專利名稱：柯薩奇病毒a16型rt-lamp核酸檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及柯薩奇病毒A16各種標(biāo)本(糞便、肛拭、咽拭、皰疹液、腦脊液)核酸檢測(cè)用引物及試劑盒。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒A16 ((Coxsackievirus A16，簡(jiǎn)稱CA16)為單股正鏈RNA病毒，屬于小 RNA 病毒科(Picoranviridae)。CA16 與腸道病毒 71 型(Enterovirus 71，EV71)同為兒童手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)的兩大主要病原。EV71感染除引起HFMD外還可引起較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，如無(wú)菌性腦炎、腦膜炎、肺水腫等，相對(duì)EV71而言，CA16感染引起的HFMD癥狀較溫和，合并癥的發(fā)生率也較低，由于其亞臨床感染常常被忽略。但近年越來(lái)越多的報(bào)道指出，CA16感染可能與心肌炎、心包炎難治性休克等致死性并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)，個(gè)別地區(qū)還有引起成人致死性肺炎的報(bào)道，世界上許多國(guó)家和地區(qū)也曾報(bào)道CAieK 致手足口病的流行，且每隔3-5年有一次大流行，日本、馬來(lái)西亞、臺(tái)灣、新加坡都有CA16引起手足口病暴發(fā)發(fā)流行的報(bào)道。日本1981-2007年手足口病的流行和新加坡2001-2007年手足口病的流行均是由CA16、CA16地方變異株和腸道病毒71型交替出現(xiàn)引起，因此，CA16 感染應(yīng)受到重視。手足口病于2008年5月2日已被中國(guó)衛(wèi)生部納入傳染病防治法規(guī)定的丙類傳染病進(jìn)行管理。目前，經(jīng)典的檢測(cè)腸病毒的方法多采用細(xì)胞分離培養(yǎng)、特異性抗體檢測(cè)，該方法步驟煩瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，而且一些腸道病毒難以在細(xì)胞中進(jìn)行增殖，容易出現(xiàn)漏檢；基于CA16核酸擴(kuò)增的分子生物學(xué)診斷技術(shù)如PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(real-time fluorescent RT-PCR)等在病原微生物的檢測(cè)以及疫病診斷方面發(fā)揮著重大作用，但這些方法或者需要精密控溫設(shè)備和高級(jí)復(fù)雜的分析儀器，或者對(duì)操作人員的熟練度和專業(yè)水平要求比較高，且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，不利于現(xiàn)場(chǎng)樣品的檢測(cè)，不利于在基層推廣，無(wú)法滿足簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確診斷的要求；而疫病的防控和治療的關(guān)鍵在于對(duì)病原微生物的快速、準(zhǔn)確、及早的檢測(cè)并確診。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的新型診斷技術(shù)對(duì)于疫病的診斷就顯得尤為重要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由Notomi等于2000年報(bào)道的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，它針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等溫(60 65°C )的條件下高效、特異、快速的擴(kuò)增目的基因。目前， LAMP技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用病原微生物的診斷中，包括人類致病細(xì)菌和病毒，動(dòng)植物病毒和寄生蟲(chóng)的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于柯薩奇病毒A16型RT-LAMP檢測(cè)的引物組和試劑盒，以能夠簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中是否含柯薩奇病毒A16型，滿足目前對(duì)手足口病現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)柯薩奇病毒A16型的RT-LAMP引物組，包括四條引物，所述四條引物的核苷酸序列為F3 :AGGAGACAGCCATTGGGAA ；B3 :ACTGCAGTAATTGGGGGACT ；FIP :GTTCTGTGTACCCGTGGTGGG-TTTCTTTAGCCGTGCTGGTT ；BIP :TGCTCAATTACGGCGCAAATGC-GCTTGGCTACGACAAATGTG。本發(fā)明提供的柯薩奇病毒A16型的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，包括上述RT-LAMP引物組。本發(fā)明提供的一種柯薩奇病毒A16型的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，包括含有上述RT-LAMP引物組的RT-LAMP反應(yīng)液，23 μ 1所述RT-LAMP反應(yīng)液的配置為IOX buffer2. 5μ l,25mM MgCl2 6 μ 1, IOmM each dNTPs 3. 5μ1，5Μ Betaine 4 μ l,5U/y IAMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0· 5μ 1，8υ/μ 1 Bst DNA polymerase 1 μ 1, EDPC H2O 2· 5 μ 1，40 μ M 所述 FIP 1μ 1，40μΜ 所述 BIP 1口1，10口] 所述卩3 0. 5 μ 1，10 μ M 所述 Β3 0. 5μ1。上述試劑盒還可以包括10000XSTOR Green I染料。上述試劑盒的最佳檢測(cè)反應(yīng)條件是63°C恒溫反應(yīng)60min，80°C反應(yīng)5min。操作時(shí)只需將RT-LAMP反應(yīng)液和待檢RNA混勻，63°C恒溫反應(yīng)60min即可完成逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增過(guò)程， 80V反應(yīng)5min使酶滅活，反應(yīng)結(jié)束后結(jié)果判斷可取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，或者在擴(kuò)增產(chǎn)物管內(nèi)加入STOR Green I熒光染料，根據(jù)反應(yīng)液顏色的變化來(lái)判定結(jié)果。與現(xiàn)有的CA16RT-PCR、Real-time RT-PCR相比，本發(fā)明 CA16 RT-LAMP 以待檢樣品 RNA為摸板，只需一步就可以完成在等溫環(huán)境中的循環(huán)置換擴(kuò)增反應(yīng)，省略了單獨(dú)的逆轉(zhuǎn)錄步驟和模板的變性、退火和延伸反應(yīng)過(guò)程中溫度變化的耗時(shí)，而且在恒溫水浴鍋中就能進(jìn)行，不需要復(fù)雜的儀器，最后用電泳檢測(cè)或加熒光染料后肉眼或紫外燈下就可以觀察結(jié)果， 具有操作方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果易于判斷、成本低等特點(diǎn)。同時(shí)，本發(fā)明CA16RT-LAMP特異性好，靈敏度高。因此，本發(fā)明試劑盒及其CA16RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)能較好滿足目前對(duì)手足口病現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的迫切需要，可用于疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、醫(yī)院、托幼機(jī)構(gòu)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，易于在基層單位大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。


圖 1 是 CA16RT-LAMP、RT-PCR、Real-time RT-PCR 靈敏度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖；其中，圖I-A是CA16RT-LAMP產(chǎn)物加染料后在可見(jiàn)光下觀察的結(jié)果(上排Al)和紫外光下觀察的結(jié)果(下排A2)，圖中，1-8 分別為100TCID50標(biāo)準(zhǔn)品10°，10-1，10_2，10_3，10_4，10_5， 10、10_7梯度稀釋后提取RNA的RT-LAMP產(chǎn)物，9 陰性對(duì)照；圖 I-B 是 CA16RT-LAMP 產(chǎn)物電泳條帶，圖中，M :DL2000Marker (100，250，500，750， 1000，2000bp)，1-8 分別為 100TCID50 標(biāo)準(zhǔn)品 10。，10、IO"2, IO"3, IO"4, IO"5, IO"6,10_7 梯度稀釋后提取RNA的RT-LAMP產(chǎn)物，9 陰性對(duì)照；圖I-C是CA16RT-PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖，圖中，M :DL2000Marker，1_8 分別為 100TCID50 標(biāo)準(zhǔn)品 10°，ΚΓ1，1(Γ2，1(Γ3，1(Γ4，1(Γ5，1(Γ6，1(Γ7 梯度稀釋后提取 RNA 的 RT-PCR 產(chǎn)物，9:陰性對(duì)照；圖I-D是CA16RT-PCR Real-time靈敏度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖；圖2是CA16RT-LAMP技術(shù)引物特異性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖；其中，
圖2-A是LAMP產(chǎn)物加染料后在可見(jiàn)光下觀察的結(jié)果(上排Al)和紫外光下觀察的結(jié)果(下排A2)，圖中，1-9 :CA16病毒，10-14 :EV71病毒，15-17 滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒 Polio I、Polio II, PolioIII,18-19 輪狀病毒，20-21 諾如病毒，22 陰性對(duì)照；圖 2-B 是 LAMP 產(chǎn)物電泳條帶，圖中，M :DL2000Marker, 1-9 :CA16 病毒，10-14 EV71病毒，15-17 滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒Polio I.Polio II、PolioIII，18-19 輪狀病毒， 20-21 諾如病毒，22 陰性對(duì)照；圖3是CA16RT-LAMP技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖，圖中，M :DL2000Marker, 1-9 分別是圖2-B中9株CA16陽(yáng)性RT-LAMP產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物；圖4是CA16RT-LAMP方法的可重復(fù)性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖；其中，圖4-A是LAMP產(chǎn)物加染料后在可見(jiàn)光下觀察的結(jié)果(上排Al)和在紫外光下觀察的結(jié)果(下排々2)，圖中，1，3，5，7:分別為0416陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的四次重復(fù)，2，4，6，8:分別為 1,3,5,7四次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照；圖4-B是LAMP產(chǎn)物電泳圖，其中，M :DL2000Marker, 1,3,5,7 分別為CA16陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的四次重復(fù)，2，4，6，8 分別為1，3，5，7四次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)GenBank公布的CA16 VPl基因序列，利用生物軟件CLAST分析其相對(duì)保守區(qū)， 利用 LAMP 在線設(shè)計(jì)軟件 PrimerExplorer V4 (http //primerexplorer. jp/e/)針對(duì)相對(duì)保守序列區(qū)設(shè)計(jì)了 4條引物，兩條外引物FIP (F2+F1C)和BIP (B2+B1C)，兩條內(nèi)引物F3和B3， 分別與靶序列中6個(gè)結(jié)合區(qū)匹配，在利用Oligo 6軟件和BLAST對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)。引物序列為F3 (正向內(nèi)弓丨)5，-AGGAGACAGCCATTGGGAA-3，B3 (反向內(nèi)弓丨)5，-ACTGCAGTAATTGGGGGACT-3，F(xiàn)IP(F1C+F2，正向外引)GTTCTGTGTACCCGTGGTGGG-TTTCTTTAGCCGTGCTGGTTBIP(B1C+B2，反向外引)TGCTCAATTACGGCGCAAATGC-GCTTGGCTACGACAAATGTGF2 :5， -TTTCTTTAGCCGTGCTGGTT-3，F(xiàn)lC :5’ -GTTCTGTGTACCCGTGGTGGG-3’B2 :5’ -GCTTGGCTACGACAAATGTG-3’BlC :5，-TGCTCAATTACGGCGCAAATGC-3，RNA 的提取病毒樣品RNA 的抽提使用 High Pure viral RNA kit (Roche，Germany)，步驟按其操作說(shuō)明書進(jìn)行，病毒細(xì)胞培養(yǎng)物和皰疹液按上述方法直接提?。患S便樣品、肛拭子和咽喉拭子需經(jīng)過(guò)預(yù)處理，在抽提前需加Hank’ Balanced Salt Solution，其中，0. Ig糞便樣品 (100 μ 1液態(tài))加Iml Hank，s液，然后將懸液8000rpm離心5min,取200 μ 1上清液進(jìn)行 RNA 抽提，用 50μ1 Elution Buffer 洗脫，于一 80°C保存。
CA16RT-LAMP擴(kuò)增方法的津立1、CA16RT-LAMP 反應(yīng)體系以待檢樣品RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。CA16RT-LAMP 反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)柯薩奇病毒A16型的RT-LAMP引物組，其特征在于，包括四條引物，所述四條引物的核苷酸序列為F3 :AGGAGACAGCCATTGGGAA ；B3 :ACTGCAGTAATTGGGGGACT ；FIP :GTTCTGTGTACCCGTGGTGGG-TTTCTTTAGCCGTGCTGGTT ；BIP :TGCTCAATTACGGCGCAAATGC-GCTTGGCTACGACAAATGTG。
2.—種柯薩奇病毒A16型的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的 RT-LAMP引物組。
3.一種柯薩奇病毒A16型的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括含有權(quán)利要求1 所述RT-LAMP引物組的RT-LAMP反應(yīng)液，23 μ 1所述RT-LAMP反應(yīng)液的配置為10 Xbuffer 2. 5 μ l,25mM MgCl2 6 μ 1, IOmM each dNTPs 3. 5μ1，5Μ Betaine4 μ 1，5U/μ 1 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0· 5μ 1，8υ/μ 1 Bst DNA polymerase 1 μ 1, EDPC Η202· 5 μ 1，40 μ M 所述 FIP 1 μ 1, 40 μ M 所述 BIP 1μ1，10μΜΚ $Ρ3 0· 5 μ 1，10 μ M 所述 Β3 0·5μ1。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括10000XSTOR Green I染料。
5.如權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的檢測(cè)反應(yīng)條件是 63°C恒溫反應(yīng) 60min，80°C反應(yīng) 5min。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種柯薩奇病毒A16型RT-LAMP核酸檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括含四條RT-LAMP引物的RT-LAMP反應(yīng)液，進(jìn)一步還可包括10000X SYBR Green I染料。具有特異性好、靈敏度高、操作方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果易于判斷、成本低等特點(diǎn)，能較好滿足目前對(duì)手足口病現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的迫切需要，可用于疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、醫(yī)院、托幼機(jī)構(gòu)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，易于在基層單位大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102373293SQ201010253848
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者何雅青, 宗文萍, 胡貴方 申請(qǐng)人:何雅青, 宗文萍, 胡貴方