[0070] 采用凍干稀釋液對噬菌體MS2懸液進行稀釋，稀釋成Ct值約18-20的噬菌體溶 液，分裝于0. 6mLEP管中，每管120uL，轉入-80°C冰箱預凍過夜，然后用西蒙的真空冷凍干 燥機進行凍干（型號為FD5-3)，條件為-50°C，0. 2mTorr。5小時后即可收獲，-20°C冷凍保 存。
[0071] 6、均勻性測試
[0072] 取_20°C保存的噬菌體MS2內標質控品10管用200uL樣本稀釋液稀釋，震蕩混勻， 離心后各取50uL進行熒光RT-PCR檢測，并作統(tǒng)計分析，評估噬菌體MS2內標質控品的均勻 性。
[0073] 7、穩(wěn)定性測試
[0074] 不同時間點取_20°C保存的噬菌體MS2內標質控品3管進行熒光RT-PCR測定，并 進行統(tǒng)計分析各取樣時間點的噬菌體MS2內標質控品的穩(wěn)定性；前8個月每隔兩個月取樣 一次，后8個月每隔一個月取樣一次，并進行熒光RT-PCR測定，統(tǒng)計分析。
[0075] 實施例2 :大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品的均勻性測試
[0076] 取_20°C保存的實施例1制備的噬菌體MS2的標準品9管用200uL樣本稀釋液稀 釋，震蕩混勻離心后各取50uL進行熒光RT-PCR檢測，檢測體系與方法同實施例1，并進行統(tǒng) 計分析，評估噬菌體MS2內標質控品的均勻性，實驗結果見附圖2,數據整理如下表：
[0077]
[0078] 采用相對標準偏差即變異系數來評價均勻性，用CV表示:
[0079] 平均值X= (Ctl+Ct2+Ct3+· · · ·+Ct9)/9
[0080]標準差：α
[0081]
[0082] 式中η為檢驗總數
[0083] CV=標準差/平均值=1. 2%
[0084] 結果表明CV< 5%，各管之間差異不顯著，均勾性良好。
[0085] 實施例3 :大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品的穩(wěn)定性分析
[0086] 不同時間點取_20°C保存的實施例1制備的噬菌體MS2內標質控品3管進行熒光 RT-PCR測定，檢測體系與方法同實施例1，并進行統(tǒng)計分析各取樣時間點的噬菌體MS2內標 質控品的穩(wěn)定性；前8個月每隔兩個月取樣一次，后8個月每隔一個月取樣一次，并進行熒 光RT-PCR測定，統(tǒng)計分析。結果見下表：
[0087]
[0088] 大腸桿菌噬菌體MS2的RT-PCR檢測Ct值的回歸方差分析結果見下表：
[0089]
[0090] F值小于F臨界值，表明各取樣時間點的噬菌體MS2內標質控品的變化差異不明 顯，-20°C保存，16個月內MS2內標質控品的穩(wěn)定性良好，故其保質期定為12個月是可行的。
[0091] 實施例4 :大腸桿菌菌體MS2內標質控品的一個應用實例
[0092] 1、樣品材料及儀器設備：
[0093] 腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（RT-PCR-熒光探針法）：廣東和信健康科技有限 公司；0. 6ml離心管，移液器吸頭，離心機（配0. 6ml轉子或適配器），推薦使用進口離心管 和帶濾芯移液器吸頭進行操作，檢測過程中勿使用帶熒光物質的一次性乳膠手套。
[0094] 待檢樣本：5株EV71的臨床分離株，廣州呼吸疾病研究所；
[0095] 內標：實施例1制備的大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品，
[0096] 陰性對照品：超純水
[0097] 強陽性對照品：滅活腸道病毒71型的凍干品，Ct值在18-21之間；
[0098] 臨界陽性對照品：滅活腸道病毒71型的凍干品，Ct值在27-30之間；
[0099] 核酸提取試劑，RT-PCR的擴增體系以及引物與探針同實施例1。
[0100] 2、核酸提取：
[0101] 提取前準備：用樣本稀釋液分別將EV71強陽性對照品、EV71臨界陽性對照品、RNA 內標（噬菌體MS2)稀釋至200μL，稀釋后為凍干前的濃度，Ct值基本保持不變，混勻并短 暫離心，備用。
[0102] 試劑盒中各組分（除TaqDNA聚合酶和M-MLV反轉錄酶）充分解凍并混勻。
[0103] 所有步驟均在室溫下進行，離心機的溫度設定在25°C。詳細操作過程如下：
[0104] (1)取200μ1核酸提取液A于η(η=樣本數+3個外標質控品）個0· 6ml離心管 中，每管加入5μ1內標（陰性對照不用加內標）；
[0105] (2)每管分別加入待檢樣本、陰性對照品、強陽性對照品、臨界陽性對照品各 50μ1，作好標記，充分混勻并短暫離心，室溫靜置3分鐘；
[0106] (3)每管加入200μ1核酸提取液Β，充分混勻，13000rpm離心10分鐘，吸棄上清；
[0107] (4)每管加入200μ1核酸提取液C，顛倒數次混勻，13000rpm離心5分鐘，吸棄上 清，開蓋在室溫或55 °C放置2~5分鐘，晾干；
[0108] (5)每管加入25μ1樣本稀釋液，蓋上管蓋，用手指彈管底部或振蕩器震蕩，使核 酸充分溶解，短暫離心使液體全部落于管底部，冰上或4°C放置，用于RT-PCR檢測。
[0109] 3、RT_PCR擴增：
[0110] RT-PCR擴增包括腸道病毒71型基因和內標基因擴增反應。
[0111] (1)配液（在試劑準備區(qū)進行）：取出擴增反應液，室溫融化后充分混勻，短暫離 心，并按反應個數η(η=樣本數+3個外標質控品）分別取反應液和酶按照以下配比配置反 應液：
[0112]
[0113] 計算好各試劑用量，加入適當體積于一支離心管中，充分混勻，短暫離心，然后按 20μ1/管分裝到透明PCR八排管或96孔PCR反應板中，轉移至樣本處理區(qū)；
[0114] (2)加樣（在樣本處理區(qū)進行）：分別加入5μ1步驟2中處理好的待測樣本或對 照品，蓋好管蓋（透明平蓋），轉移至核酸擴增區(qū)；
[0115] (3)RT-PCR擴增（在核酸擴增區(qū)進行）：
[0116] 將反應管/板置于ABIPrism7500全自動熒光定量PCR儀樣品槽中。熒光素 FAM/R0X同時勾選，FAM熒光指示腸道病毒71型，R0X熒光指示內標。熒光采集為55°C。 Instrument窗口設置條件如下：
[0117]
[0118]
[0119] 4、結果分析
[0120] 結果判定標準：
[0121]
[0122] 檢測結果：
[0123] 五株EV71病毒檢測結果：Ct彡35. 00,熒光增幅明顯，有典型S型曲線，為陽性 (圖3)，MS2Ct彡35. 00,增幅明顯，為陽性（圖4)，滿足作為內標質控品的要求。
[0124] 以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實 施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存 在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。
[0125] 以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 宿主菌的制備：挑大腸桿菌ATCC 15597菌種接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；再挑取單 菌落接種至液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)，得到含宿主菌的培養(yǎng)液； (2) 噬菌體MS2單克隆的制備：挑噬菌體MS2用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法培養(yǎng)18-24小時， 再挑取單個噬菌斑至含宿主菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24h，得到含噬菌體MS2的培養(yǎng)液； (3) 噬菌體MS2的擴大培養(yǎng)：將步驟（1)制備的含宿主菌的培養(yǎng)液接種到液體培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)4-5小時，得到細菌培養(yǎng)液，再將步驟（2)制備的含噬菌體MS2的培養(yǎng)液接種到細 菌培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)液離心，收集上清液，過濾即得到純化的噬菌體MS2懸液； (4) 噬菌體MS2的分析檢測：取步驟（3)制備的噬菌體MS2用熒光RT-PCR法檢測Ct 值，并用雙層瓊脂法測效價； (5) 噬菌體MS2內標質控品的制備：用凍干稀釋液將噬菌體懸液稀釋至Ct值為18-20， 分裝于離心管中，真空冷凍干燥，將所得凍干品冷凍保存。2. 根據權利要求1所述的大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品的制備方法，其特征在于， 步驟（4)所述熒光RT-PCR法檢測Ct值針對噬菌體MS2的擴增引物為SEQ ID NO: 4和SEQ ID N0:5〇3. 根據權利要求1所述的大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品的制備方法，其特征在于，步 驟（4)所述熒光RT-PCR法檢測Ct值針對噬菌體MS2的探針為SEQ ID NO: 6。4. 根據權利要求1-3任一項所述的大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品的制備方法，其特 征在于，步驟（5)所述凍干稀釋液為含有質量分數為0.8-1. 2%的牛血清白蛋白和體積分 數為45-55%的吐溫20的水溶液。5. 根據權利要求1-3任一項所述的大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品的制備方法，其特 征在于，步驟（5)所述真空冷凍干燥的溫度為-50°C，壓力為0.2mT 〇rr，所述冷凍保存的溫 度為_20°C。6. -種大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品，其特征在于，由權利要求1-5任一項所述的制 備方法制備而成。7. 權利要求6所述的大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品在RNA病原體的熒光RT-PCR檢 測過程中作為內標質控品的應用。8. -種RNA病原體熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，包含檢測試劑和內標質控品， 所述內標質控品為權利要求6所述的大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大腸桿菌噬菌體MS2內標質控品的制備方法、應用和試劑盒，該方法制備的噬菌體MS2內標質控品可作為在RNA病原體的熒光RT-PCR核酸檢測試劑盒的內標質控物質，在RNA病原體的RT-PCR檢測中能夠準確地監(jiān)控整個實驗過程，以此可作為評判實驗是否成功的標準。該方法制備的噬菌體MS2內標質控品有很好的穩(wěn)定性，易保存(凍干保存時間≥1年)，方便運輸，安全性高，作為內標質控品可真正做到從樣本處理到擴增的全程質量檢測。
【IPC分類】C12Q1/70, C12N7/00, C12Q1/68
【公開號】CN105238765
【申請?zhí)枴緾N201510729592
【發(fā)明人】崔紅, 李哲群, 商興芳, 吳秋保, 曾家琨
【申請人】廣州呼研所生物技術有限公司, 廣東和信健康科技有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月29日