一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系及應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系及應(yīng)用。通過構(gòu)建帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子，轉(zhuǎn)染細胞，最終獲得了一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系，CCTCCNO:C2011124。通過間接免疫熒光、RT-PCR、熒光素酶活性的檢測、藥物抑制等實驗證實，本發(fā)明篩選出的含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21，能穩(wěn)定表達病毒自身蛋白以及外源蛋白，傳代穩(wěn)定，在抗登革病毒藥物篩選、抗DENV病毒藥物的作用機制、疫苗和診斷試劑等方面的研究等方面具有廣泛的應(yīng)用價值。【專利說明】—種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系及應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體涉及一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系，還涉及一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]登革病毒(Denguevirus,DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬成員，與其同屬的成員還包括:日本腦炎病毒、西尼羅病毒、圣路易斯腦炎病毒和黃熱病毒等。其基因為單股正鏈RNA大小約為llkb，包括:3’非編碼區(qū)，一個開放閱讀框和5’非編碼區(qū)。其中:3’非編碼區(qū)和5’非編碼區(qū)均含有保守的RNA序列和二級結(jié)構(gòu)，其在病毒的復(fù)制和包裝過程中發(fā)揮著重要作用；而開放閱讀框則編碼一個完整的多聚蛋白，在病毒編碼的蛋白酶和來源于宿主的蛋白酶的作用下，該多聚蛋白被加工為3個結(jié)構(gòu)蛋白(C、M和E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。結(jié)構(gòu)蛋白主要在病毒的組裝過程中發(fā)揮重要的作用，而非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒的復(fù)制。[0003]作為一種重要的蟲媒病毒，依據(jù)其抗原性，登革病毒分為4個血清型(DENV-1，2，3，4)。該病毒主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊在人與人之間進行傳播。該病毒在全球均有分布，主要包括:越南、新加坡、印度尼西亞、菲律賓、馬來西亞、緬甸、印度尼西亞、美國、古巴、中國等，主要分布在熱帶和亞熱帶區(qū)域。據(jù)世界衛(wèi)生組織的估計，全世界每年約有5千萬至I億人感染登革病毒而引發(fā)登革熱，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為:發(fā)熱、皮疹、頭痛和肌痛；而登革病毒的感染者可能發(fā)展為更為嚴重的病癥，即登革出血熱和登革休克綜合癥，據(jù)統(tǒng)計每年全世界約有25萬至50萬人表現(xiàn)為登革出血熱。目前還沒有有效的疫苗和藥物來預(yù)防和治療登革病毒引起的疾病。歷次登革病毒的爆發(fā)和流行給我國社會經(jīng)濟的發(fā)展帶來了極大的影響，同時也給我國公共衛(wèi)生體系的建設(shè)和運行帶來了挑戰(zhàn)。由于我國加強了登革病毒的傳播媒介和病毒的監(jiān)測、強化了媒介蚊蟲的綜合防治手段，城市衛(wèi)生環(huán)境得到了改善，我國登革病例的報道相比以前已經(jīng)減少，但是，隨著全球氣候的變化，城市化進程的加快、人員的頻繁交往及我國在登革疫區(qū)勞務(wù)人員的增加，登革病毒流行的威脅依然存在，而且我國部分地區(qū)的氣候和環(huán)境適合登革病毒的傳播媒介的生存，為病毒的傳播提供了條件。因此，加強登革病毒的監(jiān)測、基礎(chǔ)研究和抗病毒藥物的開發(fā)具有十分重要的意義。[0004]本發(fā)明提供了一種帶有熒光素酶(Rluc)和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neo)雙報告基因的登革病毒2型(DENV-2)復(fù)制子穩(wěn)定細胞系，該發(fā)明能夠用于抗病毒的藥物篩選、藥物的作用機制、疫苗和診斷試劑等方面的研究，具有十分廣泛的應(yīng)用前景。【
發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明提供了一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系，該細胞系帶有Rluc和Neo標(biāo)簽的登革熱病毒2型復(fù)制子，革熱病毒2型復(fù)制子在該細胞中能很好的復(fù)制，連續(xù)傳代。該細胞系已于2011年12月20日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名:含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21BHK-21/pACYC-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo，CCTCCN0:C2011124，地址:中國武漢武漢大學(xué)。[0006]本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系的應(yīng)用，該細胞系中Rluc編碼的蛋白便于檢測病毒基因組的復(fù)制，Neo基因編碼的蛋白可使宿主細胞具有抗G418藥物的能力，所述的應(yīng)用包括該細胞系用于抗DENV病毒藥物篩選、抗DENV病毒藥物的作用機制、疫苗和診斷試劑等方面的研究，具有十分廣泛的應(yīng)用前景。[0007]為了達到上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:[0008]本發(fā)明的設(shè)計思路為:[0009]在帶有Rluc的DENV2質(zhì)粒pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-R印(Developmentandcharacterizationofastableluciferasedenguevirusforhigh-throughputscreening[J].Antiviralresearch,2011,91(I):11-19.)中插入IRES-Neo基因，構(gòu)建帶有Rluc和Neo基因的登革熱病毒2型復(fù)制子，將該克隆體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染入BHK-21細胞中，在合適濃度G418持續(xù)的抗性篩選下，經(jīng)過連續(xù)傳代篩選，最終獲得了一種帶有Rluc和Neo雙報告基因的登革病毒2型(DENV-2)復(fù)制子的穩(wěn)定細胞系。[0010]一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系，其制備方法如下:[0011]I)帶有熒光素酶基因和新霉素抗性基因的登革熱病毒2型復(fù)制子的構(gòu)建，其方法如下:[0012](I)利用融合PCR技術(shù)，在帶有Rluc的DENV2質(zhì)粒pACYC-DENV2_TSV-Rluc2A-R印中構(gòu)建C9250G突變，創(chuàng)造Nhel酶切位點。[0013](2)利用限制性內(nèi)切酶AgeI和ClaI雙酶切得到的DENV2_TSV_Age1-ClaI基因片段，使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收DNA片段，將其連接于經(jīng)相同酶雙酶切的DENV2-TSV-F基因片段中，命名為DENV2-TSV-F-NheI；[0014](3)利用引物Nhe1-1RES-neo-F(TATGCTAGCCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCC)和Nhe1-1RES-Neo-R(ACAGCTAGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG)，以pLVX-1RES-Neo[購于美國Clontech公司]為模板，PCR擴增Nhe1-1RES-Neo-NheI基因片段；NheI酶切后連接于DENV2-TSV-F-NheI，測序正確后命名為DENV2_TSV-F_Nhe1-1RES-Neo；[0015](4)XhoI和ClaI雙酶切DENV2_TSV-F_Nhe1-1RES-Neo重組質(zhì)粒，將得到的含IRSE-Neo的基因的片段連接于經(jīng)相同酶雙酶切的pACYC-DENV2_TSV-Rluc2A-R印質(zhì)粒中，命名為pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo(圖1)，其序列為SEQIDN0.1所示。[0016]2)一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系的篩選:[0017](1)抗生素G418篩選細胞系最佳濃度的確定:[0018]在24孔細胞培養(yǎng)板的各孔中分別接種2XIO4個BHK-21細胞，向各孔中加G418，終濃度分別為0、200、400、600、700、800和ΙΟΟΟμg/ml，篩選10天左右觀察12孔板細胞每個孔中細胞狀態(tài)，G418濃度為700ug/ml的兩個孔中細胞全部死亡，從而選擇比其高一個濃度梯度的800ug/ml用于后續(xù)細胞系篩選的G418的最佳篩選使用濃度，400ug/ml為細胞系傳代時的維持濃度。[0019](2)pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-Rep-3NTR-1RES-NeoRNA的制備:[0020]用ClaI酶切pACYC-TA-DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo進行線性化處理，線性化產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提后，分別以其為模板，使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒T7mMESSAGEmMACHINEkit,按照試劑盒說明進行體外轉(zhuǎn)錄得到pACYC-TA-DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-NeoRNA。[0021](3)轉(zhuǎn)染BHK-21細胞:[0022]將10μg體外轉(zhuǎn)錄的pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo的RNA采用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入0.8mlBHK-21細胞(含有8XIO6個細胞)，每天使用顯微鏡觀察細胞的狀態(tài)，待細胞成為單克隆時采用挑取單克隆的方法進行擴大培養(yǎng)。[0023]最終篩選出一種帶有雙報告基因的登革病2型復(fù)制子的穩(wěn)定細胞系，該細胞系已于2011年12月20日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名:含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21BHK-21/pACYC-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo，CCTCCN0:C2011124，地址:中國武漢武漢大學(xué)。[0024]含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系生理生化特性，及培養(yǎng)特性:該細胞系中，登革病毒2型復(fù)制子能穩(wěn)定復(fù)制，當(dāng)前已穩(wěn)定傳至47代,能夠穩(wěn)定表達病毒自身非結(jié)構(gòu)蛋白和Rluc熒光素酶。該細胞與正常的BHK-21形態(tài)相似，貼壁時為長條梭型，未貼壁的細胞為圓形。最適培養(yǎng)條件為37°C、5%C02，使用含10%胎牛血清(V/V)、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、500ug/mlG418的DMEM完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。[0025]所述細胞系進行分離傳代時，使用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶作為消化液。[0026]一種帶有雙報告基因的登革病2型復(fù)制子的細胞系的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是:[0027]本發(fā)明選擇一種已知的對黃病毒屬病毒有抑制作用的藥物NITD008來檢測其對含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21的抑制作用:[0028]在12孔細胞培養(yǎng)板每孔中接種含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21，在37°C，5%C02培養(yǎng)條件下，待匯合度達到60%時，分別加入用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基系列稀釋的NITD008(濃度分別為0,0.11、1、3、9和27μM)，于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后分別吸棄孔中的上清，并向孔中加入ImlPBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200μI細胞裂解液處理細胞并混勻孔中的細胞裂解物，取20μI于白色96孔板中，并加入50μ1的底物,按照LuciferaseAssaySystem說明書的要求使用多功能酶標(biāo)儀檢測Rluc的活性。[0029]以上所述的應(yīng)用過程可用于抗DENV病毒藥物篩選、抗DENV病毒藥物的作用機制研究。[0030]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果:[0031]1、本發(fā)明篩選出帶有Rluc和Neo雙報告基因的登革病毒2型(DENV-2)復(fù)制子的穩(wěn)定細胞系，帶有Rluc和Neo雙報告基因的登革病毒復(fù)制子在該細胞系內(nèi)能穩(wěn)定復(fù)制，并高效表達Rluc和Neo。[0032]2、本發(fā)明細胞系中所含的復(fù)制子刪除了登革熱病毒2型基因組的大部分結(jié)構(gòu)蛋白基因，僅保留C蛋白N端的38個氨基酸和E蛋白N端的31個氨基酸，同時保留全部的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，不影響病毒基因組在細胞中的復(fù)制，但不能產(chǎn)生成熟的病毒顆粒，消除了病毒擴散的潛在危險。而Rluc編碼的蛋白便于檢測病毒基因組的復(fù)制，Neo基因編碼的蛋白可使宿主細胞具有抗G418藥物的能力。[0033]3、通過藥物抑制實驗，證明本發(fā)明制備的帶有Rluc和Neo雙報告基因的登革病毒2型(DENV-2)復(fù)制子的穩(wěn)定細胞系可以作為有效的藥物篩選平臺。與傳統(tǒng)的藥物篩選方法相比，該細胞系不僅有著明顯的靈敏度和高效率，還可以用于高通量篩選作用靶點為非結(jié)構(gòu)蛋白的藥物，可同時對多種藥物抗病毒效果進行快速檢測，縮短藥物研發(fā)周期，是研發(fā)特異性抗DENV病毒藥物的有效工具。[0034]4、帶有Rluc和Neo雙報告基因的登革病毒2型(DENV-2)復(fù)制子的穩(wěn)定細胞系用于研究相應(yīng)黃病毒復(fù)制調(diào)控機制具有明顯優(yōu)勢，可以在較長的研究周期內(nèi)對復(fù)制子復(fù)制和翻譯水平進行實時檢測；復(fù)制子轉(zhuǎn)染細胞后不能組裝并釋放病毒顆粒，可排除病毒組裝帶來的干擾；目的報告基因檢測、RT-PCRjPIFA等手段可實時監(jiān)測復(fù)制子復(fù)制和翻譯水平的改變。[0035]5、帶有Rluc和Neo雙報告基因的登革病毒2型(DENV-2)復(fù)制子的BHK-21細胞，登革熱病毒2型復(fù)制子在該細胞中能很好的復(fù)制，連續(xù)傳代47代復(fù)制子在細胞中穩(wěn)定存在，通過檢測該細胞中Rluc的表達間接衡量登革熱病毒基因組的復(fù)制水平，可代替繁瑣，費時，費力的RT-PCR體外檢測，該模型可作為高通量篩選抗登革熱病毒藥物的新的細胞模型?！緦＠綀D】【附圖說明】[0036]圖1為一種帶有Rluc和Neo雙報告基因的登革病毒2型(DENV-2)復(fù)制子DENV2-TSV-Rluc2A-Rep-3NTR-1RES-Neo構(gòu)建示意圖。[0037]圖2為DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo復(fù)制子及DENV2_TSV-Rluc2A-R印復(fù)制子電轉(zhuǎn)BHK-21細胞不同時間點的Rluc信號和免疫熒光示意圖。[0038]A:DENV2-TSV-Rluc2A-Rep-3NTR-1RES-Neo和DENV2_TSV-Rluc2A-R印不同時間點的Rluc信號比較；[0039]B:DENV2-TSV-Rluc2A-Rep-3NTR-1RES-Neo和DENV2_TSV-Rluc2A-R印不同時間點的免疫熒光比較.[0040]圖3為一種含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21的篩選過程，穩(wěn)定細胞系穩(wěn)定性和Rluc信號檢測,及免疫熒光示意圖。[0041]A:含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21篩選過程；[0042]B:含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21不同代次Rluc基因穩(wěn)定性檢測；[0043]C:含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21不同代次Rluc信號值；[0044]D:含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21免疫熒光示意圖。[0045]圖4為不同濃度NITD008抑制作用下含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21的Rluc信號示意圖。【具體實施方式】[0046]本實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以下實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。[0047]實施例1:[0048]帶有熒光素酶(Rluc)和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neo)的pACYC-TSV-Rluc2A_R印-3NTR-1RES-Neo復(fù)制子質(zhì)粒構(gòu)建,其步驟是:[0049](I)利用融合PCR技術(shù)，在帶有Rluc的DENV2復(fù)制子pACYC-DENV2_TSV-Rluc2A-ReP(來源于:Developmentandcharacterizationofastableluciferasedenguevirusforhigh-throughputscreening[J].Antiviralresearch,2011，91(I):11-19.)中構(gòu)建C9250G突變，創(chuàng)造Nhel酶切位點。[0050]①利用XhoI和CalI雙酶切pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-R印質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物膠回收后得到DENV2-TSV-F基因片段；以DENV2-TSV-F基因片段為模板，利用primer-Age1-F(AAAACCGGTTGAATGCATTG)和primer-Nhe1-R(GGGGCTCACAGCTAGCATAGTTTTTTCCG)PCR擴增DENV2-TSV-Age1-NheI基因片段。PCR反應(yīng)體系為:5XPSbuffer(TaKaRa):10μ1，dNTP:2μI,引物primer-Age1-F(IOuM)(AAAACCGGTTGAATGCATTG):1μI,引物primer-Nhe1-R(IOuM)(GGGGCTCACAGCTAGCATAGTTTTTTCCG):1μI,PrimeSTARHS酶(TaKaRa):0.5μ1，模板TA-DENV2-TSV-F(15ng):1μI,ddH20:34.5μ1，總體系50μ1.擴增條件為:94°C2min，94°C10s,60°C15s，72°C3min，72°CIOmin,16°Clmin，30個循環(huán)。使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)分別回收DNA片段,使用ThermoScientificNanoDrop2000測定DNA的濃度。[0051]②利用primer-Nhe1-F(AAACTATGCTAGCTGTGAGCCCCGTCCAAG)和primer-Cla1-R(ACAATCGATAGACATGATAAGATAC)PCR擴增DENV2-TSV-Nhe1-ClaI基因片段。PCR反應(yīng)體系為:5XPSbuffer(TaKaRa):10μI,dNTP:2yI,引物primer-Nhe1-F(IOuM)(AAACTATGCTAGCTGTGAGCCCCGTCCAAG):1μI,引物primer-Cla1-R(IOuM)(ACAATCGATAGACATGATAAGATAC):1μI,PrimeSTARHS酶(TaKaRa):0.5μ1，模板TA-DENV2_TSV_F(15ng):1μI,ddH20:34.5μ1，總體系50μ1.擴增條件為:94°C2min,94°C10s，60。。15s,72°Clmin,72°CIOmin,16°Clmin，30個循環(huán)。使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)分別回收DNA片段,使用ThermoScientificNanoDrop2000測定DNA的濃度。[0052]③利用primer-Age1-F(AAAACCGGTTGAATGCATTG)和primer-Cla1-R(ACMTCGATAGACATGATMGATAOdfAge1-NheI基因片段和Nhe1-ClaI基因片段融合為DENV2-TSV-Age1-ClaI基因片段；PCR反應(yīng)體系為:5XPSbuffer(TaKaRa):10μI,dNTP:4yI,引物primer-Age1-F(IOuM)(AAAACCGGTTGAATGCATTG):2μI,引物primer-Cla1-R(IOuM)(ACAATCGATAGACATGATAAGATAC):2μ1，PrimeSTARHS酶(TaKaRa):0.5μI,模板DENV2-TSV-Age1-NheI基因片段:25ng,模板DENV2-TSV_Nhe1-ClaI基因片段:50ng，ddH20:補足50μI。擴增條件為:98°C2min，98°C15s,55°C15s,72°C3.5min,72°C10min,16°Clmin，30個循環(huán)。使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)分別回收DNA片段，使用ThermoScientificNanoDrop2000測定DNA的濃度。[0053](2)利用限制性內(nèi)切酶AgeI和ClaI雙酶切得到的DENV2_TSV_Age1-ClaI基因片段，使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)分別回收DNA片段，將其連接于經(jīng)相同酶雙酶切的DENV2-TSV-F基因片段中，命名為DENV2-TSV-F-NheI；[0054](3)利用引物Nhe1-1RES-neo-F(TATGCTAGCCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCC)和Nhe1-1RES-Neo-R(ACAGCTAGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG)，以pLVX-1RES-Neo[購于美國Clontech公司]為模板，PCR擴增Nhe1-1RES-Neo-NheI基因片段；PCR反應(yīng)體系為:5XPSbuffer(TaKaRa):10μI,dNTP:2μI,引物Nhe1-1RES-neo-F(IOuM)(TATGCTAGCCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCC):1μ1，引物Nhe1-1RES-Neo-R(IOuM)(ACAGCTAGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG):1μI,primeSTAR酶(TaKaRa):0.5μ1，模板pLVX-1RES-Neo(15ng):1μI,ddH20:34.5μ1，總體系50μ1.擴增條件為:94°C2min,94°CIOs,60°C15s，72°C1.5min,72°CIOmin,16°Clmin，30個循環(huán)。NheI酶切后連接于DENV2-TSV-F-NheI，測序正確后命名為DENV2_TSV-F_Nhe1-1RES-Neo；[0055](4)XhoI和ClaI雙酶切DENV2_TSV-F_Nhe1-1RES-Neo重組質(zhì)粒，將得到的含IRSE-Neo的基因的片段連接于經(jīng)相同酶雙酶切的pACYC-DENV2_TSV-Rluc2A-R印質(zhì)粒中，命名為pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo(圖1)，其序列為SEQIDN0.1所示。[0056]實施例2:[0057]pACYC-TSV-Rluc2A-Rep-3NTR-1RES-Neo復(fù)制子質(zhì)粒成功拯救出具有復(fù)制能力，并能高效表達熒光素酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的復(fù)制子，其步驟是:[0058](1)pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-Rep-3NTR-1RES-NeoRNA的制備:[0059]①質(zhì)粒的線性化和酚氯仿抽提:各取10μg質(zhì)粒pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo和質(zhì)粒pACYC-DENV2_TSV-Rluc2A-R印，用ClaI酶切，37°C酶切兩小時，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切完全后，向酶切產(chǎn)物中加入100μI飽和酚(購自國藥集團化學(xué)試劑公司)，振蕩混勻，17000g離心5min，吸取上層液體于新的離心管中，并向原離心管中加入100μI無菌水振蕩混勻，17000g離心5min;吸取上層液體與上一步所得液體合并(總體積約200μ1)，加入200μI氯仿(購自國藥集團化學(xué)試劑公司)混勻，17000g離心5min;吸取上層液體于無菌進口離心管管中(約150~200μ1)，加入十分之一體積的pH5.2,3mol/l醋酸鈉(購自國藥集團化學(xué)試劑公司)和2.5倍體積無水乙醇(購自國藥集團化學(xué)試劑公司)混勻，-20°C放置30min,17000g離心5min;吸棄上清,加入Iml70%乙醇洗漆，17000g離心5min,吸棄上清；室溫放置15min,最后加入11μI無RNAase的水溶解,使用ThermoScientificNanoDrop2000(前面已述)測定DNA的濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，于-20V保存?zhèn)溆?。[0060]②RNA的體外轉(zhuǎn)錄:各取2.5μg酚氯仿抽提的pACYC-DENV2_TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo和質(zhì)粒pACYC-DENV2_TSV-Rluc2A-R印線性化產(chǎn)物為模板，按照T7mMESSAGEmMACHINEkit(購自美國Ambion公司)說明書的要求將其體外轉(zhuǎn)錄為RNA,使用ThermoScientificNanoDrop2000(前面已述)測定RNA的濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，檢測體外所得RNA均有明顯主帶后，于-80°C保存?zhèn)溆?。[0061](2)轉(zhuǎn)染后Rluc活性檢測:[0062]將5μg體外轉(zhuǎn)錄的pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo和pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-RepRNA采用電轉(zhuǎn)的方法分別轉(zhuǎn)入0.8mlBHK-21細胞(含有8XIO6個細胞)，轉(zhuǎn)染后接種2XIO5該細胞于6孔板中，在轉(zhuǎn)染后2、6、12、24、36、48、60、72和96h時，吸棄上清培養(yǎng)基，每孔加入ImlPBS洗一遍后，吸棄孔中PBS，并分別加入200μI細胞裂解液處理細胞，分別混勻孔中的細胞裂解物，取20μI于白色96孔板中，并加入50μI的底物腔腸素(coelenterazine),按照LuciferaseAssaySystem(購于Promega公司)說明書的要求使用多功能酶標(biāo)儀(購于德國Thermo公司)檢測Rluc的活性(圖2A)。從圖2A中可知，轉(zhuǎn)染了DENV2-TSV-Rluc2A-R印RNA的BHK-21細胞，Rluc信號值升高的時間點早于含有DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo的BHK-21細胞，達到的高峰值前者也高于后者，表明DENV2-TSV-Rluc2A-R印-3NTR-1RES-Neo轉(zhuǎn)染后在BHK-21中的復(fù)制速度慢于DENV2-TSV-Rluc2A-R印。具體熒光素酶活性值如下表所示:[0063]【權(quán)利要求】1.一種帶有雙報告基因的登革病毒2型復(fù)制子的細胞系，其特征在于:含有登革病毒復(fù)制子的倉鼠腎傳代細胞系BHK-21BHK-21/pACYC-TSV-Rluc2A-Rep-3NTR-1RES-Neo，CCTCCN0:C2011124。2.權(quán)利要求1所述的細胞系含有的帶有雙報告基因的登革病毒2型的復(fù)制子。3.權(quán)利要求1所述細胞系在抗病毒藥物篩選中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的病毒為登革病毒。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的登革病毒為登革病毒2型?！疚臋n編號】C12Q1/68GK103805567SQ201410104868【公開日】2014年5月21日申請日期:2014年3月20日優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日【發(fā)明者】張波,商寶娣,張盼濤,鄧成林,袁志明,史佩勇申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所