一種偽狂犬病毒LLT區(qū)ΔIntron株及構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物病菌基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個偽狂犬病毒鄂A株P(guān)RV Intron缺失突變活毒株，同時還涉及一種偽狂犬病毒LLT區(qū)ΛI(xiàn)ntron突變株的構(gòu)建方法， 還涉及一種偽狂犬病毒LLT區(qū)AIntron突變株的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病（Pseudorabies，PR),又名奇癢癥、奧葉基氏病（Aujeszky's disease,AD)，是由偽狂犬病毒引起的以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎為主要特征的一種 烈性傳染?。ㄒ笳穑瑒⒕叭A.動物病毒學(xué)[M]. 2版.北京：科學(xué)出版社，1997:700-713. McCrackenRM,McFerranJBandDowC.Theneuralspreadofpseudorabiesvirusin calves.JGenVirol，1973,）。偽狂犬病病原為皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科的偽狂犬病 毒（PRV)。
[0003] 偽狂犬病毒感染宿主譜非常廣泛，包括嚙齒類動物、家畜、犬類和貓科動物，然而 其感染自然宿主--豬和非自然宿主所引起的臨床癥狀和結(jié)局是不同的：成年豬感染野生 型PRV后主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)和繁殖系統(tǒng)疾病癥狀，很少發(fā)生死亡；非自然宿主感染PRV后 表現(xiàn)奇癢及神經(jīng)癥狀，大多以死亡告終（Pomeranzetal，2005)。
[0004] 本病廣泛分布于世界各地，已有50多個國家和地區(qū)報道該病的流行（李春華，王 英，蔣鳳英，胡建華.豬偽狂犬病研究進(jìn)展.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008, 29:68-72.)。我國于 上世紀(jì)40年代末在貓中首次分離到偽狂犬病毒，60年代初隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，偽狂犬病開 始在豬群中流行（童武等，2013)。該病對養(yǎng)豬業(yè)的危害主要表現(xiàn)在以下幾個方面：a.妊 娠母豬感染后表現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)死胎或木乃伊胎。b. 15日齡內(nèi)哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后一般 24~36h內(nèi)死亡，死亡率可達(dá)100%。c.斷奶仔豬發(fā)病表現(xiàn)為拉稀、運(yùn)動失調(diào)、顫抖、口吐白 沫等，比哺乳仔豬死亡率低。d.感染公豬發(fā)生睪丸腫脹、萎縮，喪失種用價值；母豬表現(xiàn)屢 配不孕、不發(fā)情或返情。e.感染育肥豬表現(xiàn)為呼吸道癥狀，極少病例出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，死亡率 極低，但增重遲緩、飼料報酬降低，影響經(jīng)濟(jì)效益（劉正飛，陳煥春，吳斌，何啟蓋，秦永 輝.偽狂犬病病毒鄂A株TK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保護(hù)力研究.畜牧獸醫(yī)學(xué) 報，2004, 35:70-73.)，且感染后耐過的豬成為PRV最主要的儲存宿主和傳播者。
[0005] PRV除了能感染豬以外，還能感染牛、綿羊、狗、貓、山羊、雞、浣熊、臭鼬及一 些實(shí)驗(yàn)用動物如兔、小鼠、大鼠、豚鼠等，兔尤為敏感；偶爾也會感染馬；人、黑猩猩等 高等靈長類不感染PRV或感染但不發(fā)病，但恒河猴和狨猴對PRV是易感的。此外PRV 在野豬中大量存在，熊和野生貓科動物在食用帶有PRV的肉后也可被感染（Enquist Lff.Lifebeyonderadication:veterinaryvirusesinbasicscience.ArchVirol Sup, 1999,15:87 - 109.；McCrackenRM,McFerranJBandDowC.Theneuralspreadof pseudorabiesvirusincalves.JGenVirol,1973, 20:17 - 28；ffittmannG，JakubikJ andAh1R.MultiplicationanddistributionofAujeszky^sdisease(pseudorabies) virusinvaccinatedandnon-vaccinatedpigsafterintranasalinfection. ArchVirol，1980,66:227 - 240;KimmanTG，BinkhorstGJ，PolJM，GielkensAL，and RoelvinkME.Aujeszky,sdiseaseinhorsesfulfilsKoch,spostulates.Vet Rec, 1991，128:103 - 106.)，這給PRV的根除帶來巨大困難，并時刻威脅著養(yǎng)豬業(yè) 的健康發(fā)展（MiillerT,HahnEC，TottewitzF,KramerM，KluppBG，Mettenleiter TC,FreulingC.Pseudorabiesvirusinwildswine:aglobalperspective.Arch Virol, 2011, 156:1691-1705.)〇
[0006] 近年來該病毒給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且在免疫壓力下開始發(fā)生變異， 先前預(yù)防用的疫苗Batha-K61已經(jīng)不能產(chǎn)生很好的保護(hù)力來抵抗新的PRV毒株。從2011年 起，我國多省發(fā)生了新生仔豬疑似偽狂犬病癥狀的病例，腦組織分離病料經(jīng)PCR鑒定、細(xì)胞 病變觀察及間接免疫熒光等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為PRV，對gE毒力基因進(jìn)行序列比對分析，表明該毒 株與經(jīng)典PRV(S株）和疫苗株有明顯差異，為新變異毒株童武，張青占，鄭浩，劉飛，姜 一峰，單同領(lǐng)，周艷君，童光志.免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定.中國動物 傳染病學(xué)報，2013, 21:1-7.)。因此盡快研發(fā)新型疫苗，控制該病的傳播迫在眉睫。
[0007] 近幾年研究表明病毒與宿主細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用過程也涉及miRNA介導(dǎo)的RNA 沉默途徑（GottweinE,CullenBR.ViralandcellularmicroRNAsasdeterminantsof viralpathogenesisandimmunity.CellHostMicrobe, 2008, 3:375-387·)。本實(shí)驗(yàn)室前 期研究發(fā)現(xiàn)PRV感染PK15細(xì)胞后，LLT基因中約4. 6kb的Intron作為一個pri-miRNA(初 級miRNA)，可以編碼 11 個不同的miRNA(WuYi-Quan,ChenDi-Jun,HeHua-Bin,Chen Dong-Sheng,ChenLing-Ling,ChenHuan-Chun,LiuZheng-Fei.Pseudorabiesvirus infectedporcineepithelialcelllinegeneratesadiversesetofhostmicrornas andaspecialclusterofviralmicrornas.PlosOne, 2012, 7(1):e30988·)，其中 7 個 是先前未報道的。通過stem-loopRT-PCR和northernblot的方法對它們進(jìn)行了進(jìn)一步 鑒定。靶基因預(yù)測分析顯示PRV編碼的miRNAs能夠調(diào)控眾多自身與宿主的靶基因，這些 靶基因涉及多種生物學(xué)過程，包括免疫系統(tǒng)加工、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡和病毒復(fù)制等（Wuet al, 2012)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是在于提供了一種偽狂犬病毒缺失株（PRV-ΛI(xiàn)ntron)，該毒株表達(dá) miRNA的區(qū)域缺失，喪失了對宿主和自身蛋白質(zhì)編碼基因的調(diào)控作用，導(dǎo)致毒力下降，具有 開發(fā)成為新型疫苗的潛在價值。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種偽狂犬病毒缺失株（PRV-ΛI(xiàn)ntron)的制 備方法，方法易行，操作簡便，缺失區(qū)域遺傳穩(wěn)定，不會返強(qiáng)。
[0010] 本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種偽狂犬病毒缺失株P(guān)RV-ΛI(xiàn)ntron在制備 偽狂犬病基因工程疫苗中的應(yīng)用，可以用于制備新型偽狂犬病疫苗，預(yù)防和控制豬偽狂犬 病。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0012] -種偽狂犬病毒缺失株P(guān)RV-ΛI(xiàn)ntron的制備方法，其步驟是：
[0013]A、Intron上下游同源臂的PCR擴(kuò)增。以偽狂犬病毒鄂A株DNA為模板，用表1中 的引物和表2所示的擴(kuò)增條件，分別擴(kuò)增LLTintron的上下游同源臂。其中上游同源臂 551bp，包含編碼EPO蛋白的序列SEQIDNO. 1 ;下游同源臂536bp，包含IE180的序列SEQ IDN0:3〇
[0014] B、轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建。將Intron基因上下游同源臂片段通過分子克隆技術(shù)克隆至 pcDNA3. 1(+)載體上，通過酶切位點(diǎn)HindIII、EcoRI和XhoI拼接在一起，構(gòu)成同源重組 所必需的上下游同源臂，構(gòu)建的該中間轉(zhuǎn)移載體被命名為pZFll-84(缺失Intron基因）， 在pZFl1-84中插入帶有完整啟動子的EGFP報告基因，將構(gòu)建成的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒命名為 PZF14-6(ΛI(xiàn)ntron/EGFP+)。
[0015] C、PRVAIntron-EGFP+重組病毒的構(gòu)建與鑒定。將中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pZF14-6(AIntron/EGFP+)和PRVEa基因組用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染于PK15細(xì)胞系進(jìn)行同源重 組，空斑純化篩選得到PRV-ΔIntron-EGFP+重組病毒。
[0016] D、PRVAIntron-EGFP+重組病毒體外培養(yǎng)生物學(xué)特性。將制備的偽狂犬病毒 ΛI(xiàn)ntron基因缺失毒株接種PK-15細(xì)胞，一步法增值曲線試驗(yàn)和空斑試驗(yàn)表明缺失株增殖 能力下降。
[0017] E、動物實(shí)驗(yàn)。將制備的偽狂犬病毒AIntron基因缺失毒株感染Balb/c小鼠， Intron的缺失導(dǎo)致