一種濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種濃縮發(fā)酵液中蛋白的方法，特別涉及濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法。屬生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]酵母是一個優(yōu)異的蛋白表達(dá)宿主，被廣泛用于實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)。酵母表達(dá)異源蛋白的時候可以采取胞外和胞內(nèi)兩種方式，由于胞外表達(dá)蛋白不需要破碎酵母細(xì)胞，而被廣泛使用。
[0003]采用胞外表達(dá)的方式，后期處理的第一步即需要濃縮目標(biāo)蛋白?，F(xiàn)在常使用到的方法有:硫酸銨飽和沉淀、超濾杯濃縮和其他方法。其中，硫酸銨飽和沉淀方法所需設(shè)備簡單，便于實(shí)際操作，使用最多，但其缺點(diǎn)是:加入過多硫酸銨以后溶液體積顯著增加，所需硫酸銨的量很大，增加處理成本；沉淀得到的樣品需要除鹽，耗時耗力。超濾杯濃縮的方法，濃縮效率高，但是其設(shè)備比較昂貴，加之胞外表達(dá)的發(fā)酵液含有培養(yǎng)基成份和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，容易堵塞超濾膜，這些缺點(diǎn)也影響了其廣泛的使用。
[0004]因此亟需一種成本低、濃縮效率高、操作簡單的濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對硫酸銨飽和沉淀和超濾杯濃縮蛋白存在的不足之處，本發(fā)明提供了一種濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法，具體是利用疏水重力柱濃縮發(fā)酵液中的目標(biāo)蛋白。
[0006]本發(fā)明所述的濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法包括如下步驟:
[0007](1)重力柱填充:將與重力柱相適應(yīng)的濾膜裝填在重力柱底部，加入疏水介質(zhì)高載量苯基疏水色譜柱料，并用超純水洗脫介質(zhì)中的乙醇；
[0008](2)重力柱平衡:用1.5-3倍柱體積的硫酸銨平衡緩沖溶液對重力柱進(jìn)行平衡；
[0009](3)發(fā)酵液掛柱:向發(fā)酵液上清加入硫酸銨固體或者飽和硫酸銨溶液，使發(fā)酵液上清中的硫酸銨終濃度為1-1.7M，將柱體積6-8倍的發(fā)酵液上清溶液加入平衡后的重力柱中，至含有硫酸銨的發(fā)酵液自行流出重力柱；
[0010](4)雜質(zhì)蛋白洗脫:待發(fā)酵液掛柱后，用2-3倍柱體積硫酸銨平衡緩沖溶液洗脫掛柱發(fā)酵液中的雜質(zhì)蛋白，直至洗脫液中檢測不到雜質(zhì)蛋白；
[0011](5)目標(biāo)蛋白收集:雜質(zhì)蛋白洗脫后，加入4倍柱體積的洗脫液對目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫，洗脫過程中，檢測洗脫液目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性，并收集具有目標(biāo)蛋白活性的溶液。
[0012]上述高載量苯基疏水色譜柱料的介質(zhì)大小為90 μ m，設(shè)計(jì)流速為200?400cm/h。
[0013]步驟(2)和(4)中所述硫酸銨平衡緩沖溶為pH 7.0-8.0，1-1.7M硫酸銨溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH)，且硫酸銨濃度和步驟(3)所述的發(fā)酵液上清中的硫酸銨溶液的pH值、濃度保持一致。硫酸錢的濃度越大，蛋白的吸附能力越強(qiáng)，減小硫酸錢的濃度能節(jié)約成本。
[0014]步驟(5)中所述洗脫液為無鹽或者低鹽的溶液，常用的有:pH為7.5-8.5、成分為25mM的Tris-HCl溶液和pH為5.7-7.6、成分為20mM的磷酸鹽緩沖溶液等。
[0015]本發(fā)明所述的濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比有以下優(yōu)點(diǎn):
[0016]1)本發(fā)明方法可以根據(jù)樣品體積，裝填不同體積的重力柱，既可以用于小量分析，也可用于實(shí)驗(yàn)室小量制備，還能夠放大重力柱體積，用于工業(yè)生產(chǎn)。
[0017]2)本發(fā)明方法具有目標(biāo)蛋白濃縮效率高、純度顯著提高，可用于實(shí)驗(yàn)室普通超濾管濃縮進(jìn)行進(jìn)一步的純化，而不會發(fā)生堵塞的問題(發(fā)酵液直接用超濾管濃縮會堵塞超濾管，并且在超濾管的膜表面形成一層黃色的物質(zhì))。
[0018]3)本發(fā)明方法具有成本低廉的特點(diǎn)，是一種從酵母發(fā)酵液中濃縮目標(biāo)蛋白質(zhì)的簡便方法。
【附圖說明】
[0019]圖1是lac3b純化重力柱洗脫階段不同洗脫體積的漆酶活性。
[0020]圖2是galac純化重力柱洗脫階段不同洗脫體積的漆酶活性。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0022]實(shí)施例1
[0023]畢赤酵母中采用胞外表達(dá)的方式表達(dá)了云芝(Trametes versicolor)的lac3b漆酶。表達(dá)在5L的發(fā)酵罐中進(jìn)行，發(fā)酵最后獲得了 3L的發(fā)酵液，通過離心分離去除酵母細(xì)胞，最終得到了 2L的發(fā)酵液上清備用。
[0024]重力柱濃縮發(fā)酵液的lac3b蛋白步驟如下:
[0025](1)重力柱填充:選取高30cm，直徑6cm重力柱，將濾膜裝填在重力柱的底部避免介質(zhì)外流，加入100ml疏水介質(zhì)phenyl sefinose 6Fast Flow (high sub)(介質(zhì)大小為90 μ m，設(shè)計(jì)流速為200?400cm/h，上海生工生物工程有限公司)。用2倍柱體積的超純水(200ml)洗脫介質(zhì)中的乙醇，流速可以達(dá)到35-40ml/min ；
[0026](2)重力柱平衡:待柱子不再滴水以后，加入1.5倍柱體積(150ml)的pH 7.0、
1.7M硫酸銨平衡緩沖溶液平衡柱子；
[0027](3)發(fā)酵液掛柱:向400ml的發(fā)酵液上清中緩慢加入硫酸銨固體90克，最終得到含有1.7M硫酸銨的發(fā)酵液上清600mL，加入平衡后的重力柱中，一共添加600ml的發(fā)酵液上清(6倍柱體積)，穿過介質(zhì)的流速可以達(dá)到25-30ml/min ；
[0028](4)雜質(zhì)蛋白洗脫:待發(fā)酵液掛柱后，用3倍柱體積(300ml)pH7.0,1.7M硫酸銨的溶液，洗脫掛柱發(fā)酵液中的雜質(zhì)蛋白至洗脫液中檢測不到雜質(zhì)蛋白；
[0029](5)目標(biāo)蛋白收集:雜質(zhì)蛋白洗脫后，加入4倍柱體積(400ml)的25mM、pH 7.5的Tris-HCl洗脫液對目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫，洗脫過程中，檢測洗脫液目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性(見圖1)，并收集130?350ml洗脫溶液(約2倍柱體積)，lac3b蛋白的回收效率達(dá)到了 80%。
[0030]對比例1
[0031]飽和硫酸錢沉淀lac3b蛋白步驟如下:
[0032]取1L發(fā)酵液上清，緩慢的向其中加入固體硫酸銨，一直到硫酸銨不再溶解為止。最后共加入1050g硫酸銨。此時發(fā)酵液體積已經(jīng)由原來的1L增大為2L，溶液的硫酸銨飽和度約為80%。然后將添加轉(zhuǎn)子的發(fā)酵液放置于4°C層析柜中，在磁力攪拌器上攪拌16小時左右。最后取出發(fā)酵液，在12000g，4°C下離心30min，得到的沉淀用ddH20溶解。最后分別測試處理后發(fā)酵液和處理前發(fā)酵液的活性，計(jì)算lac3b蛋白的回收率約為10%。
[0033]綜上所述，用含有100ml疏水介質(zhì)的重力柱在4個小時內(nèi)將1L發(fā)酵液濃縮5倍，最后得到200ml左右的蛋白溶液，lac3b蛋白的回收效率達(dá)到80%，相比飽和硫酸銨沉淀法濃縮lac3b蛋白濃縮效率高，純度顯著提高。
[0034]實(shí)施例2
[0035]首先在釀酒酵母中表達(dá)亞洲棉(Gossypium arboreum)的galac漆酶，最后得到
2.5L發(fā)酵液，通過離心去除釀酒酵母細(xì)胞，得到了 2L的發(fā)酵液上清，用于后續(xù)純化。
[0036]重力柱濃縮發(fā)酵液的galac蛋白步驟與實(shí)施例1相同之處不再贅述，不同之處在于:步驟(2)中加入3倍柱體積(300ml)的1Μ、ρΗ8.0的硫酸銨平衡緩沖溶液平衡柱子；步驟(3)中向600ml的發(fā)酵液上清中緩慢加入200ml的常溫下的飽和硫酸銨溶液，最終得到含有1M硫酸銨的發(fā)酵液上清800ml，添加800ml的發(fā)酵液上清溶液(8倍柱體積)掛柱；步驟(4)中用2倍柱體積(200ml) 1Μ、ρΗ8.0的硫酸銨溶液，洗脫掛柱發(fā)酵液中的雜質(zhì)蛋白；步驟(5)中采用4倍柱體積20mM、pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液為洗脫液，洗脫過程中測量不同洗脫體積的漆酶活性，結(jié)果見圖2，收集了 100-400ml的洗脫溶液(3倍柱體積)。最終galac蛋白的回收效率達(dá)到了 84%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)重力柱填充:將濾膜裝填在重力柱底部，加入疏水介質(zhì)高載量苯基疏水色譜柱料，用超純水洗脫介質(zhì)中的乙醇； (2)重力柱平衡:用1.5-3倍柱體積的硫酸銨平衡緩沖溶液對重力柱進(jìn)行平衡； (3)發(fā)酵液掛柱:向發(fā)酵液上清加入硫酸銨固體或者飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨終濃度達(dá)到1-1.7M后，加入6-8倍柱體積的發(fā)酵液到平衡后的重力柱中，至含有硫酸銨的發(fā)酵液自行流出重力柱； (4)雜質(zhì)蛋白洗脫:待發(fā)酵液掛柱后，用2-3倍柱體積硫酸銨平衡緩沖溶液洗脫掛柱發(fā)酵液中的雜質(zhì)蛋白，直至洗脫液中檢測不到雜質(zhì)蛋白； (5)目標(biāo)蛋白收集:雜質(zhì)蛋白洗脫后，加入4倍柱體積的洗脫液對目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫，洗脫過程中，檢測洗脫液目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性，并收集具有目標(biāo)蛋白活性的溶液。2.如權(quán)利要求1所述的一種濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法，其特征在于，步驟(1)中所述高載量苯基疏水色譜柱料的介質(zhì)大小為90 μ m，設(shè)計(jì)流速為200?400cm/h。3.如權(quán)利要求1所述的一種濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法，其特征在于，步驟(2)和步驟(4)中所述硫酸銨平衡緩沖溶pH為7.0-8.0，成分為1-1.7M硫酸銨溶液，且硫酸銨濃度和發(fā)酵液上清中的硫酸銨溶液pH值及濃度一致。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種濃縮酵母發(fā)酵液中蛋白的方法，屬生物工程領(lǐng)域。該方法包括如下步驟：(1)用濾膜裝填重力柱底部，加入色譜柱料，用超純水洗脫介質(zhì)中的乙醇；(2)用1.5-3倍柱體積的硫酸銨平衡緩沖溶液平衡重力柱；(3)調(diào)節(jié)發(fā)酵液上清中硫酸銨終濃度為1-1.7M，添加柱體積6-8倍的發(fā)酵液上清溶液，加入平衡后的重力柱中，至含有硫酸銨的發(fā)酵液自行流出重力柱；(4)發(fā)酵液掛柱后，用2-3倍柱體積硫酸銨平衡緩沖溶液洗脫掛柱發(fā)酵液中的雜質(zhì)蛋白；(5)加入4倍柱體積的洗脫液對目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫。本發(fā)明方法具有目標(biāo)蛋白濃縮效率高、純度顯著提高，可用于實(shí)驗(yàn)室普通超濾管濃縮進(jìn)行進(jìn)一步的純化，而不會發(fā)生堵塞的問題。
【IPC分類】C07K1/16, C07K1/14
【公開號】CN105254703
【申請?zhí)枴緾N201510663242
【發(fā)明人】王剛剛, 謝天
【申請人】中國科學(xué)院成都生物研究所
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月14日