Aav載體和用于抗aav（腺相關(guān)病毒）中和抗體的檢測的制作方法
【專利說明】AAV載體和用于抗AAV(腺相關(guān)病毒）中和抗體的檢測 相關(guān)申請信息
[0001 ]本申請要求2013年7月12日提交的美國臨時申請序列No. 61/845841的名稱為"AAV VECTOR AND ASSAY FOR ANTI-AAV(ADEN0-ASS0CIATED VI抓S)肥UTRALIZING ANTIB孤IES" 的優(yōu)先權(quán)，該申請的全部內(nèi)容在此通過引用明確地并入本文。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗腺相關(guān)病毒(AAV)載體的體液免疫是血管內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的重要屏障，導致在載體 進入祀細胞之前將其清除。針對AAV衣殼的抗體在人體(該病毒的天然宿主）中是非常普遍 存在的，并且由于衣殼蛋白質(zhì)序列的同源性程度而與許多血清型交叉反應(yīng)。結(jié)果，當載體被 導入血流中時甚至相對低滴度的中和抗體(Mb)可阻斷AAV轉(zhuǎn)導。相反地，AAV載體向眼、腦 的基因轉(zhuǎn)移或直接肌內(nèi)遞送似乎對NAb中和比較不敏感。
[0003] 抗AAV的NAb存在于滑液（SF)中并且具有W血清型依賴性的方式抑制載體介導的 轉(zhuǎn)導的潛力。然而，SF中抗不同血清型的NAb水平和血清中的抗AAV NAb滴度與SF之間的關(guān) 系是鮮為人知的。最后，因為NAb可有效地阻斷體內(nèi)AAV介導的轉(zhuǎn)導，所W克服抗病毒衣殼的 體液免疫的策略對于實現(xiàn)成功的基因轉(zhuǎn)移而言是非常重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本文公開的是病毒載體、病毒顆粒W及篩選、分析和測定病毒抗體的量或中和樣 品的抗體活性的方法和用途。運樣的病毒載體、病毒顆粒W及方法和用途可用于許多病毒 類型，例如慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒(AAV)血清型。使用不同的病毒載體、病毒顆粒和抗 體篩選方法和用途，可篩選、檢測、分析和測定抗病毒免疫球蛋白質(zhì)(g)，例如IgG、IgA、IgM、 I巧、I曲W及量。
[0005] 該篩選、檢測、分析或測定量的結(jié)果可用于使用慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒 (AAV)血清型測定受試者的適宜性，或用于基因治療的載體類型或劑量取代或補充缺陷 或缺失基因或者剔除或敲除缺陷或不希望有的基因的表達）。例如，如果受試者表達很少的 或不表達抗特定病毒血清型例如AAV血清型2(AAV2)的抗體，那么受試者將是AAV2介導的基 因療法的合適的候選者。如果受試者表達抗特定病毒血清型例如AAV2的中等量或大量抗體 時，那么對于AAV2介導的基因療法而言，受試者可能需要更大劑量或更多個劑量的AAV2載 體，或與藥理學調(diào)節(jié)的B細胞應(yīng)答的藥劑或方法相組合。受試者的基因轉(zhuǎn)移因此可實現(xiàn)，否 則對于病毒載體基因轉(zhuǎn)移療法而言其不是理想的候選者。替代地，如果是可用的，則非AAV2 載體(例如另一個AAV血清型）可用于運樣的受試者的基因治療。因此，基于所存在的病毒抗 體(如果有的話)的存在或不存在、類型和/或量(例如滴度），W及基于受試者中病毒抗體的 存在、類型和量針對給定的受試者所選的載體，病毒載體施用可W個體化。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明，提供了重組AAV載體序列，所述載體序列包括報告轉(zhuǎn)基因。在一個實 施方式中，重組AAV載體序列包括報告轉(zhuǎn)基因，其中報告轉(zhuǎn)基因包括(a)單鏈或自身互補的 基因組，（b)可操作地連接在一個或更多個表達調(diào)控元件上，W及(C)側(cè)翼為一個或更多個 側(cè)翼元件。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明，還提供了重組AAV載體，其中所述載體包括報告轉(zhuǎn)基因。在一個實施 方式中，重組AAV載體包括報告轉(zhuǎn)基因，其中報告轉(zhuǎn)基因包括(a)單鏈或自身互補的基因組， (b)可操作地連接在一個或更多個表達調(diào)控元件上，W及（C)側(cè)翼為一個或更多個側(cè)翼元 件。在具體的實施方式中，所述重組AAV載體包括感染性重組AAV顆粒。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明，進一步提供了用于分析或檢測或測量結(jié)合AAV的抗體的方法和用途。 在一個實施方式中，方法或用途包括:A)提供使重組載體衣殼化的感染性重組AAV顆粒，其 中（i)所述載體包括報告轉(zhuǎn)基因，（ii)所述報告轉(zhuǎn)基因包括單鏈或自身互補的基因組，和 (iii)所述報告轉(zhuǎn)基因可操作地連接在一個或更多個表達調(diào)控元件上并且側(cè)翼為一個或更 多個側(cè)翼元件;B)提供來自受試者的生物樣品W用于分析或檢測結(jié)合AAV的抗體;C)提供可 W感染所述感染性重組AAV顆粒的細胞;D)使(A)的感染性重組AAV顆粒與(B)的生物樣品接 觸或解育，從而產(chǎn)生所得的混合物(M);在其中(A)的感染性重組AAV顆粒可在所述細胞中感 染并表達報告轉(zhuǎn)基因的條件下使(C)的細胞和所得的混合物(M)接觸;測量報告轉(zhuǎn)基因的表 達；W及將(f)的所述報告轉(zhuǎn)基因表達與對照的報告轉(zhuǎn)基因表達進行比較，所述對照或者陰 性(-)對照（i)缺乏結(jié)合AAV的抗體，或（ii)含有預(yù)定量的結(jié)合AAV的抗體。比所述(-)對照的 報告轉(zhuǎn)基因表達多的（f)的報告轉(zhuǎn)基因表達分析或檢測或測量生物樣品中結(jié)合AAV的抗體 的存在。相比于預(yù)定量的結(jié)合AAV的抗體的報告轉(zhuǎn)基因表達而言，（f)的報告轉(zhuǎn)基因表達分 析或檢測或測量比對照的更大或更小的生物樣品中的抗體。
[0009] 在本發(fā)明的具體方面，所述重組載體包括AAV載體。在更具體的方面，所述AAV載體 包括 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、化74或化 10 載體，或任何前述AAV載體的雜合體或嵌合體。
[0010] 在本發(fā)明的具體方面，所述方法或用途在體外進行。例如，細胞可W與感染性重組 AAV顆粒體外接觸或解育。
[0011] 在本發(fā)明的多個實施方式中，所分析、檢測或測量的抗體結(jié)合病毒包膜或衣殼蛋 白質(zhì)，例如AAV衣殼蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的具體方面，所分析、檢測或測量的抗體結(jié)合AAV血清 型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA V6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、化7 4或化 10或 任何前述AAV血清型的雜合體或嵌合體。
[0012] 在本發(fā)明的多個實施方式中，預(yù)定量的結(jié)合AAV的抗體可W是任何AAV血清型。在 本發(fā)明的具體方面，預(yù)定量的抗體結(jié)合AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、 八八￥9、44￥10、44￥11、44￥12、化74或化10，或任何前述44￥血清型的雜合體或嵌合體。
[0013] 在本發(fā)明的進一步的具體方面，細胞包括哺乳動物細胞，例如靈長類動物(例如， 人)細胞。在本發(fā)明的更具體的方面，細胞包括皿K-293 (例如，2V6.11)細胞、C冊、BHK、MDCK、 10T1/2、WEHI細胞、C0S、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VER0、WI38、MRC5、A549、HT1080、293、B-50、 3T3、NI 冊 Τ3、胎 pG2、Saos-2、Η址 7、肥R、肥Κ、肥 L或 HeLa 細胞。
[0014] 在其他方面，細胞提供編碼用于AAV復制和/或基因組整合的輔助功能的核酸序 列。在本發(fā)明的更具體的方面，細胞表達AAV E4基因和或AAV rep或cap。
[001引在進一步的方面，所述細胞可W感染包括與AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV 11、AAV 12、化74或加 10，或任何前述AAV 血清型的雜 合體或嵌合體的VP1、VP2或VP3序列具有90%或更高同一性的VP1、VP2或VP3序列的AAV顆 粒，或者所述細胞可 W 感染 AAV 血清型AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAV10、AAV11、AAV12、化74或化10,或任何前述AAV血清型的雜合體或嵌合體。
[0016] 在更進一步的方面，所述細胞與所得混合物(M)接觸6-48小時的時間，12-36小時 的時間，20-30小時的時間，或約24小時的時間。在更進一步的方面，所述細胞在測量所述報 告轉(zhuǎn)基因的表達之前裂解。
[0017] 在本發(fā)明的多個實施方式中，報告轉(zhuǎn)基因編碼提供酶、比色、巧光、發(fā)光、化學發(fā)光 或電化學信號的蛋白質(zhì)。在具體的方面，報告轉(zhuǎn)基因包括蛋光素酶基因，例如海腎巧光素酶 或蛋火蟲蛋光素酶基因。在進一步的具體方面，報告轉(zhuǎn)基因包括β-半乳糖巧酶基因、β-葡萄 糖巧酸酶基因、氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因。在進一步的具體方面，報告轉(zhuǎn)基因編碼綠色巧光蛋白質(zhì) (GFP)、紅色巧光蛋白質(zhì)(RFP)或堿性憐酸酶。
[0018] 在本發(fā)明的進一步的多個實施方式中，報告轉(zhuǎn)基因是單鏈基因組，或報告轉(zhuǎn)基因 是自身互補的基因組。在本發(fā)明的其他方面，自身互補的報告轉(zhuǎn)基因基因組包括雙鏈(或雙 鏈體)反向重復序列結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的進一步的方面，自身互補的報告轉(zhuǎn)基因基因組包括發(fā) 夾環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0019] 在本發(fā)明的進一步的實施方式中，載體或載體序列包括一個(或更多個)表達調(diào)控 元件，例如啟動子和/或增強子核酸序列，其可在哺乳動物細胞中操作。在本發(fā)明的還有的 進一步的實施方式中，載體或載體序列包括一個或更多個側(cè)翼元件，例如一個或更多個AAV 反向末端重復序列（ITR)。在本發(fā)明的進一步的方面，報告轉(zhuǎn)基因定位在一個或更多個側(cè)翼 元件之間，例如一個或更多個5'和/或3'AAV 口R。
[0020] 在本發(fā)明的更具體的實施方式中，載體或載體序列包括AAV的第一反向末端重復 (ITR);可在哺乳動物細胞中操作的啟動子;報告轉(zhuǎn)基因；多腺巧酸化信號和任選的AAV的第 二ITR。在本發(fā)明的具體方面，重組載體或載體序列包括限制位點，W允許在可在哺乳動物 細胞中操作的啟動子下游插入報告轉(zhuǎn)基因，W及在限制位點下游插入轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。在 本發(fā)明的進一步的具體方面，重組載體或載體序列包括限制位點，W允許在可在哺乳動物 細胞中操作的啟動子下游插入報告轉(zhuǎn)基因，W及在限制位點下游插入轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。在 具體的方面，所述啟動子、所述限制位點和所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件均位于5'AAV ITR的下游和 任選的3'AAV ITR的上游。
[0021] 在本發(fā)明的更具體的方面，一個或更多個側(cè)翼元件是未經(jīng)AAV Rep蛋白質(zhì)處理的 突變的或變異的AAV 口R。在本發(fā)明的其他的更具體的方面，一個或更多個側(cè)翼元件是突變 的或變異的AAV 口R，其允許或促進在感染性重組AAV顆粒中自身互補的報告轉(zhuǎn)基因基因組 形成雙鏈反向重復序列結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的進一步的更具體的方面，一個或更多個側(cè)翼元件 是突變的或變異的AAV 口R，其具有刪除的D序列和/或刪除的末端解離位點（TRS)序列（例 如，突變的或變異的AAV ITR被定位在報告轉(zhuǎn)基因的自身互補序列之間）。在本發(fā)明的還有 的進一步的更具體的方面，突變的或變異的AAV ITR包括AAV2口R，該AAV2口R具有對應(yīng)于所 突變的、修飾的、改變的或刪除的AAV2基因組序列的核巧酸122-144的一個或更多個核巧 酸。
[0022] 在本發(fā)明的進一步的【具體實施方式】中，感染性重組AAV顆粒包括感染靈長類動物 的AAV血清型。在具體的方面，感染性重組AAV顆粒包括感染人類或雜猴的AAV血清型。在多 個具體的方面，感染性重組AAV顆粒包括與AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、 八八￥7、44￥8、44￥9、44￥10、44￥11、44￥12、化74或化10，或任何前述44￥血清型的雜合體或嵌合 體的VPUVP2或VP3序列具有90%或更高同一性的VPUVP2或VP3序列。在進一步的多個具體 方面，感染性重組 AAV 顆粒包括 AAV 血清型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、 八八￥9、44￥10、44￥11、44￥12、化74或化10，或任何前述44￥血清型的雜合體或嵌合體。
[0023] 在本發(fā)明的多個實施方式中，生物樣品包括靈長類動物的樣品。運樣的樣品包括 但不限于血清、血漿或血液，例如人血清、人血漿或人血。
[0024] 在本發(fā)明進一步的實施方式中，生物樣品是或已經(jīng)熱滅活的。在具體的方面，生物 樣品是或已經(jīng)在約50-70攝氏度熱滅活約15分鐘至多達1小時，或者是或已經(jīng)在約56攝氏度 熱滅活約30分鐘。
[0025] 在本發(fā)明的還有的進一步的實施方式中，生物樣品在與感染性重組AAV顆粒接觸 或解育之前被稀釋。在具體的方面，分析、測量或檢測多個生物樣品的稀釋液。在進一步具 體的方面，分析、測量或檢測多個不同稀釋比的生物樣品。在更具體的方面，將生物樣品在 與感染性重組AAV顆粒接觸或解育之前稀釋為1:1至1: 500;或?qū)⑸飿悠吩谂c感染性重組 AAV顆粒接觸或解育之前稀釋為1:500至1:5000。在另外的具體方面，分析、測量或檢測至少 2、3、4、5或6個不同稀釋比的生物樣品。
[0026] 在本發(fā)明的多個實施方式中，受試者（例如，用于病毒載體例如AAV載體介導的基 因治療的候選者)受試者是哺乳動物(例如，靈長類動物）。在具體方面，受試者是人。
[0027] 在本發(fā)明的多個實施方式中，受試者患有由于蛋白質(zhì)的表達或活性不足引起的病 癥，或患有由于不正常、異?；虿黄谕械牡鞍踪|(zhì)的表達或活性引起的病癥。
[0028] 在本發(fā)明的進一步的多個實施方式中，受試者患有遺傳性疾病。在本發(fā)明的另外 的多個實施方式中，受試者是基因替代或補充療法例如基因剔除或敲除療法的候選者。在 本發(fā)明的更具體的實施方式中，受試者患有肺疾病(例如，囊性纖維化）、出血性疾病(例如， 血友病A或血友病B，其具有或無抑制劑）、地中海貧血、血液素亂(例如，貧血）、阿爾茨海默 病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、癒痛癥、溶酶體膽積病、銅或鐵累積病 (例如，威爾森氏或口克斯?。?、溶酶體酸性脂肪酶缺乏癥、神經(jīng)或神經(jīng)變性疾病、癌癥、1型 或2型糖尿病、高雪氏病、胡爾勒氏病、腺巧脫氨酶缺乏癥、代謝缺陷(例如，糖原膽積?。⒁?網(wǎng)膜變性疾?。ɡ鏡PE65缺乏癥、無脈絡(luò)膜和眼睛的其他疾?。嶓w器官（例如，腦、肝、 腎、屯、臟)的疾病或感染性病毒(例如，乙型肝炎和丙型肝炎、HIV等）、細菌或真菌病。
[0029] 在本發(fā)明的多