一步快速檢測甜瓜多種病毒的試劑盒及其快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種快速檢測甜瓜病毒病的試劑盒及其快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜瓜病毒病一直是限制甜瓜生產(chǎn)的主要因素，目前國內(nèi)外沒有一種有效的方法可 W防治甜瓜病毒病。病毒病在瓜產(chǎn)區(qū)復(fù)合感病的情況比較普遍。目前檢測甜瓜病毒病病毒 種類的方法有雙抗體夾屯、法（DAS-ELISA)和硝酸纖維素膜法（NCM-ELISA)法、血清抗原檢 測等方法；但運些方法操作復(fù)雜、費用高、需要時間較長。
[0003] 多重RT-PCR技術(shù)可同時檢測幾種致病菌，大大縮短了檢驗時間和流程，節(jié)省了供 試材料，尤其適合一些難分離，難獲取的種質(zhì)材料或病源分離物的快速檢測。但是，由于多 重RT-PCR體系中存在多對引物，因此各引物對必須保持高度的特異性（W避免非特異性的 擴(kuò)增）；而且各對引物所擴(kuò)增出的目的片段的大小差異性要大，可W通過電泳或其他方法 區(qū)分（避免條帶重疊或誤判）；還要避免所用引物間的相互作用；各引物對須保持相對一致 的擴(kuò)增效率等要求。并且，不同長度的模板核酸片段、不同引物對所要求的退火溫度也不一 樣。加之其他限制因素，多重RT-PCR技術(shù)難W在甜瓜病毒病的實際檢測中有優(yōu)異的表現(xiàn)， 可同時檢測的甜瓜病毒病種類極少。引物對越多擴(kuò)增難度就越大，因此，目前所知植物病毒 多重RT-PCR檢測技術(shù)最多只能一次同時檢測5種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有甜瓜病毒病多重RT-PCR檢測技術(shù)可同時檢測的甜瓜病毒 病種類少的問題，而提供的一種一步快速檢測甜瓜多種病毒的試劑盒及其快速檢測方法。 陽0化]一步快速檢測甜瓜多種病毒的試劑盒中含有7對RT-PCR引物；
[0006] 用于擴(kuò)增西瓜花葉病毒病的引物對：上游引物WMV1F的核巧酸 序列為5' -GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3'，下游引物WMV1R的核巧酸序列為 5' -GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3'; W07] 用于擴(kuò)增黃瓜花葉病毒病的引物對：上游引物CMV1F的核巧酸序列為 5' -GACAGTTGGGAATCGGA-3'，下游引物CMV1R的核巧酸序列為 5' -AACAGGGAGCAAGAGGA-3' ； W08] 用于擴(kuò)增小西葫蘆黃花葉病毒病的引物對：上游引物ZYMV-F的核巧 酸序列為5' -CACGAAGGACAAGGATGTGA-3'，下游引物ZYMV-R的核巧酸序列為 5> -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3> ;
[0009] 用于擴(kuò)增南瓜花葉病毒的引物對：上游引物SqMV-1-F的核巧酸 序列為5' -GGATGCCTTTGGCTATTGG-3'，下游引物SqMV-1-R的核巧酸序列為 5> -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3> ;
[0010] 用于擴(kuò)增煙草花葉病毒病的引物對：上游引物TMV-F的核巧酸序列為 5' -TTTTGGAGGAATGAGTTT-3'，下游引物TMV-R的核巧酸序列為 5' -AGGGAAAAACACTATGC-3' ； W11] 用于擴(kuò)增番木瓜環(huán)斑病毒的引物對：上游引物PRSV-F的核巧酸 序列為5' -CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3'，下游引物PRSV-R的核巧酸序列為 5' -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3'; 陽01引用于擴(kuò)增甜瓜黃斑病毒的引物對：上游引物MYSVF的核巧酸序 列為5' -TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3'，下游引物MYSVR的核巧酸序列為 5' -GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3'。
[0013] 用上述一步快速檢測甜瓜多種病毒的試劑盒快速檢測的方法：
[0014] 一、提取被感染病毒葉片的總RNA; 陽〇1引二、反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
[0016] Ξ、用試劑盒中的7對RT-PCR引物進(jìn)行多重RT-PCR，即可確定葉片是否感染了西 瓜花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病、小西葫蘆黃花葉病毒病、南瓜花葉病毒、煙草花葉病毒病、 番木瓜環(huán)斑病毒和甜瓜黃斑病毒，W及病毒類型； 陽017] 步驟Ξ中7對RT-PCR引物為用于擴(kuò)增西瓜花葉病毒病的引物對：上游引物WMV1 F的核巧酸序列為5' -GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3'，下游引物WMV1R的核巧酸序列為 5' -GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3';
[001引用于擴(kuò)增黃瓜花葉病毒病的引物對：上游引物CMV1F的核巧酸序列為 5' -GACAGTTGGGAATCGGA-3'，下游引物CMV1R的核巧酸序列為 5' -AACAGGGAGCAAGAGGA-3' ；
[0019] 用于擴(kuò)增小西葫蘆黃花葉病毒病的引物對：上游引物ZYMV-F的核巧 酸序列為5' -CACGAAGGACAAGGATGTGA-3'，下游引物ZYMV-R的核巧酸序列為 5> -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3> ;
[0020] 用于擴(kuò)增南瓜花葉病毒的引物對：上游引物SqMV-1-F的核巧酸 序列為5' -GGATGCCTTTGGCTATTGG-3'，下游引物SqMV-1-R的核巧酸序列為 5> -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3>; W21] 用于擴(kuò)增煙草花葉病毒病的引物對：上游引物TMV-F的核巧酸序列為 5' -TTTTGGAGGAATGAGTTT-3'，下游引物TMV-R的核巧酸序列為 5' -AGGGAAAAACACTATGC-3' ； 陽02引用于擴(kuò)增番木瓜環(huán)斑病毒的引物對：上游引物PRSV-F的核巧酸 序列為5' -CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3'，下游引物PRSV-R的核巧酸序列為 5' -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3';
[002引用于擴(kuò)增甜瓜黃斑病毒的引物對：上游引物MYSVF的核巧酸序 列為5' -TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3'，下游引物MYSVR的核巧酸序列為 5' -GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3' ；
[0024] 步驟Ξ多重RT-PCR擴(kuò)增體系為25化，包括2μL的模板cDNA、2μL的引物對、濃 度為1.Ommol/L的dNTPs、酶活為1U的TaqDNA聚合酶和濃度為2.Ommol/L的Mg2+; 陽0巧]步驟Ξ多重RT-PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s、50°C退火復(fù)性353、72°(：延伸6〇3,35個循環(huán)；72°(：延伸7111111。
[0026] 西瓜花葉病毒?。╓MV)、黃瓜花葉病毒病化州mbermosaicviroicKCMV)、小西葫 蘆黃花葉病毒病狂YMV)、南瓜花葉病毒（SqMV)、煙草花葉病毒病燈MV)、番木瓜環(huán)斑病毒 (PRSV)和甜瓜黃斑病毒（MYSV)是甜瓜病毒病中常見的種類，而且在我國感染、發(fā)病率高。
[0027] 本發(fā)明一步快速檢測甜瓜多種病毒的試劑盒針對西瓜花葉病毒病（WMV)、黃瓜花 葉病毒病化州mbermosaicviroid(CMV)、小西葫蘆黃花葉病毒病狂YMV)、南瓜花葉病毒 (SqMV)、煙草花葉病毒病燈MV)、番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV)和甜瓜黃斑病毒（MYSV)設(shè)計了 7 對特異性引物。擴(kuò)增西瓜花葉病毒病的引物對所擴(kuò)增出的核巧酸片段長度為1149bp，擴(kuò) 增黃瓜花葉病毒病的引物對所擴(kuò)增出的核巧酸片段長度為98化P，擴(kuò)增小西葫蘆黃花葉病 毒病的引物對所擴(kuò)增出的核巧酸片段長度為789bp，擴(kuò)增南瓜花葉病毒的引物對所擴(kuò)增出 的核巧酸片段長度為604bp，擴(kuò)增煙草花葉病毒病的引物對所擴(kuò)增出的核巧酸片段長度為 39化P，擴(kuò)增番木瓜環(huán)斑病毒的引物對所擴(kuò)增出的核巧酸片段長度為3(K)bp，擴(kuò)增甜瓜黃斑 病毒的引物對所擴(kuò)增出的核巧酸片段長度為25化P。7對特異性引物擴(kuò)增出的核巧酸片段 長度迴異，長度相近片段的最小差異為50bp，在凝膠電泳的過程中可W清楚地區(qū)分?jǐn)U增到 的核巧酸條帶。
[0028] 本發(fā)明通過一次PCR可W同時檢測出多達(dá)7種的甜瓜病毒病，可在田間采集、鑒定 甜瓜病毒病種類，具有鑒定過程簡單、步驟少、設(shè)備要求低、費用少、時間短和精確性高等優(yōu) 點。
[0029] 本發(fā)明檢測方法在甜瓜產(chǎn)區(qū)復(fù)合感染病毒的檢測中及甜瓜病毒病的發(fā)生規(guī)律研 究中，具有節(jié)省時間、降低成本、靈明度高，簡便與效率高的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0030] 圖1是實施例1檢測結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道中A標(biāo)樣為健康植株，圖中泳道CK 中標(biāo)樣為陰性對照，圖中泳道1~4中標(biāo)樣均為被7種甜瓜病毒病侵染的植株。
[0031] 圖2是實施例2檢測結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道中A標(biāo)樣為健康植株，圖中泳道 1~7中標(biāo)樣依次為被西瓜花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病、小西葫蘆黃花葉病毒病、南瓜花 葉病毒、煙草花葉病毒病、番木瓜環(huán)斑病毒和甜瓜黃斑病毒侵染的植株。
[0032] 圖3是實施例3檢測結(jié)果凝膠電泳圖。
[0033] 圖4是實施例4檢測結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道1~7中標(biāo)樣多重RT-PCR擴(kuò)增體 系中模板cDNA的體積依此為 0. 5μ^0. 75μ^1μ^Ι. 25μ^1. 5μ^1. 75μΙ和 2yL。
[0034] 圖5是實施例5檢測結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道1~7中標(biāo)樣多重RT-PCR擴(kuò) 增體系中Mg2+的濃度依此為 1. 0mmol/L、l. 5mmol/L、2. 0mmol/L、2. 5mmol/L、3.Ommol/L、 3.5mmol/L和 4.Ommol/L。
[0035] 圖6是實施例6檢測結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道1~7中標(biāo)樣多重RT-PCR擴(kuò) 增體系中dNTP的濃度依此為 0. 2mmol/X、0. 4mmo1 /1,.0. 6mmol/X、0.8mmol/1,、1.Ommol/L 1.2mmol/L和 1. 4mmol/L。
[0036] 圖7是實施例7檢測結(jié)果凝膠電泳圖，圖中泳道1~7中用于擴(kuò)增西瓜花葉 病毒病、黃瓜花葉病毒病、小西