腦與脊髓興奮毒性損傷細胞網(wǎng)絡(luò)模型及其構(gòu)建方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種W中樞神經(jīng)系統(tǒng)毛細血管內(nèi)皮細胞 (endothelial cells, E)、星形膠質(zhì)細胞（astro巧tes,A)及神經(jīng)元（neurons，腳所形成的 原代同源=細胞四維模型為基礎(chǔ)的腦與脊髓興奮毒性損傷細胞網(wǎng)絡(luò)模型及其構(gòu)建方法和 應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，由興奮毒性所致的頑固性癒痛、急性缺血性卒中、肌萎縮 性側(cè)索硬化癥和早老性癡呆病等疾病，已經(jīng)嚴重危害了人類生命與健康。而該類腦與脊髓 興奮毒性損傷相關(guān)的疾病W其復雜性、難治性越來越引起關(guān)注。雖然現(xiàn)有大量的研究者致 力于針對該類疾病的藥物研發(fā)，但是目前在臨床治療中針對W上疾病相關(guān)治療藥物所達到 的效果并不理想。對于該種困境，其主要原因是由興奮毒性所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā) 生發(fā)展過程是一個包含了多基因、多因素、多細胞相互作用的復雜途徑。
[0003] 目前興奮毒性損傷的體外研究中，多W單細胞培養(yǎng)或是簡單的兩種細胞混合培養(yǎng) 作為藥物研發(fā)的細胞模型。在該類細胞模型中，往往是一種藥物直接作用于祀細胞，該種藥 物作用方式與體內(nèi)的藥物代謝途徑大相徑庭。同時該種模型，也無法客觀模擬體內(nèi)細胞間 復雜的相互作用。目前出現(xiàn)了利用Transwell將=種細胞進行共培養(yǎng)，按照細胞的來源可 分為兩類，第一類細胞來源多W細胞系為主。雖然細胞系具有特征穩(wěn)定，方便獲得等優(yōu)點， 但細胞系往往會丟失大量原有的特性，對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響也難估計。第二類的模型中 部分細胞是由其本身的前體細胞誘導分化而來，人工誘導所產(chǎn)生的該類細胞，雖然部分具 有一定的細胞功能，但其完整性與原代所培養(yǎng)的細胞還有較大的差距。在動物實驗中，動物 個體之間的差異，動物體內(nèi)的復雜性，對實驗結(jié)果的影響同樣是難W預測。同時動物實驗高 昂的實驗成本，也造成大量研究難W進行。
[0004] E、A、N是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中相互作用關(guān)系最為密切的S種細胞，E形成的毛細血管 由附近A的突起所包裹，同時A的突起也伸向了周圍的神經(jīng)元，他們共同形成了神經(jīng)血管單 元，在興奮毒性損傷發(fā)生時，=者都會發(fā)生相應的應答，同時產(chǎn)生細胞間信號傳遞?？古d奮 毒損傷藥物進入體內(nèi)后，多W首先與E作用，然后是A，最后才是N。其藥物作用的祀細胞可 能是E、A和N其中的一種或多種，或是通過作用于其中的某一細胞后，再間接地影響其他細 胞。因此無論是簡單的單細胞培養(yǎng)、兩種細胞簡單W及利用Transwell進行的細胞系共培 養(yǎng)都無法滿足關(guān)于腦與脊髓興奮毒性損傷及其防治干預的研究。而動物實驗中實驗動物的 不均一性和高成本，也很大程度上限制的該研究的進展。因此需要建立一種新的更加接近 于體內(nèi)環(huán)境細胞培養(yǎng)模型，從而實現(xiàn)在避免動物實驗中實驗動物的不均一性和高成本的同 時，也要盡量創(chuàng)造出一個更加類似體內(nèi)的細胞生長環(huán)境。
[0005] 隨著相關(guān)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，多中細胞共同培養(yǎng)，能夠成為現(xiàn)實。如何將E、A、 N=種細胞盡可能的模仿體內(nèi)的空間位置進行共培養(yǎng)，包括培養(yǎng)器材的選取、細胞來源和不 同培養(yǎng)基的配比等等，很多的研究者作出了不少的嘗試。目前，現(xiàn)有體外共培養(yǎng)模型的細胞 有來自于原代，也有來源與細胞系，或是原代細胞與細胞系混合培養(yǎng)，甚至是將不同種屬的 細胞共培養(yǎng)。此外，共培養(yǎng)模型的支架材料選擇更是各式各樣，其中一大類是insed插件， 而目前的研究為了能獲得更好的E緊密連接實驗參數(shù)值，大多研究者選擇孔徑為0. 4 y m的 插件，該對單純研究E緊密連接沒有問題，但是如果要在插件底外側(cè)面加入A進行共培養(yǎng) 時，0. 4 y m的孔徑是無法保證A的突起可W順利穿過的；另一大類是微流控裝置，該種方式 雖然能通過較少的細胞數(shù)量實現(xiàn)多細胞共培養(yǎng)，但也正因如此，很多的實驗由于細胞數(shù)量 過少而無法完成，更加無法模擬各種細胞在體內(nèi)的相對數(shù)量關(guān)系。
[0006] 綜上所述目前對于腦與脊髓興奮毒性損傷的體外研究，急需一種合理穩(wěn)定的體外 研究模型，W為在發(fā)生腦與脊髓興奮毒性損傷時，不單是N興奮毒性損傷，與N有密切聯(lián)系 的E和A同樣會發(fā)生相應的變化。在進行藥物研究時，E的變化有為重要，因為E形成了血 腦屏障，而體內(nèi)任何一種藥物都需要通過血液循環(huán)經(jīng)血腦屏障到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而目前 神經(jīng)、精神疾病藥物研究的一個瓶頸就是很多體外研究忽略了該一藥代動力學過程，該主 要是由于現(xiàn)階段腦與脊髓興奮毒性損傷體外研究模型無法模擬體內(nèi)E、A、N=種細胞之間 的通過相互作用產(chǎn)生的動態(tài)平衡，而是單純的直接將神經(jīng)元暴露于備選藥物，該也是很多 藥物只能停留于實驗室，而不能走向臨床的主要原因?；谏鲜鲈颍壳捌惹行枰⒁?種更加接近于體內(nèi)環(huán)境的腦與脊髓興奮毒性損傷及其相關(guān)藥物研究用體外模型。
[0007] CN201310065078. 7的發(fā)明專利公開"中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源S細胞四 維模型及構(gòu)建方法"，其按照體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)E、A和N的相對空間結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了原代同源 EAN=細胞四維模型。但是按照該模型的構(gòu)建方法所獲得的E的緊密連接程度往往偏低，無 法滿足損傷實驗和藥物研究的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是提供了一種WE、A及N所形成的原代同源S細胞四維模型為基礎(chǔ) 的腦與脊髓興奮毒性損傷細胞網(wǎng)絡(luò)模型。
[0009] 本發(fā)明的再一目的是提供上述腦與脊髓興奮毒性損傷細胞網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建方法， W原代同源E、A及N =種重要細胞，按其在體內(nèi)的相對空間位置及數(shù)量關(guān)系進行立體化共 培養(yǎng)，利用谷氨酸-甘氨酸聯(lián)合暴露神經(jīng)元完全培培養(yǎng)液，模擬體內(nèi)腦與脊髓興奮毒性損 傷。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供上述腦與脊髓興奮毒性損傷細胞網(wǎng)絡(luò)模型的應用，采用 經(jīng)插件內(nèi)腔E培養(yǎng)液給藥方式，模擬生物體內(nèi)藥物自循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)血腦屏障進入中樞神經(jīng)系 統(tǒng)的藥物代謝途徑，將該模型作為藥物篩選平臺應用于相關(guān)防治干預研究，W解決目前研 究所存在的上述技術(shù)問題。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的腦與脊髓興奮毒性損傷細胞網(wǎng)絡(luò)模型，其包括原代同源的E、A及N，
[0012] 其中，將原代培養(yǎng)已經(jīng)純化的A進行膜酶消化，同時將長滿E的插件從培養(yǎng)孔取出 倒置放于無菌培養(yǎng)皿中，將A懸液植于插件底膜外側(cè)面，之后該無菌培養(yǎng)皿置于普通細胞 培養(yǎng)系統(tǒng)解育；然后，插件翻轉(zhuǎn)插入裝有E完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)孔，同時在插件內(nèi)加入E完全 培養(yǎng)液，待E和A共培養(yǎng)后，將E和A共培養(yǎng)的插件放置于已經(jīng)成熟穩(wěn)定的N培養(yǎng)孔中，既 構(gòu)建了基礎(chǔ)EAN細胞網(wǎng)絡(luò)模型，其構(gòu)造如圖1所示；在培養(yǎng)孔中插有Transwell插件，插件 外腔有N完全培養(yǎng)液，內(nèi)腔有E完全培養(yǎng)液；N生長于培養(yǎng)孔底面；所述插件底部內(nèi)側(cè)面涂 有膠原蛋白IV，W模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)E-A間隙基底膜蛋白層；插件底部內(nèi)側(cè)面膠原蛋白IV 上層生長有E，插件底部外側(cè)面生長有A，其突起通過插件底孔穿向E底面；
[0013] 其中，通過將基礎(chǔ)EAN中神經(jīng)元完全培養(yǎng)液更換為谷氨酸-甘氨酸聯(lián)合暴露神經(jīng) 元完全培培養(yǎng)液，然后將細胞模型重新置于普通細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘，十五分 鐘結(jié)束后，再將谷氨酸-甘氨酸聯(lián)合暴露神經(jīng)元完全培培養(yǎng)液更換為神經(jīng)元完全培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘、3小時或3天，W模擬腦與脊髓興奮毒性損傷后的=個時間窗分別對應臨 床上興奮毒性損傷后的超急性期、急性期和亞急性期。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的腦與脊髓興奮毒性損傷的細胞網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建方法包括W下步驟：
[0015] 1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)原代同源基礎(chǔ)EAN細胞網(wǎng)絡(luò)模型化asal network of the matured