云金芽胞桿菌(bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是一種對(duì)害蟲(chóng)毒力強(qiáng)且對(duì)天敵無(wú)毒性的昆蟲(chóng)病原微生物，對(duì)高等動(dòng)物和人無(wú)毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑，對(duì)16個(gè)目3000多種害蟲(chóng)有活性。

現(xiàn)有技術(shù)主要認(rèn)為bt之所以能夠具有殺蟲(chóng)活性，主要是由于其體能能夠產(chǎn)生各種cry蛋白、cyt蛋白和vip蛋白。

然而，鮮有報(bào)道bt還能夠產(chǎn)生不同于以上三種蛋白的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)，特別是對(duì)某些鞘翅目(coleoptera)害蟲(chóng)，例如華北大黑鰓金龜(holotrichiaoblita)具有優(yōu)良活性的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)之一提供了一種殺蟲(chóng)蛋白，其具有如(i)和(ii)中的至少一種的氨基酸序列：

(i)seqidno.2所示的氨基酸序列；

(ii)與如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

通過(guò)(ii)限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時(shí)，可以獲得具有與如seqidno.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。不過(guò)在不影響使用所述殺蟲(chóng)蛋白的情況下，通過(guò)(ii)限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時(shí)，獲得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時(shí)，也在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，優(yōu)選殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列為與如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在98％以上，且與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通過(guò)這種方式限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時(shí)，可以獲得具有與如seqidno.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。不過(guò)在不影響使用所述殺蟲(chóng)蛋白的情況下，通過(guò)(ii)限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時(shí)，獲得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時(shí)，也在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，優(yōu)選殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列為與如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在99％以上，且與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通過(guò)這種方式限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時(shí)，可以獲得具有與如seqidno.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。不過(guò)在不影響使用所述殺蟲(chóng)蛋白的情況下，通過(guò)(ii)限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時(shí)，獲得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時(shí)，也在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，優(yōu)選殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列為與如seqidno.2所示的氨基酸序列的一致性在99.5％以上，且與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通過(guò)這種方式限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時(shí)，可以獲得具有與如seqidno.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。不過(guò)在不影響使用所述殺蟲(chóng)蛋白的情況下，通過(guò)(ii)限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時(shí)，獲得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時(shí)，也在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述殺蟲(chóng)蛋白還可以為如(i)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后，與具有如(i)的氨基酸序列的殺蟲(chóng)蛋白具有相同功能的蛋白。通過(guò)這種方式限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同時(shí)，可以獲得具有與如seqidno.2所示的氨基酸序列相當(dāng)或者更優(yōu)的效果，這將在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。不過(guò)在不影響使用所述殺蟲(chóng)蛋白的情況下，通過(guò)(ii)限定的殺蟲(chóng)蛋白在與如seqidno.2所示的氨基酸序列獲得具有相同功能的同時(shí)，獲得比如seqidno.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是seqidno.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％時(shí)，也在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本申請(qǐng)的殺蟲(chóng)蛋白對(duì)害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性，特別是對(duì)華北大黑鰓金龜?shù)臍⑾x(chóng)活性顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的殺蟲(chóng)蛋白的殺蟲(chóng)活性，其可以彌補(bǔ)例如cry8g蛋白在對(duì)華北大黑鰓金龜(holotrichiaoblita)殺蟲(chóng)活性較弱的不足。因此，其豐富了殺蟲(chóng)蛋白資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來(lái)源，提高bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的抗蟲(chóng)效果，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。

本申請(qǐng)之二提供了一種核苷酸序列，所述核苷酸序列為編碼如本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白中任意一種的核苷酸序列。該核苷酸序列可以以其來(lái)源菌株為模板，或以克隆的全長(zhǎng)dna片段為模板，通過(guò)pcr擴(kuò)增得到；也可以根據(jù)給定的序列人工合成。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，當(dāng)所述殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示時(shí)，編碼所述殺蟲(chóng)蛋白的所述核苷酸序列如seqidno.1所示。

本申請(qǐng)之三提供了一種組合物，其包括如本申請(qǐng)之一所述殺蟲(chóng)蛋白的至少一種。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，當(dāng)所述殺蟲(chóng)蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示時(shí)，編碼所述殺蟲(chóng)蛋白的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本申請(qǐng)之四提供了一種含有本申請(qǐng)之二所述的核苷酸序列，且能產(chǎn)生本申請(qǐng)之一相應(yīng)的所述的殺蟲(chóng)蛋白的轉(zhuǎn)基因微生物。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因微生物包括芽胞桿菌(bacillus)、假單胞菌(pseudomonas)、腸桿菌(escherichia)和酵母(saccharomyces)中的至少一種。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選所述芽胞桿菌包括蘇云金芽胞桿菌(bacillusthuringiensis)、枯草芽胞桿菌(bacillussubtilis)、萎縮芽胞桿菌(bacillusatrophaeus)和蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)中的至少一種；所述假單胞菌包括熒光假單胞桿菌(pseudomonasfluorescens)；所述腸桿菌包括大腸桿菌(escherichiacoli)。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，本申請(qǐng)的轉(zhuǎn)基因微生物的出發(fā)株(即在轉(zhuǎn)入本申請(qǐng)之二所述的核苷酸序列之前的微生物)為野生微生物和/或遺傳工程微生物。

其中，野生微生物是指從自然界中分離出的未經(jīng)過(guò)人工改造的微生物。

遺傳工程微生物是指將野生微生物人工改造的微生物。

本申請(qǐng)的轉(zhuǎn)基因微生物和/或遺傳工程微生物的物種并不因進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因修飾而改變，因此，轉(zhuǎn)基因微生物與發(fā)生轉(zhuǎn)基因之前的微生物(即作為受體微生物)為相同的物種。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，如上的本申請(qǐng)二的所述的核酸序列能夠被連接在表達(dá)載體上。所述表達(dá)載體例如可以是能夠在大腸桿菌和蘇云金芽胞桿菌中穿梭的pstk表達(dá)載體。

本申請(qǐng)之五提供了根據(jù)本申請(qǐng)之二所述的核苷酸序列在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物能夠產(chǎn)生如本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白；所述轉(zhuǎn)基因植物包括十字花科(cruciferae)、茄科(solanaceae)、傘形科(umbelliferae)、葫蘆科(cucurbitaceae)、天南星科(araceae)、禾本科(liliaceae)、豆科(leguminosae)、蝶形花科(papilionaceae)、藜科(chenopodiaceae)菊科(compositae)、和錦葵科(malvaceae)中的至少一種。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因植物包括蕓薹屬(brassica)、蘿卜屬(raphanus)、煙草屬(nicotiana)、蕃茄屬(lycopersicon)、茄屬(solanum)、辣椒屬(capsicum)、胡蘿卜屬(daucus)、芹屬(apium)、歐芹屬(petroselinum)、茴香屬(foeniculum)、南瓜屬(cucurbita)、黃瓜屬(cucumis)、冬瓜屬(benincasa)、絲瓜屬(luffa)、西瓜屬(citrullus)、甜瓜屬(cucumis)、磨芋屬(amorphophallus)蜀黍?qū)?zea)、高梁屬(sorghum)、狗尾巴草屬(setaria)、稻屬(oryza)、甘蔗屬(saccharum)、小麥屬(triticum)、大豆屬(glycine)、苜蓿屬(medicago)、甜菜屬(beta)、萵苣屬(lactuca)、向日葵屬(helianthus)和秋葵屬(abelmoschusesculentus)中的至少一種。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因植物包括油菜(brassicacampestris)、大白菜(brassicarapa)、小白菜(brassicachinensis)、甘藍(lán)(brassicaoleracea)、蘿卜(raphanussativus)、番茄(lycopersiconesculentum)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、茄子(solanummelongena)、旱芹(apiumgraveolens)、歐芹(petroselinumcrispum)、小茴香(foeniculumvulgare)、西葫蘆(cucurbitapepo)、南瓜(cucurbitamoschata)、黃瓜(cucumissativus)、冬瓜(benincasahispida)、絲瓜(luffaacutangula)、西瓜(citrulluslanatus)、甜瓜(cucumismelo)、磨芋(amorphophallusrivieri)、玉米(zeamays)、高粱(sorghumbicolor)、谷子(setariaitalica)、水稻(oryzasativa)、甘蔗(saccharumofficinarum)、小麥(triticumaestivum)、大豆(glycinemax)、苜蓿(medicagosativa)、甜菜(betavulgaris)、萵苣(lactucasativa)、向日葵(helianthusannuus)和秋葵(abelmoschusesculentus)中的至少一種。

轉(zhuǎn)基因植物的物種并不因進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因修飾而改變，因此，轉(zhuǎn)基因植物與發(fā)生轉(zhuǎn)基因之前的植物(即作為受體植物)為相同的物種。

本申請(qǐng)之六提供了一種制備如本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白的方法，其包括利用本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，和/或利用本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物來(lái)生產(chǎn)所述殺蟲(chóng)蛋白。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選還包括在利用所述轉(zhuǎn)基因微生物和/或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)所述殺蟲(chóng)蛋白后，純化所述殺蟲(chóng)蛋白使所述殺蟲(chóng)蛋白的純度達(dá)到80％以上。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，更優(yōu)選在利用所述轉(zhuǎn)基因微生物和/或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)所述殺蟲(chóng)蛋白后，純化所述殺蟲(chóng)蛋白使所述殺蟲(chóng)蛋白的純度達(dá)到90％以上。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，甚至是在利用所述轉(zhuǎn)基因微生物和/或轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)所述殺蟲(chóng)蛋白后，純化所述殺蟲(chóng)蛋白使所述殺蟲(chóng)蛋白的純度達(dá)到99％以上。

因此，本申請(qǐng)之七提供了根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白，本申請(qǐng)之三所述的組合物，本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治鞘翅目(coleoptera)中的至少一種害蟲(chóng)中的應(yīng)用。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，優(yōu)選根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白，本申請(qǐng)之三所述的組合物，本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治鰓金龜科(melolonthidae)中的至少一種害蟲(chóng)中的應(yīng)用。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，特別優(yōu)選根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白，本申請(qǐng)之三所述的組合物，本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治鰓金龜屬(holotrichia)中的至少一種害蟲(chóng)中的應(yīng)用。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，最優(yōu)選根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白，本申請(qǐng)之三所述的組合物，本申請(qǐng)之四所述的轉(zhuǎn)基因微生物，以及本申請(qǐng)之五所述的應(yīng)用中的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一種在防治華北大黑鰓金龜(holotrichiaoblita)中的應(yīng)用。

單克隆抗體的制備技術(shù)已經(jīng)較為成熟，因此，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)技術(shù)手段，可以制得本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白的單克隆抗體。在制備單克隆抗體過(guò)程中，選用的抗原可以是本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白的全長(zhǎng)序列，也可以是本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白的部分氨基酸序列。所述抗原的純品可以通過(guò)本申請(qǐng)之六提供的制備如本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白的方法來(lái)獲得；所述抗原，特別是當(dāng)其為部分氨基酸序列時(shí)，也可以通過(guò)人工合成的方式獲得。因此，本申請(qǐng)之八提供了根據(jù)本申請(qǐng)之一所述的殺蟲(chóng)蛋白的單克隆抗體。優(yōu)選所述單克隆抗體為僅特異識(shí)別所述殺蟲(chóng)蛋白的單克隆抗體。

在本申請(qǐng)中沒(méi)有特殊說(shuō)明的情況下，本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)均屬于現(xiàn)有技術(shù)中所指的通用術(shù)語(yǔ)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施例的形式對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。

1)液體lb：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl1％，ph7.0，15磅滅菌15min。用于培養(yǎng)大腸桿菌。

2)固體lb：在液體lb培養(yǎng)基中加1.3％瓊脂，15磅滅菌15min。用于培養(yǎng)大腸桿菌。

3)抗生素：氨芐青霉素水溶液100mg/ml，用時(shí)稀釋500倍-20℃保存。其中pet21b質(zhì)粒載體具有氨芐青霉素抗性。

蛋白電泳檢測(cè)

120v預(yù)電泳約10-20min，取蛋白樣品40μl，加入10μl5×加樣緩沖液，混勻，再將上清和沉淀分別梯度稀釋?zhuān)蠓?-10min，12000rpm離心5min，取10l上清點(diǎn)樣。80v恒壓電泳至樣品濃縮呈直線，150v恒壓電泳至指示的溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。

脫色：電泳后取出凝膠，電泳后取出凝膠并用蒸餾水沖洗，加入50ml溶液i，微波爐中加熱30s，60rpm振蕩10min。

染色：倒掉溶液i后加入溶液ii(每50ml溶液ii加200l溶液iii)微波爐加熱30s，60rpm振蕩15min以上。

倒掉溶液ii，加入無(wú)菌水，凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

觀察結(jié)果，根據(jù)蛋白條帶著色程度比較目的蛋白表達(dá)情況，用凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

表1為sds聚丙烯酰氨凝膠的制備表。

表1sds聚丙烯酰氨凝膠的制備表

實(shí)施例1新基因的篩選及克隆

bt基因組提取

s1：5ml1mtris-hcl，1ml0.5medta，171.15g蔗糖，ph7.0，定容至500ml，115℃20min滅菌。

s2：10％sds4ml+ddh2o6ml，ph4.8-5.2。

s3：5m異硫氰酸胍，1mnaac。

te：10mmtris-hcl3ml，1mmedta600ul，ph8.0，定容至300ml。

1)將蘇云金芽胞桿菌261-1菌株劃線接種于lb培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)過(guò)夜；

2)盡可能刮取平板上全部菌體于1.5mlep管中，用150μls1充分懸??；

3)加入100mg石英砂，組織破碎儀上破碎1分鐘；

4)加入200μls2，充分混勻；

5)加入400μls3，充分混勻，12000rpm離心10分鐘；

6)將最上層上清轉(zhuǎn)移至1.5ep管中，加入等體積異丙醇，混勻后-20℃靜置20分鐘；

7)12000rpm離心10分鐘，棄上清；

8)70％無(wú)水乙醇清洗沉淀，室溫晾干；

9)加100μlte溶液溶解沉淀；

10)0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組質(zhì)量和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以261sip02_f(無(wú)縫bamhi)atgactggtggacagcaaatgggtcggatgttaacaaaggagatgtact(seqidno.3)和261sip02_r(無(wú)縫bamhi)tgtcgacggagctcgaattcggatcaaaggaatcatggttttcaatct(seqidno.4)為引物，以261-1菌株基因組為pcr模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增循環(huán)：94℃預(yù)變性10min；94℃變性1min；62℃退火1min；72℃延伸；30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，pcr產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。按照axygen公司的dna回收試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行pcr產(chǎn)物回收。對(duì)pet-21b進(jìn)行bamhi酶切后，與pcr純化產(chǎn)物進(jìn)行dna片段連接。然后，取10μl連接產(chǎn)物，加至100μldh5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；42℃熱激90s，冰浴5min，加入800μllb液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h；取200μl菌液涂于相應(yīng)抗性(氨芐青霉素抗性)lb平板，37℃培養(yǎng)12-18h，篩選出含有陽(yáng)性質(zhì)粒的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，其中陽(yáng)性質(zhì)粒被命名為pet-261sip02。

經(jīng)測(cè)序分析，261sip02(seqidno.1)基因長(zhǎng)度1191bp，其編碼蛋白為261sip02，共397個(gè)氨基酸(seqidno.2)，表達(dá)44.9kda蛋白。

然后提取pet-261sip02重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株rosetta(de3)。將261sip02在大腸桿菌rosetta(de3)中進(jìn)行iptg誘導(dǎo)表達(dá)，sds-page電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，261sip02基因在可溶組分和不可溶組分中均表達(dá)；其中表達(dá)約45kda左右蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符。陰性對(duì)照(即不含有261sip02基因，但含有pet-21b載體的大腸桿菌rosetta(de3))在可溶和不可溶性組分中都沒(méi)有相應(yīng)蛋白的表達(dá)條帶。

實(shí)施例2

蛋白的表達(dá)與定量分析

將攜帶261sip02基因的大腸桿菌rosetta(de3)菌株以1％的接種量接種于lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600值達(dá)到0.5-1.0之間時(shí)，加入誘導(dǎo)物50mmiptg，在150rpm，20℃低溫下誘導(dǎo)12h。然后在4℃下，8000rpm離心3min。離心收集菌體，加入50mmtris·cl(ph8.0)懸??；破碎菌體(利用超聲波常規(guī)完全破碎)，將超聲破碎后的菌液在4℃下12,000rpm離心15min；然后收集上清液。按照如下方法對(duì)所述上清液進(jìn)行sds-page定量分析：制備以下5種不同濃度梯度的bsa：0.8μg/μl、0.4μg/μl、0.2μg/μl、0.1μg/μl、0.05μg/μl，并將目標(biāo)蛋白進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)蛊浣K濃度介于0.8-0.05μg/μl，目標(biāo)蛋白和5種不同濃度的bsa(蛋白定量試劑盒：dcproteinassay)上樣量均為10μl，進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。以牛血清蛋白(bsa)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定大腸桿菌rosetta(de3)重組菌株中總蛋白的濃度。結(jié)合imagemastervds軟件分析sds-page中目的蛋白所占比例，計(jì)算目的蛋白，即得到上清液中的261sip02的濃度。

對(duì)比例1

以克隆到pet21b上的cry8g(seqidno.5)基因在大腸桿菌rosetta(de3))中相同條件下的表達(dá)產(chǎn)物為生物活性測(cè)定分析的陽(yáng)性對(duì)照。cry8g(seqidno.6)蛋白的表達(dá)同實(shí)施例2。其中，該蛋白的表達(dá)產(chǎn)物主要分布于沉淀中，即主要以包涵體的形式存在，因此，在進(jìn)行后續(xù)的生物活性測(cè)定時(shí)使用的沉淀產(chǎn)物。而在進(jìn)行定量分析和后續(xù)的生物活性測(cè)定之前，首先要將包涵體進(jìn)行常規(guī)溶解，后續(xù)定量分析同實(shí)施例2。

實(shí)施例3

活性分析

華北大黑鰓金龜(holotrichiaoblita)由滄州農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

(1)將土豆切成細(xì)絲在陽(yáng)光下晾曬至失水約60％-90％，同時(shí)將過(guò)篩后的土在陽(yáng)光下暴曬2-3小時(shí)；

(2)將晾曬過(guò)的土豆絲在配制好的系列稀釋的上清液(加入終濃度0.1％的洗滌劑)中浸泡30s；

(3)然后將土豆絲分裝于六孔板中；

(4)按每100g土加18ml溶液的比例用浸泡過(guò)土豆絲的上清液拌土，并將拌好的土分裝于六孔板中；

(5)將健康的5日齡華北大黑鰓金龜?shù)挠紫x(chóng)接種于六孔板中，每孔接1頭試蟲(chóng)，每30頭作為一個(gè)處理，每個(gè)處理做三次重復(fù)，接完蟲(chóng)后嚴(yán)格密封，防止幼蟲(chóng)爬出；

(6)放置25℃生化培養(yǎng)箱中，光周期為16h：8h，濕度50％左右，每天觀察土豆絲是否發(fā)霉(為的是避免土豆發(fā)霉)，是否有水蒸氣凝結(jié)(為的是避免含水量過(guò)高)，并在調(diào)整生化培養(yǎng)箱內(nèi)的水分，保持箱內(nèi)濕度；

(7)7天后調(diào)查各個(gè)處理的死、活蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算死亡率、存活率、校正死亡率和lc50。

其中，對(duì)試蟲(chóng)進(jìn)行l(wèi)c50測(cè)定之前，首先使用如上的生物活性測(cè)定方法經(jīng)過(guò)初篩初步確定殺蟲(chóng)的濃度范圍，然后再測(cè)定一系列的濃度梯度下的殺蟲(chóng)活性，進(jìn)而計(jì)算出lc50。在某一特定濃度下的死亡率和校正死亡率計(jì)算公式如下：

根據(jù)生測(cè)數(shù)據(jù)采用spss(v13.0)軟件計(jì)算致死中濃度(lc50)。其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2

由表2的結(jié)果可知，本申請(qǐng)的261sip02殺蟲(chóng)蛋白對(duì)華北大黑鰓金龜?shù)幕钚燥@著地優(yōu)于已知的cry類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白cry8g。將本申請(qǐng)的261sip02殺蟲(chóng)蛋白用于防治華北大黑鰓金龜不但提供了一種新的殺蟲(chóng)蛋白，而且還可以顯著地降低生產(chǎn)成本，從而帶來(lái)更為可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

雖然本發(fā)明已經(jīng)參照其優(yōu)選地具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解在沒(méi)有脫離本發(fā)明的真正的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行的各種改變。例如，可以對(duì)本發(fā)明的主體、精神和范圍進(jìn)行多種改變以適應(yīng)特定的情形、材料、材料組合物或方法步驟。所有的這些改變均包括在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。并且利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許的變動(dòng)或修飾均等同于等效實(shí)施案例，均屬于技術(shù)方案范圍內(nèi)。

lha1760150核苷酸和氨基酸序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>一種新的殺蟲(chóng)蛋白及其核苷酸序列

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