重組豬偽狂犬病毒毒株及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組豬偽狂犬病毒毒株，重組豬偽狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCCNO：V201345。本發(fā)明是在偽狂犬病毒載體的基礎(chǔ)上加入了綠色熒光蛋白標(biāo)簽，構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白gG缺失的通用轉(zhuǎn)移載體PG，含有偽狂犬病病毒自身晚期基因gG啟動子、CMV啟動子、SV40Poly(A)且上下游側(cè)翼分別為0.8kb和l.7kb，完全可以滿足同源重組的需要。EGFP不僅可以作為基因表達(dá)的指示劑，而且在其上所帶有的多克隆位點(diǎn)內(nèi)插入了豬IL-18基因，實(shí)現(xiàn)了將不同表達(dá)框通過一個(gè)共同的載體相連而構(gòu)建，是作為兩個(gè)表達(dá)框單獨(dú)表達(dá)的，其外源基因的表達(dá)量與兩個(gè)表達(dá)框連接的方向關(guān)系密切。
【專利說明】重組豬偽狂犬病毒毒株及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因和豬IL-18基因的重組豬偽狂犬病毒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒之一?？筛鶕?jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列將PCV分為PCVl和PCV2兩個(gè)基因型。PCVl廣泛存在于豬體內(nèi)及豬源細(xì)胞系中，無致病性，不能引起細(xì)胞病變；PCV2具有致病性，主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)。豬由PCV2感染而引起的各種疾病已遍布世界各地，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。豬圓環(huán)病毒2型有兩個(gè)主要的開放閱讀框ORFl和0RF2，其中0RF2基因是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因，編碼病毒的衣殼蛋白，可自我裝配成病毒樣粒子，并且0RF2蛋白中含有可中和病毒的中和抗原表位，已成為目前PCV2疫苗研究的主要候選基因。PCV2疫苗的研究，目前已有PCV2滅活疫苗、PCV2DNA疫苗、亞單位疫苗和嵌合病毒疫苗，但有關(guān)病毒活載體疫苗的報(bào)道相對較少。
[0003]偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)屬抱疫病毒科ct抱疫病毒亞科,是引起豬繁殖障礙的主要病原之一。其危害主要表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎及新生仔豬死亡等綜合征，臨床以產(chǎn)死胎為主。該病毒基因組龐大，其容量可高達(dá)40kb，具有足夠的空間允許外源基因的穩(wěn)定插入，并且重組病毒在增殖的同時(shí)可穩(wěn)定表達(dá)外源基因，從而提供對偽狂犬病毒和其它相應(yīng)傳染病的抵抗力，具有一個(gè)優(yōu)良活病毒載體的基本特征。其中最引人注目的是表達(dá)豬瘟病毒主要保護(hù)性抗原E2基因的重組偽狂犬病毒，目前此疫苗株的遺傳穩(wěn)定性，外源基因?qū)Σ《驹鲋车挠绊懸约吧锇踩跃训玫秸撟C，有望投入生產(chǎn)使用。
[0004]白細(xì)胞介素18(Interleukin_18，IL-18)是從被熱滅活痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)感染和脂多糖(LPS)誘發(fā)的中毒性休克小鼠肝臟提取液中獲得的一種由應(yīng)激誘生的蛋白，其誘生IFN-Y的能力很強(qiáng)，因而最初被稱為IFN-Y誘生因子(Interferon gamma inducing factor, IGIF)。1996 年成功從鼠 cDNA 庫中篩選到人的IGIF基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，因其序列與所有已知的細(xì)胞因子不同，且生物活性多樣，故將其正式命名為白細(xì)胞介素18。IL-18能誘導(dǎo)IFN-Y大量分泌表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞增殖及Thl細(xì)胞的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，抑制Th2類細(xì)胞因子的生成，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病原微生物感染中具有十分重要的作用。 [0005]綠色熒光蛋白(GFP)存在于發(fā)光水母體內(nèi)，是一種吸收藍(lán)光或紫外光后發(fā)出綠色熒光的天然蛋白質(zhì)。同以往常用的報(bào)告基因LacZ、CAT、熒光素酶基因以及其它抗生素基因相比，GFP不需要任何外源性底物和輔助因子，無毒、無污染、穩(wěn)定，當(dāng)受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，GFP發(fā)射綠色熒光。因此其被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種重組豬偽狂犬病毒毒株，分類命名:表達(dá)PCV20RF2基因和豬IL-18基因的重組豬偽狂犬病毒PRV-PCV2-1L18 PG018,拉丁文學(xué)名:Herpesviridae。保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位簡稱:CCTCC,保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學(xué)，保藏日期:2013年11月18日，保藏編號CCTCC NO:V201345o
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種重組豬偽狂犬病毒毒株，重組豬偽狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO:V201345。
[0008]所示的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，以pGEMT-1L-18為模板，擴(kuò)增豬IL-18基因，利用重組技術(shù)插入到含有PCV20RF2基因的重組豬偽狂犬病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PGO中，構(gòu)建載體PG018，將豬偽狂犬病毒弱毒株感染ST細(xì)胞后，再轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PG018，經(jīng)蝕斑純化得到重組豬偽狂犬病毒。
[0009]所述構(gòu)建載體PG018的步驟如下:
[0010]①根據(jù)重組質(zhì)粒pGEMT-1L-18中豬IL-18基因片段設(shè)計(jì)I對引物，所述引物序列為:
[0011]上游引物序列:5’-TAAGATCTATGGCTGCTGAACCGGA-3’,
[0012]下游引物序列:5’-CGCCAGATCTCTAGTTCTTGTTTTG-3，；
[0013]②豬IL-18的PCR擴(kuò)增
[0014]以pGEMT-1L-18為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如下:
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種重組豬偽狂犬病毒毒株，其特征在于:重組豬偽狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO:V201345o
2.如權(quán)利要求1所述的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，其特征在于:以pGEMT-1L-18為模板，擴(kuò)增豬IL-18基因，利用重組技術(shù)插入到含有PCV2 0RF2基因的重組豬偽狂犬病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PGO中，構(gòu)建載體PG018，將豬偽狂犬病毒弱毒株感染ST細(xì)胞后，再轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PG018，經(jīng)蝕斑純化得到重組豬偽狂犬病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，其特征在于:所述構(gòu)建載體PGO18的步驟如下: ①根據(jù)重組質(zhì)粒pGEMT-1L-18中豬IL-18基因片段設(shè)計(jì)I對引物，所述引物序列為: 上游引物序列:5’ - TAAGATCTATGGCTGCTGAACCGGA-3’, 下游引物序列:5’ - CGCCAGATCTCTAGTTCTTGTTTTG -3’ ； ②豬IL-18的PCR擴(kuò)增 以pGEMT-1L-18為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如下:

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，其特征在于:所述轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PG018的步驟如下:用B10MIGA無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒PG018至I μ g/ μ L備用，復(fù)蘇細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將ST細(xì)胞傳至第3代，將細(xì)胞懸液加到6孔板中，先用PRV疫苗株接種至90%的ST細(xì)胞，吸附1.5h后，將質(zhì)粒PGO18進(jìn)行轉(zhuǎn)染，置37°C、5%CO2下培養(yǎng)5h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入1.5mL細(xì)胞維持液，于37°C、5% CO2下繼續(xù)培養(yǎng)36h，收獲病變細(xì)胞，反復(fù)凍融3次用于重組病毒的篩選。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，其特征在于:所述蝕斑純化的步驟如下:將轉(zhuǎn)染獲得的病毒液按10 - ^ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'Κ6進(jìn)行稀釋，各取400 μ L接種到ST細(xì)胞長至單層的6孔板中，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)吸附1.5h后，每孔加入2mL低熔點(diǎn)營養(yǎng)瓊脂糖，培養(yǎng)48h，此時(shí)在熒光顯微鏡的藍(lán)光(波長42(T490nm)下能觀察到綠色和無特殊熒光顏色的兩種病毒蝕斑，在熒光顯微鏡下用巴氏吸管吸取綠色蝕斑，加入DMEM維持液于-20° C反復(fù)凍融3次，然后將收獲的病毒液接種到含單層ST細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)至90%以上的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)收毒，將每孔收集的病毒提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇PCR陽性的病毒進(jìn)行下一輪的蝕斑純化，直至獲得純凈的重組病毒PG018。
【文檔編號】C12N7/01GK103952379SQ201410104923
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】陳紅英, 鄭蘭蘭, 崔保安, 郭曉慶, 魏戰(zhàn)勇, 朱前磊 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)