大腸桿菌噬菌體ms2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的制備、應(yīng)用和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病原體診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品 的制備、應(yīng)用和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)診 斷技術(shù)，因其具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，成為生物醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域內(nèi)最有價(jià)值的研究手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)。在RNA病毒的RT-PCR檢 測(cè)中，影響實(shí)驗(yàn)過(guò)程的因素較多，如實(shí)驗(yàn)人員測(cè)定操作中的隨機(jī)誤差、擴(kuò)增儀孔間溫度的差 異、標(biāo)本核酸提取后抑制物的殘留、待擴(kuò)增靶核酸的濃度、逆轉(zhuǎn)錄的效率及試劑問題等，這 些因素均可能會(huì)影響PCR擴(kuò)增的效率，進(jìn)而造成結(jié)果的偏差。因此，在做核酸特別是RNA擴(kuò) 增實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，即需要有特定的質(zhì)控物。質(zhì)控物須具備以下特點(diǎn)： (1)易制備；（2)在貯存和使用過(guò)程中穩(wěn)定性好；（3)無(wú)生物傳染性；(4)能監(jiān)控整個(gè)檢測(cè)過(guò) 程，結(jié)果可靠。
[0003] 傳統(tǒng)的RNA病毒檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品有三種：樣本中看家基因片段（以β-actin為 例），以及質(zhì)粒DNA，假病毒，但這些質(zhì)控品都有各自的弊端。樣本中β-actin，若取樣不成 功直接影響其結(jié)果的判斷，雖然看家基因與目的基因?yàn)榉歉?jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增，但如果在樣本中目 的基因與β-actin的濃度相差10倍以上，直接干擾和影響目的檢測(cè)片段的判斷；質(zhì)粒DNA 雖然穩(wěn)定性好，但在RNA病毒的RT-PCR中和樣本不屬于同源核酸，而且質(zhì)粒易污染實(shí)驗(yàn)室， 所以也不宜作為質(zhì)控品對(duì)RNA進(jìn)行監(jiān)控；假病毒較之前面兩種，是比較理想的選擇，但是其 要求一定的技術(shù)支持，操作繁瑣。嚴(yán)格的內(nèi)標(biāo)則是在反應(yīng)管中加入一定含量的內(nèi)標(biāo)模板，通 過(guò)內(nèi)標(biāo)含量的變化來(lái)監(jiān)控整個(gè)PCR過(guò)程。
[0004]大腸桿菌噬菌體MS2是包膜蛋白包裹結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)構(gòu)，與RNA病毒相似，且MS2無(wú) 致病性，可快速培養(yǎng)。將大腸桿菌噬菌體MS2作為RNA的RT-PCR檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的研究 具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種大腸桿菌噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的制備 方法。
[0006]具體技術(shù)方案如下：
[0007]-種大腸桿菌噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的制備方法，包括以下步驟：
[0008] (1)宿主菌的制備：挑大腸桿菌ATCC15597菌種接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；再挑 取單菌落接種至液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)，得到含宿主菌的培養(yǎng)液；
[0009] (2)噬菌體MS2單克隆的制備：挑噬菌體MS2用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法培養(yǎng)18-24小 時(shí)，再挑取單個(gè)噬菌斑至含宿主菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24h，得到含噬菌體MS2的培養(yǎng) 液；
[0010] (3)噬菌體MS2的擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟（1)制備的含宿主菌的培養(yǎng)液接種到液體培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)4-5小時(shí)，得到細(xì)菌培養(yǎng)液，再將步驟（2)制備的含噬菌體MS2的培養(yǎng)液接種 到細(xì)菌培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過(guò)夜，取培養(yǎng)液離心，收集上清液，過(guò)濾即得到純化的噬菌體MS2懸 液；
[0011] (4)噬菌體MS2的分析檢測(cè)：取步驟（3)制備的噬菌體MS2用熒光RT-PCR法檢測(cè) Ct值，并用雙層瓊脂法測(cè)效價(jià)；
[0012] (5)噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的制備：用凍干稀釋液將噬菌體懸液稀釋至Ct值為 18-20,分裝于離心管中，真空冷凍干燥，將所得凍干品冷凍保存。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟（4)所述熒光RT-PCR法檢測(cè)Ct值針對(duì)噬菌體MS2的 擴(kuò)增引物為SEQIDN0:4 和SEQIDN0:5。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟（4)所述熒光RT-PCR法檢測(cè)Ct值針對(duì)噬菌體MS2的 探針為SEQIDN0:6。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟（5)所述凍干稀釋液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8-1.2%的 牛血清白蛋白和體積分?jǐn)?shù)為45-55 %的吐溫20的水溶液。
[0016] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟（5)所述真空冷凍干燥的溫度為-50°C，壓力為 0. 2mTorr，所述冷凍保存的溫度為-20°C。
[0017] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種大腸桿菌噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品。
[0018] 具體技術(shù)方案如下：
[0019] -種大腸桿菌噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品，由本發(fā)明上述制備方法制備而成。
[0020] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述大腸桿菌噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的應(yīng)用。
[0021] 具體技術(shù)方案如下：
[0022] 上述大腸桿菌噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品在RNA病原體的熒光RT-PCR檢測(cè)過(guò)程中作 為內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種RNA病原體熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
[0024] 具體技術(shù)方案如下：
[0025] -種RNA病原體熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包含檢測(cè)試劑和內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品，所述內(nèi)標(biāo) 質(zhì)控品為上述大腸桿囷嗤囷體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品。
[0026] 本發(fā)明提供了噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的制備方法，該方法制備的噬菌體MS2內(nèi)標(biāo) 質(zhì)控品可作為內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品在RNA病原體的熒光RT-PCR檢測(cè)中準(zhǔn)確地監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以 此可作為評(píng)判實(shí)驗(yàn)是否成功的標(biāo)準(zhǔn)。該制備方法中利用真空冷凍干燥技術(shù)將噬菌體MS2制 備成凍干品，凍干品的性能更穩(wěn)定，易保存。與現(xiàn)有的其它內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品相比，噬菌體MS2作 為RNA的RT-PCR檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品具有很好的穩(wěn)定性，易保存（凍干保存時(shí)間多1年），方 便運(yùn)輸。在核酸提取中，對(duì)病原體內(nèi)RNA有很好的模擬作用，由于表達(dá)產(chǎn)物為噬菌體病毒顆 ?？烧嬲龅綇臉颖咎幚淼綌U(kuò)增的全程質(zhì)量檢測(cè)。噬菌體MS2安全性高，易于體外培養(yǎng)，可 通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)即可獲取，極為方便。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為實(shí)施例1中大腸桿菌噬菌體MS2梯度稀釋液的熒光RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果；
[0028] 圖2為實(shí)施例1中大腸桿菌噬菌體MS2的效價(jià)測(cè)試圖；
[0029] 圖3為實(shí)施例2中大腸桿菌噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的均勻性熒光RT-PCR的檢測(cè) 結(jié)果；
[0030] 圖4為實(shí)施例4中EV71病毒的熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；
[0031] 圖5為實(shí)施例4中大腸桿菌噬菌體MS2作為內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的熒光RT-PCR的檢測(cè)結(jié) 果。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0033] #271液體培養(yǎng)基的配制如下：
[0034]組分濃度：1% (g/ml)胰蛋白胨，0· 1% (g/ml)酵母膏，0· 8% (g/ml)NaCl
[0035] 配制量：1L
[0036] 配制方法：1、稱取下列試劑，置于1L燒杯中；
[0037]
[0038] 2、加入1L的蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙猓?br>[0039] 3、尚溫尚壓滅囷；
[0040] 4、高溫高壓滅菌如下試劑加入培養(yǎng)基中：
[0041]
[0042] 配置#271半固體或#271固體培養(yǎng)基時(shí)，則在上述液體培養(yǎng)基中加入重量分別為 4.0g、15.0g的瓊脂。
[0043] 凍干稀釋液：含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白和體積分?jǐn)?shù)為50%的吐溫20的 水溶液；
[0044] 樣品稀釋液：超純水。
[0045] 實(shí)施例1:大腸桿菌噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的制備
[0046] 1、宿主菌的制備
[0047] 用接種環(huán)挑出一點(diǎn)大腸桿菌ATCC15597菌種接種在#271固體培養(yǎng)基上過(guò)夜培 養(yǎng)；挑取1移菌環(huán)細(xì)菌至10mL#271液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，得到含宿主菌的培養(yǎng)液；
[0048] 2、噬菌體MS2單克隆的制備
[0049] 取出0. 5ml的噬菌體，用#271液體培養(yǎng)基10倍梯度稀釋，取100uL的梯度稀釋的 噬菌體菌液與300uL步驟1制備的含宿主菌的培養(yǎng)液混勻，靜置15分鐘，同4mL45°C的#271 半固體培養(yǎng)基混勻，然后倒入準(zhǔn)備好的#271固體培養(yǎng)基中，待凝固后放入37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng) 18-24小時(shí)。挑取單個(gè)噬菌斑至含有用步驟1的方法培養(yǎng)6h的大腸桿菌的液體培養(yǎng)基中， 37°C，200r/min，搖菌24h，收獲得到含噬菌體MS2的培養(yǎng)液；
[0050] 3、大量噬菌體MS2的制備
[0051] (1)步驟1制備的含宿主菌的培養(yǎng)液按照1:20的體積比接種到#271液體培養(yǎng)基 中，37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)4-5小時(shí)后，得細(xì)菌培養(yǎng)液，按照1:20的體積比將步驟2中培養(yǎng) 得到的含噬菌體MS2的培養(yǎng)液接種到上述細(xì)菌培養(yǎng)液中；
[0052] (2)將接種后的細(xì)菌培養(yǎng)液在37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取培養(yǎng)液在10000g下 離心10min，收集上清液，用孔徑0. 22um的膜過(guò)濾即得到純化的噬菌體MS2懸液；
[0053] 4、噬菌體MS2的分析檢測(cè)
[0054] 測(cè)定噬菌體MS2的Ct值并輔以雙層瓊脂法檢測(cè)噬菌體MS2的效價(jià)。
[0055] 采用腸道病毒71型核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）檢測(cè)噬菌體MS2的Ct值， 并輔以雙層瓊脂法測(cè)定噬菌體MS2的效價(jià)，具體操作如下：
[0056] 將待測(cè)噬菌體MS2懸液按照10倍梯度稀釋至109倍，每個(gè)梯度取50uL用于熒光 RT-PCR檢測(cè)，10uL用于雙層瓊脂法培養(yǎng)測(cè)定。
[0057] (1)用腸道病毒71型核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）檢測(cè)噬菌體MS2的Ct 值：
[0058] 核酸提取試劑組分和濃度見下表：
[0059]
[0060] RT-PCR擴(kuò)增體系：
[0061]

[0062] 引物和探針序列如下：
[0063]
[0065] 按常規(guī)技術(shù)進(jìn)行核酸提取以及RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)程序如下：
[0066]
[0067] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：菌體MS2懸液的一系列梯度對(duì)應(yīng)的Ct值見附圖1。
[0068] (2)雙層瓊脂平板培養(yǎng)法測(cè)效價(jià)：取10uL各梯度的噬菌體MS2懸液與0. 2mL宿主 菌培養(yǎng)液混勻，然后加入3mL冷至50°C的#271半固體培養(yǎng)基，混勻后倒入固體培養(yǎng)基中， 待凝固后37°C倒置培養(yǎng)18-24小時(shí)，每一梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算噬菌斑數(shù)量；取噬菌斑在 10-100個(gè)之間的平皿平均值計(jì)算效價(jià)：效價(jià)（pfu/mL)=平均·菌斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X100， 見圖2。
[0069] 5、噬菌體MS2內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品的制備