離子對雙水相萃取分離吡咯喹啉醌的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種離子對雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方法，屬于生物化工領域。
【背景技術】
[0002] 化咯哇嘟釀（Pyrroloquinolinequinine,PQ曲是一種水溶性釀類化合物，是葡萄 糖脫氨酶和乙醇脫氨酶的輔酶，被認為是新的B族維生素（化化re2003 ;422:832)。PQQ分 子量為330,最早是在微生物中發(fā)現，隨后研究表明其也存在于動植物體內，結構式如下式 所示：
[0003]
[0004] 目前已證明PQQ具有重要的生理功能，比如維持皮膚健康、刺激神經生長因子、增 強免疫功能、促進細胞生長、抗氧化、清除自由基、增強細菌對極端環(huán)境條件的耐受性W及 參與細胞信號傳導等。在醫(yī)藥領域，PQQ具有防治肝損傷、保護神經組織、刺激能量生成、強 化免疫等生理功能。因此，可W用于治療帕金森綜合癥、老年癡呆、屯、臟病、肝硬化等。在畜 禽養(yǎng)殖業(yè)中，PQQ作為一種新型類維生素物質，可促進機體生長、提高繁殖、抗氧化、抗應激 和增強免疫，比如在飼料中添加適量PQQ可W在一定程度上提高蛋雞產蛋率和雞蛋品質， 并能顯著提高蛋雞的抗氧化能力。由于其獨特的理化性質和多樣的生理功能，可用于食品、 醫(yī)藥、農業(yè)、工業(yè)等領域，具有廣泛的開發(fā)應用前景。 陽0化]在PQQ生產中，從混合物中分離純化PQQ，獲得高純度產品是至關重要的步驟。但 是，PQQ水溶性強、反應液中濃度低，普通萃取方法萃取效率低、選擇性差，嚴重制約著PQQ 的大規(guī)模生產應用。因此，尋找一種簡便高效的分離純化方法迫在眉睫。
[0006] 雙水相萃取體系是一種性質溫和的分離體系，可適用于生物化工、金屬及絡合物 的分離、中草藥中有效成分的提取及有機物的分離等領域。該體系具有體系簡單、原料價 廉、低毒、無乳化現象等優(yōu)點，是一種具有潛在工業(yè)化應用價值的分離體系。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種離子對雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方 法，該方法能夠簡單、高效分離得到化咯哇嘟釀。
[0008] 為了實現上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：離子對雙水相萃取分離化咯哇 嘟釀的方法，包括W下步驟：
[0009] (1)制備：利用化咯哇嘟釀生產菌制備含有化咯哇嘟釀的混合液；
[0010] (2)萃?。翰捎秒x子對雙水相萃取體系對含有化咯哇嘟釀的混合液進行萃取，分 離上層，對下層進行重復萃取，合并分離的上層，得到富含化咯哇嘟釀的有機層；其中，萃取 體系由離子對試劑和憐酸氨鋼緩沖液（PB)組成，離子對試劑和憐酸氨鋼緩沖液的體積比 為 3_5:1_2 ;
[0011] (3)分離：將富含化咯哇嘟釀的有機層上陰離子交換樹脂，依次用雙蒸水、稀酸沖 洗，收集稀酸部位，冷凍干燥，得到化咯哇嘟釀粗品；
[0012] (4)純化：將化咯哇嘟釀粗品用超純水溶解，抑調至3~4,加入乙醇，攬拌后靜 置，得到化咯哇嘟釀。
[0013] 所述含有化咯哇嘟釀的混合液為化咯哇嘟釀生產菌發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液。
[0014] 步驟（2)萃取時萃取體系和含有化咯哇嘟釀的混合液的體積比為4-7:2-4。
[0015] 所述離子對試劑為四下基氨氧化錠溶液，濃度為0.5-1. 5mol/L。
[0016] 所述憐酸氨鋼緩沖液濃度為0. 1-0. 9mol/L，抑值為4. 5-6. 5。
[0017] 所述陰離子交換樹脂為WA30型弱陰離子交換樹脂。
[0018] 所述稀酸為體積分數0.5-1 %的稀鹽酸。
[0019] 步驟（4)中化咯哇嘟釀粗品用超純水溶解至終濃度為9-12邑/1，超純水與乙醇的 體積比為3-5:1。
[0020] 步驟（4)中調節(jié)抑所用試劑為鹽酸。
[0021]步驟（4)中攬拌溫度為20-25°C，攬拌時間為5-化，靜置時間為12-2地。
[0022] 本發(fā)明離子對雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方法的原理如下所示：
[0024] 本發(fā)明有益效果：
[00巧]1、雙水相體系是一類新型萃取分離體系，它是由水溶性有機小分子和一種鹽的水 溶液在一定濃度下混合自發(fā)形成的兩相體系。本發(fā)明根據PQQ結構的特點，即PQQ的結構 中包含3個簇基，顯示酸性，利用離子對雙水相體系對其進行分離純化。
[00%] 2、本發(fā)明采用四下基氨氧化錠作為離子對試劑，與PQQ結合在一起，使PQQ選擇性 的分配在有機相中，而其他水溶性雜質分配到水相中，從而達到高效性、高選擇性地分離純 化PQQ。
[0027] 3、本發(fā)明通過優(yōu)化萃取體系與含有化咯哇嘟釀的混合液的比例，和離子對試劑與 憐酸氨鋼緩沖液的比例，最大程度上提高了分離純化得到的化咯哇嘟釀的純度和化咯哇 嘟釀的回收率。實驗表明，本發(fā)明分離得到的化咯哇嘟釀純度可達99%W上，回收率可達 85%W上。
[0028] 4、本發(fā)明的方法工藝操作簡單、成本低廉、便于大規(guī)模工業(yè)化生產，對促進PQQ的 產業(yè)化發(fā)展具有重要意義。
【附圖說明】
[0029] W下結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0030] 圖1為紫外光譜分析結果，其中，A為PQQ樣品，B為本發(fā)明結晶產物；
[0031] 圖2為本發(fā)明結晶產物的質譜分析結果；
[0032] 圖3為本發(fā)明萃取液中PQQ的HPLC分析結果；
[0033] 圖4為本發(fā)明結晶產物的HPLC分析結果。
【具體實施方式】
[0034] W下結合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0035] 本發(fā)明所用的培養(yǎng)基配制方法如下：
[0036] 發(fā)酵培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有40g山梨醇、20g酵母提取物、5g(NH4)2S〇4、2g 皿2口〇4、5邑M拆〇4 ? &0。
[0037] 富集培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有SOg山梨醇、40g酵母提取物、10g(NH4)2S〇4、4g 皿2口〇4、1〇邑M拆〇4 ? &0。 陽0測實施例1
[0039] 本實施例離子對雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方法，包括W下步驟：
[0040] (1)制備：將氧化葡萄糖酸桿菌按照5%的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C 條件下震蕩培養(yǎng)3d，得到種子液；然后將種子液按照10%的接種量，接種于富集培養(yǎng)基，在 28°C條件下震蕩培養(yǎng)5山培養(yǎng)液5°C、90(K)r/min離屯、15min，收集上清液，得到含有化咯哇 嘟釀的發(fā)酵液；
[0041] (2)萃?。翰捎秒x子對雙水相萃取體系對含有化咯哇嘟釀的發(fā)酵液進行萃取，萃 取體系和含有化咯哇嘟釀的發(fā)酵液的體積比為4:2,分離上層，對下層進行重復萃取3次， 合并分離的上層，得到富含化咯哇嘟釀的有機層；其中，萃取體系由0. 5mol/L的四下基氨 氧化錠溶液和0.Imol/L、抑值4. 5的憐酸氨鋼緩沖液按照體積比3:1的比例混合而成；
[0042] (3)分離：將富含化咯哇嘟釀的有機層上WA30型弱陰離子交換樹脂，依次用雙蒸 水、體積分數I%稀鹽酸沖洗，收集稀鹽酸部位，冷凍干燥，得到化咯哇嘟釀粗品；
[0043] (4)純化：將化咯哇嘟釀粗品用超純水溶解，至終濃度為llg/L，用鹽酸調節(jié)抑至 3, 加入乙醇，在20°C條件下攬拌化后，靜置12h，得到化咯哇嘟釀的晶體；其中，超純水與乙 醇的體積比為5:1。 W44] 實施例2
[0045] 本實施例離子對雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方法，包括W下步驟：
[0046] (1)制備：將氧化葡萄糖酸桿菌按照5%的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C 條件下震蕩培養(yǎng)3d，得到種子液；然后將種子液按照10%的接種量，接種于富集培養(yǎng)基，在 28°C條件下震蕩培養(yǎng)5山培養(yǎng)液5°C、90(K)r/min離屯、15min，收集上清液，得到含有化咯哇 嘟釀的發(fā)酵液；
[0047] (2)萃取：采用離子對雙水相萃取體系對含有化咯哇嘟釀的發(fā)酵液進行萃取，萃 取體系和含有化咯哇嘟釀的發(fā)酵液的體積比為5: