mol/L~1. 2mol/ 1^、邸了4 0.Imol/L~1.Omol/L。
[0018] 優(yōu)選的，上述檢測試劑盒，其中，所述RT-PCR增強(qiáng)劑為Μη(OAc)2,其濃度為 lOOmmol/L~500mmol/L。 陽019] 優(yōu)選的，上述檢測試劑盒，其中，所述PCR反應(yīng)液包括5XPCR反應(yīng)緩沖液， 0. 2mmol/L脫氧核糖核巧Ξ憐酸，?υ/μ1~抓/μ1TthDNA聚合酶，?υ/μ1~抓/μ1Η-化qDNA聚合酶，0. 2ymol/L~0. 4ymol/L用于祀多核巧酸擴(kuò)增的上游引物W及下游引 物，0. 2μmol/L~0. 4μmol/L用于祀多核巧酸檢測的探針，0. 1μmol/L~0. 2μmol/L用 于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的上游引物化及下游引物，〇.〇5ymol/L~0.2ymol/L用于檢測內(nèi)標(biāo)的探針。
[0020] 優(yōu)選的，上述檢測試劑盒，其中，所述所述用于祀多核巧酸擴(kuò)增的上下游引物及用 于祀多核巧酸檢測的探針，其堿基對序列分別為：
[0021] 上游引物：5'-AGAGCTATTAGCAGTGCTACAAATG-3' ；
[0022] 下游引物：5'-TCCAGTCTCTAATCGGTGTGAAC-3' ；
[0023]探針 1 :5'FAM-TGAATCCGCAGCCAACACCACTCC-B冊 13'。
[0024] 優(yōu)選的，上述檢測試劑盒，其中，所述用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的上游引物W及下游引物W及 用于檢測內(nèi)標(biāo)的探針，其堿基對序列分別為： 陽0巧]上游引物：5'-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3' ；
[0026] 下游引物：5'-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3' ；
[0027]探針：5' 肥X-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-B冊 13'。 陽02引優(yōu)選的，上述檢測試劑盒，其中，所述CA10陽性對照品為CA10病毒基因體外轉(zhuǎn)錄RNA，其濃度為 1. 00 ~5. 00E+05copies/ml。
[0029] 優(yōu)選的，上述檢測試劑盒，其中，所述CA10陰性對照品為經(jīng)過滅菌處理的生理鹽 水。
[0030] 本發(fā)明實(shí)施例中提供了使用上述的柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒 檢測樣本中CA10-RNA的方法，包括如下步驟： 陽〇3U (1)試劑準(zhǔn)備；
[0032] 按照提取試劑1200μ1~1ml/人份，CA10-內(nèi)標(biāo)1μ1/人份的比例，取相應(yīng)量的RNA提取溶液I及CA10-內(nèi)標(biāo)，充分混勻得提取溶液1-mix，瞬時(shí)離屯、后備用； 陽03引根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，按照PCR反應(yīng)液49μ1/人份，RT-PCR增強(qiáng)劑1μ1/人份的比例，取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及RT-PCR增強(qiáng)劑，充分混勻，得PCR-mix， 瞬時(shí)離屯、后備用；
[0034] 似RNA提?。捍胖榉ㄌ崛A10-RNA;
[0035] SOI裂解病毒：：準(zhǔn)備無核酸酶的1. 5血離屯、管，每管加入200μ1~1mlRNA提 取溶液1-mix，然后加入100μ1~1ml待測樣本，蓋上管蓋，震蕩混勻，瞬時(shí)離屯、后備用；
[0036] S02磁珠吸附核酸：在步驟SO1瞬時(shí)離屯、后備用的溶液中加入50μ1~400μ1 RNA提取溶液II，震蕩混勻，室溫靜置10~30分鐘；
[0037] S03去除雜質(zhì)：靜止結(jié)束后瞬時(shí)離屯、后，將離屯、管置于磁珠分離器上，2~5分鐘后 緩慢將溶液吸出棄用，保留磁珠備用； 陽03引 S04洗涂：在備用的磁珠內(nèi)加入400μ1~1mlRNA提取溶液III和100μ1~ 500μ1RNA提取溶液IV，震蕩混勻，瞬時(shí)離屯、后將離屯、管再次置于分離器上；
[0039] S05靜止2~5分鐘后，上清液分為兩層，將吸頭插入離屯、管底部，從底部開始緩慢 將液體完全吸出丟棄，靜置1~3分鐘后，將管底殘余液體完全吸出丟棄，磁珠保留備用；
[0040] S06在上述保留備用的磁珠中加入10μ1~100μ1RNA洗脫液，將離屯、管壁上磁 珠洗脫到管底，吸打混勻，室溫靜置5~30分鐘后將離屯、管再次置于分離器上2~5分鐘， 然后將洗脫下來的RNA吸至新的1. 5ml滅菌離屯、管中；
[00川 S07根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，每個0. 2mLPCR反應(yīng)管加入45μ1 PCR-mix，并吸取步驟S06的新的滅菌離屯、管中已處理的樣本RNA、陰性對照、陽性對照各 5μ1加入PCR-mix中，蓋好管蓋，形成待測樣品；
[0042] (3)巧光PCR反應(yīng)和結(jié)果分析：
[0043] 選擇FAM通道巧巧OTtere:FAM,如encher:None)檢測CA10 ;選擇肥X或VIC通道 巧巧orter:VIC,如encher:None)檢測內(nèi)標(biāo)；利用儀器自帶的軟件進(jìn)行自動分析或者手動 調(diào)芐基線的開始值、結(jié)束值W及闊值線值進(jìn)行分析，然后記錄樣本Ct值結(jié)果，根據(jù)各樣本 Ct值大小，判斷檢測結(jié)果。
[0044] 本發(fā)明的磁珠法提取純化CA10RNA，待檢樣本的CA10檢測和內(nèi)標(biāo)檢測的結(jié)果均有 Ct值（即都為陽性），體系中沒有PCR抑制物的存在；而目前常用的酪-氯仿法和柱提取法 中，均存在低濃度低濃度咽拭子樣本的CA10檢測無Ct值扣ndet)的情況（即為陰性），而 此時(shí)內(nèi)標(biāo)也檢測為陰性扣ndet)，由于3種提取方法使用的是同一種PCR擴(kuò)增體系，由此說 明，酪-氯仿法和柱提取法提取的RNA中有PCR抑制物存在，可能導(dǎo)致CA10陽性樣本檢測 為陰性，即為假陰性，提示應(yīng)該進(jìn)行重新檢測或者改進(jìn)方法進(jìn)行檢測。因此，本試劑盒所采 用的磁珠法提取核酸，能夠有效去除復(fù)雜樣本中的PCR抑制物，適合于血漿、血清，拭子樣 本的RNA提取和PCR檢測。同時(shí)也說明，體系中加入內(nèi)標(biāo)，可W有效預(yù)防假陰性結(jié)果。 W45]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0046] (1)本發(fā)明對CA10病毒各型別基因組序列進(jìn)行同源性比較，找出保守的區(qū)段，設(shè) 計(jì)了特異性引物和特異性巧光探針，經(jīng)引物探針篩選，獲得了檢出率、特異性較好的引物探 針，僅能檢測出CAIO-RNA，而不能檢測出其他病原體RNA，本發(fā)明試劑盒具有良好的特異 性；
[0047] (2)對CA10-RNA的提取方法進(jìn)行了比較和優(yōu)化，選擇了吸附效果好、易于純化的 磁珠法提取RNA，可W獲得高純度和高得率的核酸，大大提高了檢測靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定 性，檢測靈敏度可達(dá)50copie/ml，檢測范圍為5. 00E+01~5. 00E+09copies/ml;
[0048] (3)反應(yīng)體系中增加了內(nèi)標(biāo)，利用內(nèi)標(biāo)監(jiān)控PCR反應(yīng)過程，監(jiān)控反應(yīng)體系是否有 效，防止樣本因抑制而檢測為假陰性，巧光PCR擴(kuò)增結(jié)束后，經(jīng)儀器自帶軟件自動分析樣本 的Ct值，可為靈敏、早期診斷柯薩奇病CA10型感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
【附圖說明】 W例為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所 需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施 例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可W根據(jù)運(yùn)些附圖獲 得其他的附圖。
[0050] 圖1.本發(fā)明實(shí)施例提供的柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒中特異 定量參考品A(5. 00E+06copies/ml)、B(5. 00E+05copies/ml)、C(5. 00E+04copies/ml)和 D(5. 00E+03copies/ml)的擴(kuò)增曲線圖；
[0051] 圖2.本發(fā)明實(shí)施例提供的柯薩奇病毒CAIO型巧光定量PCR檢測試劑盒中定量分 析濃度-Ct值的線性關(guān)系圖；
[0052]圖3.本發(fā)明實(shí)施例提供的柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒的特異性 檢測曲線圖；
[0053] 圖4.本發(fā)明實(shí)施例提供的柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒的內(nèi)標(biāo)擴(kuò) 增曲線圖；
[0054]圖5.本發(fā)明實(shí)施例提供的柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒的標(biāo)本稀 釋擴(kuò)增曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于 本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0056] 實(shí)施例1
[0057] 本實(shí)施例提供一種柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒，其包括W下各組 分：RNA提取溶液、RNA洗脫液、RT-PCR增強(qiáng)